神经纤维瘤病II型发病机理的研究现况

左文静 纵亮 杨仕明

1中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科（北京100853）

2南开大学（天津300071）

1 引言

神经纤维瘤病（Neurofibromatosis,NF），是由于神经嵴细胞分化异常所导致的多系统、多器官损害性疾病，是人类神经系统常见的遗传病之一[1-2]。NF虽然属于良性肿瘤，却往往因受累部位广泛、局部压迫症状明显而产生严重的临床后果，按表型及致病基因不同可分为I型（NF-1）和II型（NF-2）两类。与周围脊神经和皮肤病变为主的NF-1相比，NF-2主要累及中枢神经系统（听神经、脑膜、脊髓等），最明显的特征是双侧前庭神经鞘膜瘤（又称“听神经瘤”），同时可合并多发性脑膜瘤、室管膜瘤、其它脑神经及脊神经的神经鞘瘤，因此又称为中枢型神经髓鞘瘤病[3-4]。

神经纤维瘤病II型(neurofibromatosis type II，NF-2)是由于NF2基因突变导致的常染色体显性遗传病，即前庭神经（VIII）鞘膜瘤病。临床以双侧听神经瘤(vestibular schwannomas,VSs)为特征性表现，常伴多发的神经系统肿瘤及眼和皮肤等相关病变，即常合并有脑膜瘤、脊瘤瘤、星形细胞瘤以及脊旁后根神经鞘瘤，皮肤肿瘤以神经鞘瘤为主[5]。由于NF-2的病变部位特殊，对听觉功能影响严重，致残致死率较高，治疗手段有限，因此近年来受到了临床医生和研究人员的广泛关注。该病的群体发病率约1:33,000，平均发病年龄18-24岁[6]。其50%～78%为散发神经鞘瘤，60%～84%为散发脑膜瘤和37%散发室管膜瘤伴NF2基因失活[7-8]。

2 NF-2基因结构

NF2基因为定位于22q12.2染色体的抑癌基因，长约110 000bp，编码区cDNA长为 1785bp，包含17个外显子，其中仅前15个外显子有致病性突变。NF2基因mRNA经选择性剪切形成多种mRNA亚型，常见的为Ⅰ亚型(缺失外显子16)和Ⅱ亚型（包括全部外显子），两者约占90%，仅前者有抑制肿瘤生长作用；Ⅲ亚型（缺失外显子15、16）较少，且较Ⅰ亚型活性低[9]

NF2的基因产物(schwannomin/merlin)——Merlin蛋白包含595个氨基酸，与红细胞膜蛋白4.1超家族(ezrinradixin-moesin，ERM)蛋白高度同源，是一种细胞骨架连接蛋白，包括FERM域（N-末端，1-8号外显子）、连接区（9号外显子）、α-螺旋区（10-13号外显子）和C-末端，与细胞膜稳定性、细胞间黏聚及细胞与胞外基质的黏附关系密切[10-11]。与ERM类不同的是，MerlinC-末端缺少保守的与肌动蛋白结合的基序，同时突变往往导致C-末端功能异常[12-13]。

Merlin蛋白作为细胞骨架和跨膜蛋白的连接者，可以获取周围微环境中的信息而调控细胞分裂。细胞分裂的接触抑制对于维持组织稳态是不可或缺的，它的功能丧失是细胞转化的一个标志，并且会导致肿瘤细胞的分裂、迁移和侵袭。现有研究认为[14]，钙黏素的参与或者有丝分裂信号的丧失可激活PAK信号通路，进一步导致Merlin闭合结构增多而引起Merlin活化。在细胞高密度时，Merlin处于超磷酸化状态而抑制细胞生长;在细胞低密度时，Merlin磷酸化并与ezrin，Moesin及CD44形成复合物，促进细胞生长，而Merlin的失活导致细胞间接触抑制丧失并加速了细胞周期进程[15]。CD44通过与Merlin相互作用调节接触抑制-依赖性细胞生长，被认为是控制细胞生长停滞和增殖的节点。它是一种跨膜透明质酸受体，涉及细胞的侵袭、黏附和迁移[16]。

