自体血小板分离技术在心血管手术应用进展

王 惠（综述），黑飞龙（审校）

心血管手术创伤大、操作复杂，多数需要肝素抗凝和体外循环（cardiopulmonary bypass，CPB）支持，因此心血管手术往往伴随着围手术期失血和异体输血的高风险。在美国每年外科手术大约需要1 500万单位的浓缩红细胞，其中心脏手术的用血量占全国总用血量的10%～15%［1］。随着心血管外科手术量和复杂程度的增加，心血管手术的用血需求逐年增加，临床用血日益紧张。同时，患者在输注异体血制品时面临着感染肝炎、艾滋病等病毒的风险，在术中输注异体血制品越多，患者术后发生感染、急性肾功能衰竭和呼吸功能衰竭的机率越高［2］。Paone G等学者的研究显示CPB冠状动脉旁路移植患者围手术期即使只输注1到2个单位红细胞，仍会显著增加术后ICU停留时间和死亡率［3］。为了缓解血源紧缺的局面和改善患者预后，需要更安全积极有效的血液保护措施。自体血小板分离技术（autologous plateletpheresis，APP）是在患者肝素化之前将部分全血引出体外，分离为贫血小板血浆（platelet poor plasma，PPP）、富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）和浓缩红细胞（red blood cells，RBC），在体外循环结束鱼精蛋白中和肝素后，将PRP回输，避免体外循环对血小板的破坏来达到目的的一种血液保护技术。近年来，对这一技术的认识不断深入，包括血液破坏和保护的病理生理机制、技术操作的方式、时机的把握、临床效果的评价，都有了新的进步，现将这一领域的进展综述如下。

1 CPB引起血小板损伤的机制

CPB后有部分患者会出现持续性非外科性出血，这是多种因素造成凝血功能障碍，通常与血液稀释、凝血因子消耗、血小板数量和功能异常、纤维蛋白溶解亢进等因素相关。CPB不但会使血小板的数量下降，破坏血小板的形态，而且对血小板的黏附和聚集功能也有影响。CPB时间越长，血小板受损的程度越重［4－5］。

1．1 与非生物材料直接接触 在CPB过程中血液不可避免与CPB管道、插管、氧合器和滤器等非生物材料直接接触，血小板黏附于人工材料的表面，直接导致血液中的血小板数量减少。血小板黏附引起血小板变形、激活和功能受损。

1．2 气血直接接触 鼓泡式氧合器在CPB转流中使气体和血液直接接触产生气泡和涡流，产生高剪切力损伤血细胞。使用膜式氧合器的原理是通过带微孔的膜进行气血交换，避免了血液和气体的直接接触可减轻血小板损伤，鼓泡式氧合器已基本淘汰。

1．3 机械应力 血液经过机械泵、人工肺、微栓滤器、超滤器、插管和体外循环管路时，血流持续暴露于非生理学湍流流场和高剪切力区域，血细胞由于受到挤压、撞击、剪切和压差的原因，导致血小板形态受损、数量下降和功能降低。CPB过程中机械应力损伤红细胞，红细胞破坏后释放出的ADP可进一步激活血小板［6］。

1．4 肝素—鱼精蛋白复合体 肝素是心血管手术CPB过程中标准的抗凝药物，CPB结束后需要鱼精蛋白中和肝素的抗凝作用。肝素—鱼精蛋白复合体与血小板作用会导致血小板数量下降和血小板功能抑制，且CPB的时间越长，这种现象越明显。CPB中血小板数量在鱼精蛋白中和肝素后降至最低点，同时出现血小板功能下降［7］。

1．5 低温影响 机体体温降低可抑制血小板功能和凝血因子的活性，造成纤维蛋白溶解亢进。已有研究证实相比常温CPB，低温CPB会更大程度损伤血小板功能［8］。

1．6 系统炎症反应综合征 CPB过程中血液与非生物材料表面接触、缺血再灌注损伤和内毒素释放是系统炎症反应综合征（systemic inflammatory re⁃sponse syndrome，SIRS）的主要诱因。SIRS过程中，大量的炎性介质（如 C3a、C5－9等）释放，免疫系统激活，血小板激活［9］。

2 APP

2．1 APP的原理 APP是通过离心技术来分离全血的各种成分，目前临床上常用的装置是血细胞分离机和具有血小板分离功能的自体血液回收机。其主要部分由血液采集管道、离心杯、血液成分收集袋、抗凝药物和机器硬件等构成。APP的主要原理是血液中的各种血细胞成分存在比重差异，通过离心杯离心，将新鲜全血中各种血细胞成分分层。通过血小板分离程序，经过两次离心，分离出PRP、PPP和RBC［1］。PPP和RBC酌情回输给患者，PRP则被保留到鱼精蛋白中和肝素之后回输给患者。通过APP技术在CPB前把循环系统中部分血小板分离出一部分，在CPB开始前保存起来，避免CPB对血小板损伤，在CPB结束后的止血过程中回输给患者，让更多功能正常的血小板参与止血过程，达到血小板数量和功能双重保护的作用。

