内耳药物递送的研究进展

袁芳 亓卫东

复旦大学附属华山医院耳鼻咽喉头颈外科

内耳是位于颞骨岩部内高度分化、相对独立的感觉器官，包括耳蜗和前庭，分别管理听觉和平衡。先天性发育障碍、耳毒性药物、噪声暴露、免疫、外伤等多种因素均可致感觉上皮及螺旋神经节细胞功能受损，导致听觉以及平衡功能异常，出现听力下降、眩晕、耳鸣、耳闷等相应症状。目前临床上针对内耳损伤的保护措施主要有药物治疗、手术干预、助听器、物理治疗等方法[1]，其中药物治疗占主要地位，然而内耳特殊的解剖生理特点很大程度上限制了药物向特定组织细胞的分布。

1 内耳的解剖生理特点

内耳解剖位置隐蔽，体积小且结构精细，其内充满内、外淋巴液，Corti器、壶腹嵴、椭圆囊斑和球囊斑均浸没于内淋巴液中。人类内、外淋巴液含量分别只有约8μl和70μl[2]，给药时易引起容量和压力的改变并影响其功能；维持内淋巴液中高K+以及外淋巴液中高Na+状态对于听觉及平衡觉电生理至关重要，给药时需充分考虑离子浓度的稳定。内耳给药途径上存在多个屏障，这些结构在保持微环境稳定的同时，也影响了药物的吸收分布，其中血-迷路屏障在全身给药时可阻碍药物向内耳分布；圆窗膜、卵圆窗膜选择性透过的特点也在很大程度上限制了内耳局部给药的应用；耳蜗水管经由底回鼓阶连通蛛网膜下腔可影响内耳药物浓度并可能由此进入脑脊液。

寻找并建立一个安全高效的内耳药物递送方法是关键。目前对于内耳给药技术的研究主要集中在给药途径和药物载体两个方面。

2 内耳的给药途径

内耳存在多种屏障维持内耳微环境和功能的稳定，内耳通过这些结构与外界进行物质交换，理论上药物也可通过这些结构进入。但由于这些膜结构存在选择性作用，不同药物由于分子量大小、所带电荷、脂溶性有无等特性不同，药物的吸收代谢亦不同。内耳给药途径主要包括全身给药、经中耳鼓室给药和内耳内直接给药。

2.1 经全身给药

全身给药可经由口服、静脉注射或滴注、肌肉注射等方式完成。Fowler较早提出静脉注射链霉素可有效控制耳源性眩晕[3]以及后来出现的应用氨基糖苷类抗生素治疗梅尼埃病[4]。目前临床中仍广泛采用皮质类固醇激素治疗突发性感音神经性聋[5,6]和自身免疫性内耳疾病[7]。经全身给药治疗内耳疾病应用广泛，但存在靶向性差、局部药物浓度低且分布不均匀、全身副作用大等缺点。药物经过口服、静滴、肌肉注射等方式进入体内，经血循环到达到迷路后，血-迷路屏障的选择性作用阻碍了药物向内耳的弥散，使得局部药物浓度和药代动力学难以达到理想状态。Yang等在豚鼠经心内注射地塞米松0.5mg/ml/kg，1小时后外淋巴液中药物浓度为0.03mg/ml，而此时血浆中药物浓度为2.76mg/ml[8]。这表明要想使药物在内耳达到有效治疗浓度，体循环药物浓度需更高，有引起毒副作用的风险。但糖皮质激素长期全身用药可导致肥胖、高血压、糖尿病、血脂异常、低血钾、骨质疏松、消化性溃疡和免疫抑制等不良反应[9]。全身给药方式的弊端促进了新型给药方式的发展。