3 NF-2突变相关致病机制

研究发现，多种分子以配体形式与Merlin相互作用，通过调节细胞之间的接触（如增加细胞-细胞接触及细胞-基质间的黏附功能）和细胞内信号转导（如通过改变生长因子产生和发挥作用的微环境而防止异常的细胞周期产生）等途径调节细胞的生长速度和运动能力，从而发挥肿瘤抑制功能。根据功能不同，这些配体大致分为3类：第1类主要是细胞表面糖蛋白，如细胞黏附分子CD44和β1整合素[17]。第2类是与肌动蛋白细胞骨架有关的分子，其功能和调节细胞运动有关[18]。第3类Merlin配体参与调节细胞内外离子的转运，如Na+-H+离子交换调节因子(sodium hydrogen exchange regulatory factor,hNE-RF)和细胞胞饮等功能，包括肝细胞生长调节的酪氨酸激酶的底物(hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate,HRS)[19]。

最新研究发现，NF2基因突变可在多种细胞中发生，常出现除生殖细胞突变外同时存在体细胞突变的嵌合现象（mosaicism），家族单一病例中即有25%-30%为嵌合体[14,15]。此外，NF2基因相关突变类型多种多样，基因型-表型的对应关系异常复杂，其中约有50%的NF-2患者的NF2突变遗传自患病父母，另有50%患者为自身新发突变（de novo mutations）[20]。值得注意的是某个特定突变由亲代向子代传递过程中，往往存在形式各异的不同临床表型。因此，归纳来说，NF2突变大致可分生殖细胞突变和体细胞突变两类，相比之下，前者以无义突变和剪切位点突变为主,后者以移码突变为主。80%典型NF2病例是由生殖细胞NF2基因突变所致。生殖细胞突变包括单一点突变、多外显子点突变、整个基因缺失和染色体重组。最常见的突变类型为单一点突变，常导致Merlin蛋白C-末端缺失或改变[21]。而单一突变在NF2基因中呈不均匀分布，2、6、8和11号外显子每个碱基对突变率为0.069%～0.118%，而9号外显子仅为0.013%；突变率最高的位点是第169、586、784和1021碱基的CpG二核苷酸，CGA均经C-T转化为TGA形成无义突变。9和14号外显子的突变均非无义突变。聚集在2和3号外显子中不到10%的非截短突变可影响剪切作用，提示2和3号外显子对Merlin或其肿瘤抑制活性非常重要[22]。

现有进行NF2基因检测的方法，主要有：Evans等采用联合全部外显子直接序列分析和多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA），突变检测的敏感率可提高到91%～95%[23]。Sestini等采用半自动高效液相色谱法(denaturinghigh performance liquid chromatography，DHPLC)联合MLPA检测患者点突变及筛查基因重排情况，同时评估了用于筛查外显子确定点突变的高分辨溶解曲线分析方法(high-resolution melting analysis，HRMA)。基于HRMA方法的简单、快速、低成本、高灵敏性及与DHPLC的高度一致性，Sestini等推荐HRMA作为NF-2患者的诊断性筛查技术[24]。NF2基因检测技术除上述外还有毛细管电泳-单链构象多态性分析、单链构象多态和异源双链核酸分子分析、微阵列-比较基因组杂交技术及荧光原位杂交技术等。

Merlin作为肿瘤抑制蛋白的作用机制尚不明确[25]。以上所述现象说明了NF-2相关神经纤维瘤病发病机制异常复杂且存在高度异质性，而这些令研究人员一筹莫展的科学问题背后所对应的已知分子机制仅为“冰山一角”。因此，获得不同突变位点的转基因动物模型，并借此进行比照研究，是深入解析NF-2相关神经纤维瘤病发病机理的先决条件。