2.2 经中耳鼓室给药

经鼓室给药是将药物置于中耳鼓室，随后药物可通过圆窗膜进入内耳鼓阶外淋巴液中[10]，继而随着外淋巴液流动及扩散分布到内耳的各个部位。研究提示鼓室内药物也可通过卵圆窗吸收入前庭阶，再扩散分布到内耳的其他部位[11,12]。Schuknecht等人最早进行了中耳鼓室给予链霉素治疗梅尼埃病的尝试并获得成功[13]。近年来，相继研究发现卵圆窗在中耳给药时药物吸收方面拥有巨大潜力。为能在梅尼埃病的治疗中最大可能保存听力，King E.B.等人尝试庆大霉素单独经卵圆窗给药，实验发现337mg/ml庆大霉素3ul经镫骨足板给药和圆窗膜给药30分钟，1周后的结果显示前者前庭终器及听觉终器的毛细胞丢失较后者更加严重，且听性脑干诱发电位（ABRs）的阈值更高[12]。他们后续的实验中尝试减少药物剂量至50mg/ml庆大霉素1ul，仍未能获得满意的听力保护[14]。关于庆大霉素治疗梅尼埃病中的听力保护还需要更多的实验以获得最佳的给药剂量、次数及作用时间。中耳鼓室内给药主要有经鼓膜、乳突两种途径。正常情况下，鼓室仅通过咽鼓管与外部相通，所以经鼓膜、耳后乳突径路进入中耳鼓室均属有创操作。动物试验中鼓室内给药采取耳后径路较多，在但临床上因耳后乳突径路创伤大，实用性不强。目前有关鼓室内给药的研究多倾向于经鼓膜中耳内给药，主要有经鼓膜中耳内注射、微导管（μCat）置管和Silverstein MicroWick 3种方式。

2.2.1 耳后乳突径路给药

通过耳后皮肤切口并切除部分乳突暴露中耳鼓室，然后将药物置于鼓室[15]，该法因创伤较大，临床价值有限。

2.2.2 经鼓膜注射

是指经鼓膜直接将药物注射入中耳鼓室。Rauch就突发性聋患者口服强的松龙和鼓室内注射甲基强的松龙的疗效进行随机前瞻性试验，结果显示，治疗伊始给予口服或鼓室内注射皮质类固醇对于听力的保护均有效且差异无统计学意义，但口服给药患者出现血糖变化及胃肠道反应[16]。仅就规避副作用而言，局部给药有很大的优势。但因药物可从咽鼓管引流排出故需多次操作。这一问题促进了对多聚物凝胶、纳米载体等的研究，以期改变药代动力学，减少注射次数和防止并发症发生。

2.2.3 微导管（μCat）置管

μCat有两个管腔，分别用于药物灌注和液体回吸。μCat以直径1.5、2.0或2.5mm的球形末端紧靠圆窗龛，另一端置于外耳道可连接于不同的药物泵系统。Plontke通过该装置向鼓室内注射糖皮质激素治疗全身给药无效的突发性耳聋，结果显示患者听力得到较大改善[17-19]。但此法同时存在导管移位、堵塞、颗粒状组织增生等问题[18]。

2.2.4 Silverstein MicroWick

最先由Silverstein于1999年报道应用于内耳的一种给药装置，MicroWick是由多聚乙酸乙烯酯制成的长9mm直径为1mm的微芯。操作在局麻下进行，首先在耳内镜辅助下经鼓膜开窗并置通气管于开窗处，微芯由通气管插入中耳到达圆窗龛，患者可自行由外耳道滴入药物，药物由微芯吸收后传输到圆窗膜并被动扩散至内耳，整个操作过程侵入性小[20]。Silverstein MicroWick用于临床已有多年，Hill等人用MicroWick导入庆大霉素治疗梅尼埃病24个月后，76.8%的患者眩晕得到控制，证明Micro-Wick可作为内耳长期给药方式[21]。Suryanarayanan等人也做了类似实验，对经MicroWick鼓室持续给予庆大霉素治疗梅尼埃病患者以调查问卷形式进行回顾性研究，显示该病患者眩晕得到有效控制，症状明显好转[22]。Barriate等人经MicroWick注入甲基强的松龙可明显改善难治性突发性感音神经性聋患者的听力和言语分辨率[23]。虽然Silverstein MicroWick操作侵入性较小，但仍属于有创操作，有引起持续性鼓膜穿孔、中耳感染、组织增生等风险[24]。