4 NF-2已建立的动物模型

目前各国的学者们通过努力建立了大量携带不同nf2位点突变的动物模型，用来研究NF-2的发病机理。例如Jeffrey R.Gehlhausen及其同事们报道了条件纯合子nf2基因敲除小鼠在雪旺细胞中以Cre介导的nf2外显子2切除，表现为2型神经纤维瘤病的特点。他们建立的Postn-Cre;Nf2flox/flox肿瘤模型可能在将来为NF-2相关神经鞘瘤的机制和治疗研究提供了一种新的工具[26]。Marco Giovannini及其同事们将nf2和p53单独杂交，产生nf2；p53双杂合子携带易位突变，然后再与野生型小鼠交配，得到了Nf 2/-；p5 3/-cis小鼠[27]。Jeremie Vitte及其同事们建立了不同组织和发育阶段的条件基因敲除小鼠，携带SMARCB 1和/或NF2缺失，早期神经嵴的SMARCB 1缺失是启动具有典型组织学特征和人横纹肌样肿瘤典型的组织学特征和分子特征的脑神经和脑膜的肿瘤发生的必要条件，除了在wschn细胞系的发育后期诱导SMARCB 1缺失外，还需要在wschn细胞株中诱导SMARCB 1缺失。双等位基因nf2基因失活，则建立了第一只小鼠神经鞘瘤模型，在神经鞘瘤病患者中发现了相同的潜在基因突变[28]。Andrea I.McClatchey及其同事们从3个原始目标ES细胞克隆到野生型C57BL/6或129/SV动物培育嵌合体，获得了99只Nf2/-和23个野生型F1(C57BL/6×129/SV)同胞和37只近交系129/SV Nf2/-动物；还通过杂交Nf2/-F1小鼠产生了45只Nf2/-F2动物来研究NF-2的发病机理[29]。

目前已报道大量携带不同nf2位点突变的小鼠动物模型，然而这些来源于小型的啮齿类动物模型目前仍然存在诸多缺陷。例如nf2半合子小鼠不发生神经鞘瘤，主要是骨肉瘤6；与人NF-2患者相比，Nf2/-小鼠在生命后期（10-30个月）发展出多种恶性肿瘤，这与人NF-2患者的疾病发展进程不同等等。而其它动物的NF-2模型暂未见报道。

5 展望

（1）生物信息学的快速发展使系统性研究疾病机制成为可能。近年来，随着二代测序及质谱技术的飞速发展，使新型高通量组学分析越来越多的应用于各种人类疾病的机制研究[30]。这种以数据为导向,大规模、系统化的研究模式,使科研人员能够从基因组、转录组、蛋白质组及翻译后修饰组等不同水平对疾病展开全方位、多层次、跨维度的系统性机制研究成为可能。

由此我们相信，目前高通量组学及大数据分析手段能够为深度解析NF-2相关听神经髓鞘瘤病理机制提供必要的技术保障。借助上述技术对临床病理组织进行深度解析将大大提高获得潜在治疗靶点的可能性。然而由于现有临床病理样本取材过程中，几乎无法取得正常人体听神经组织标本，这项不足严重制约了此类疾病相关分子关机制的研究进展。因此获得与人类神经纤维瘤病症状一致（或相似）的实验动物模型是该领域研究工作的当务之急。

（2）建立大型实验动物模型的需求。尽管目前大量NF-2相关肿瘤疾病研究仍以小鼠为主要实验动物模型，然而鉴于物种间亲缘关系差距较大，许多NF2基因缺陷导致的人类疾病表型（如神经纤维瘤病）在小鼠模型中无法复制，这意味着nf2基因缺陷小鼠不是精确代表人类NF-2疾病表型的实验动物模型，因此其无法胜任后续将开展的听神经纤维瘤相关的高通量组学研究。因此目前急需在与人类亲缘关系更近，且适合用于疾病模型研究的常见物种中建立新型NF-2缺陷相关神经纤维瘤病实验模型动物[31]。

因此，未来的研究应在大型实验动物基因组中引入人NF2基因的同源性致病突变位点，这可能出现与人类相关位点突变相一致的疾病表型，如获成功有望填补目前暂无神经纤维瘤病实验动物模型的这项空白。不仅可以促进更好地研究NF2疾病的发病机理，还使得系统性机制研究成为可能。