无论何种方法，经中耳鼓室给药均主要由圆窗膜进入内耳。有研究表明约1/3的受试者因存在假膜、纤维化或脂肪栓引起圆窗膜阻塞，使得药物不能有效进入内耳，这也解释了为达临床疗效药物剂量个体差异较大的原因[25,26]，圆窗膜结构变异一定程度上限制了经鼓室内给药的发展。Kanzaki等人采用了一种新型耳内镜，它共有3个管道，包括1个光纤透镜和2个操作通道，一个通道用于给药，另一个通道用于吸除圆窗膜上的粘附物。相比以往的盲法操作，该方法能够进行可视化操作，可以准确将药物或给药装置置于圆窗膜表面，也可诊断外淋巴瘘进行相关治疗[27]。动物实验显示白蛋白微气泡超声技术可增加内耳对生物素标记的异硫氰酸盐的摄取利用，实验中将药物与白蛋白微气泡混合置于鼓室内，在超声作用下，通过增强圆窗膜的渗透性加强内耳对药物的吸收，且该操作不影响圆窗膜的完整性，听觉脑干诱发电位亦未提示有明显阈移[28]。这些技术在一定程度上解决了圆窗膜个体差异引起的实验条件和结果差异的问题。

2.3 内耳内直接给药

内耳的正常功能依赖于内耳微环境的稳态，即保持内外淋巴液的组成、pH值、渗透压、电位、液体量等的相对稳定，他们的轻微变化也会导致听敏降低，同时出现耳鸣和眩晕[29]。因此内耳内直接给药首先要考虑的是尽量减少对内耳微环境的干扰。

2.3.1 内耳开窗注射

关于内耳开窗直接给药的尝试较多，主要集中于开窗部位以及控释技术二方面。通过耳蜗底回鼓阶侧壁或者圆窗膜打孔将药物直接注入膜迷路的方法相对简单，但是底回鼓阶通过末端的耳蜗导水管与蛛网膜下腔相连，此处注射药物会经联合管进入脑脊液，造成药物浓度降低以及污染脑脊液可能，且多次注射损伤较大[30]。近期亦有研究表明可经蜗尖打孔注射药物入鼓阶，同时采用控释技术，以期达到药物浓度均匀分布及减少经联合管污染脑脊液可能[31,32]。Dai等人在恒河猴分别经镫骨底板激光打孔注射10μl PBS、圆窗膜造孔注射10μl及30μl PBS，观察治疗容积对内耳听觉和前庭功能的影响，结果显示3者对内耳的结构及功能无明显影响[33]。上述操作对技术要求较高，尚需完善。

2.3.2 修饰人工耳蜗电极给药

通过修饰人工耳蜗电极，可在人工耳蜗植入时建立给药途径。Krenzlin等人证实装载有包含药物的共聚物基质的电极可将药物持续释放至鼓阶[34]。目前人工耳蜗携带药物主要是地塞米松以减轻植入后炎症反应。依据对电极进行修饰共聚物的不同以及所携带的药物浓度不同，药物的释放可持续几个月到数年不等[34-36]。

2.3.3 微流体注射给药系统

该种方法的核心是通过耳蜗底回打孔向耳蜗外淋巴液中灌注药物[37]。微流体注射装置只有1个通道连接耳蜗鼓阶，既是注射导管也是抽吸导管，该系统允许短时间内（1-10s）重复小剂量（不超过0.2μl）向耳蜗注射药物，此时随着药物扩散和被外淋巴液稀释，药物浓度降低，回抽时抽取等量的含低浓度药物的液体，可以免除毛细胞因为外淋巴液容量和压力改变而致的损伤[38]。此法可有效避免向内耳注入高浓度药物可能导致的毒副作用。

3 内耳药物载体：可分为非基因载体和基因载体

3.1 非基因载体：主要有多聚物凝胶和纳米粒子载体。

3.1.1 多聚物凝胶

多聚物凝胶具有很高的粘滞度和粘弹性，可以吸附于中耳避免经由咽鼓管的快速排泄。由于多聚物凝胶可较长时间停留于中耳，故可减少给药次数，并使药物持续经圆窗膜向内耳扩散[39]。多聚物凝胶也可用于内耳内直接给药[35,36]，长期稳定释放可维持内耳内药物的有效浓度。但是在选择多聚物载体时需考虑其生物安全性、可装载并长期稳定释放药物的能力等问题。近年来研究主要集中在透明质酸、Poloxamer407、壳聚糖、硅树脂等[30]。

3.1.2 纳米粒子

纳米粒子分子量小，直径小于1μm[40]，能够装载药物到达靶组织器官，而且无毒副作用[30]。纳米粒子载体可以弥补药物溶解度低、易降解、半周期短等不足之处，但也存在易排泄、不易降解等缺点[30]。日前研究较多的是聚乳酸/羟基乙酸（PLGA）纳米粒子、超顺磁性Fe3O4纳米粒子、脂质纳米粒子、聚合物囊泡、阳离子聚合体、脂质体和纳米凝胶等[41]。PLGA可携带单一药物或者混合制剂通过圆窗膜进入外淋巴液中，且可明显提高封装药物的生物利用度[42]。纳米粒子载体不仅可经中耳鼓室局部给药作用于内耳[30]，也可经全身给药靶向定位到内耳[43]，亦可作为基因治疗中的载体将目的基因导入内耳[44-46]。但纳米粒子载体因易排出需多次注射。

多聚物凝胶载体和纳米载体的联合运用，可整合两者的优点，保证药物长期稳定持续向内耳扩散[47,48]。研究发现壳聚糖装载纳米颗粒作为混合载体在体外实验中能够长期稳定释放装载药物的纳米粒子，小鼠活体实验中装载药物的纳米粒子能完整地通过圆窗膜并分布至蜗管[47]。Naila等人用透明质酸脂质体凝胶装载磷酸地塞米松经豚鼠鼓膜注射入鼓室，利用透明质酸的高粘度和粘膜粘附特性可长期存在于中耳，而脂质体则持续缓慢释放磷酸地塞米松入内耳并转换成地塞米松活性形式，时间可长达30天，且对听阈无影响[48]。

3.2 基因载体

基因治疗作为最具前景的新兴技术，逐渐显现出在内耳疾病治疗中的潜力和优势。基因治疗主要包括功能基因表达和基因沉默两方面。同非基因药物治疗相似，要取得理想疗效，也需要安全高效的给药方法将目的基因导入内耳。

3.2.1 病毒载体

基因治疗中经典的载体是病毒载体，目前应用于内耳的病毒载体主要有腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒等，但病毒载体作为微生物存在免疫原性，有细胞毒性及引起炎症反应的可能，且转染效率及携带片段大小有一定的限制[49]，这促进了对非病毒载体的研究。

3.2.2 非病毒载体

目前非病毒载体主要包括纳米粒子基因载体，蛋白载体以及骨髓间充质干细胞等。不同于病毒载体，纳米粒子载体可携带不同大小的基因片段转染内耳[50]。Yoon等人采用纳米载体聚2-羟乙基L-天冬酰胺偶联硬脂胺及寡聚精氨酸（PHEA-g-C18-Arg8）成功携带绿色荧光蛋白基因转染内耳螺旋神经节及螺旋韧带[44]。Qi等构建了新型重组蛋白载体TAT双链RNA结合域（TAT-DRBDs），经动物实验证实TAT-DRBDs可携带Cy3标记的siRNA转染内耳Corti氏器、壶腹嵴、椭圆囊斑、球囊斑及螺旋神经节细胞，转染效率近100%，且未发现明显的形态学损伤[51]，以此可以敲除特定基因而做到基因沉默。唐朝颖等人通过构建羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽纳米载体（CTNs），证实CTNs可携带miR96成功转染耳蜗基底膜，且细胞毒性低于阳离子脂质体，但转染效率有待提高[52]。骨髓间充质干细胞（BMSCs）亦可作为基因载体，慢病毒载体能高效感染BMSCs，将重组慢病毒载体感染的BMSCs植入内耳，与重组慢病毒载体直接注入转染内耳组织相比较，因BMSCs在体内可向急性损伤部位迁移，使治疗基因靶向分布于病变部位[15]。

4 结语

由于血-迷路屏障的阻碍，药物较难通过血液循环弥散至内耳达到有效浓度并发挥作用。近年来的研究偏向于经鼓室或内耳内直接给药，许多新方法的采用和对既往技术的改善，其最终目的是使内耳药物递送更加安全高效。内耳药物治疗包括基因治疗的有效性首先取决于药物能否高效安全地运送到靶细胞，但目前尚未找到完美的解决方案。对于目前研究最多且较成熟的中耳鼓室内给药，各种多聚物凝胶、纳米粒子、病毒载体、蛋白载体、以及骨髓间充质干细胞等载体技术的进步将为药物安全高效递送提供可能。