2．2 APP的方法 在麻醉诱导完成后全身肝素化前经中心静脉导管采集新鲜全血，中心静脉导管的体外开口端与机器的血液收集管道连接，枸橼酸葡萄糖溶液（acid citrate dextrose，ACD）抗凝。采集全血速度宜控制在每分钟50～100 ml。在首个分离循环完成到回输PPP和RBC之前，缺失的血容量只能通过晶体或胶体液弥补，这一过程可能会影响患者血流动力学的稳定，特别心功能较差的患者存在较大风险，需要监测更多的血流动力学指标（如中心静脉压、心脏指数、每搏量指数和全身血管助力指数），增加血管活性药物的使用［10］。每一轮分离程序完成分离出来的RBC和PPP需要根据患者的血容量、血红蛋白浓度和血流动力学情况选择即时输回或术后再回输给患者，保证患者血液正常的携氧能力及血液动力学稳定。有研究报道在回输含有枸橼酸盐抗凝剂的血制品过程中患者有可能出现枸橼酸盐反应相关的血流动力学不稳定，处理方法为给予葡萄糖酸钙，患者经对症处理症状均可改善，无相关的不良事件报道［1］。PRP分离提取操作过程中应严格无菌，制备的PRP在室温下轻震动保存以防血小板聚集。

3 PRP的血小板质量评价

APP的血液保护作用是否有效的关键在于分离所得的血小板数量和功能。分离保存的血小板数量越多，血小板功能越好，回输后越能在止血过程中发挥作用。由于机器的分离效率和从麻醉诱导到CPB开始之间的时间是相对有限的，分离大量血小板非常困难。目前对于达到明显血液保护效果需要采集新鲜全血的数量、分离血小板数量和功能尚无统一的意见。2011版美国胸外科医师学会（Society of Thoracic Surgeons，STS）和心血管麻醉医师学会（So⁃ciety of Cardiovascular Anesthesiologists，SCA）联合发布的血液保护临床实践指南中指出：PRP血小板含量至少为3×1011／L，或者不少于28%的循环血小板总量（血小板估计值＝估计血容量×术前血小板计数）才能提供理想的止血效果［1］。提取的PRP中的血小板功能是否有效是APP发挥血液保护功能的关键之一。如果术前患者服用抗血小板药物，将影响APP的效果。APP过程中，抗凝剂、血液采集和离心过程、储存条件和离体时间均会影响PRP的血小板质量。如果出现了血小板激活和死亡，会降低APP的有效性和安全性，所以评价PRP的血小板质量十分重要［11］。目前临床上常用的测定血小板质量的实验室方法有血小板变形程度测定、血小板黏附和聚集功能检测、流式细胞仪检测血小板的表面活化标志（PAC－1、CD62p和CD63等）和凋亡相关生物学变化（血小板线粒体跨膜电位的变化和磷脂酰丝氨酸的外翻表达）、蛋白免疫印迹和酶分析方法检测凋亡相关蛋白（半胱天冬酶3蛋白、抗凋亡蛋白Bcl－2 家族、凋亡蛋白 Bax 等）、血栓弹力图等［12］。这些方法既可用于分析心血管术后异常出血的原因，也可用于评价PRP的血小板功能是否正常。

4 APP的禁忌证和适应证

APP的禁忌证为血流动力学不稳定、血小板数量小于50×109／L、低蛋白血症（血清总蛋白低于60 g／L）、低血容量、凝血功能紊乱、感染、恶性肿瘤等［13］。APP的适应证目前尚有争议。有学者认为使用APP的适应证为：患者计划自体输血但是自身情况不允许、深低温停循环等复杂手术预计CPB时间长，出血风险大的患者［14－15］。 2011 年美国胸外科医师学会／美国心血管麻醉医师协会更新血液保护临床指南中指出如果收集到PRP中血小板足够，术中使用APP联合多种血液保护方法可以使高危患者获益，证据等级（class Ⅱa，level A）［1］。

5 APP在临床中的应用效果

随着现代输血技术的发展，APP逐渐应用于临床。国际微创心胸外科学会在2011年的血液保护共识中推荐使用APP（classⅡa，level A），认为其临床收益大于风险［16］。 Alberts M［17］等学者研究了 42例复杂的心胸外科手术（二次瓣膜置换加冠状动脉旁路移植术、深低温停循环血管手术及肺动脉血栓切除术）行APP的患者。PRP中血小板数量4．5（3．9～5．0）×1011／L，认为分离循环大于 2 次以上即可得到足够数量的血小板，减少术后异体血小板的使用量。Zhou SF［18］等学者对回顾性研究了685例深低温停循环下行升主动脉加全弓置换的患者中，有287例使用了APP，平均采血量15 ml／kg，术后较对照组输血量显著减少，降低了患者机械通气时间及ICU停留时间，减少了中风的发生率，但两组患者的住院死亡率无显著差异。Al－Rashidi F等［19］学者在18名行ROSS手术的成人患者使用了APP联合抑肽酶，对照组为19名未使用APP患者。自体血小板采集量占为全身循环血小板总数的25%，APP联合抑肽酶组患者总的输血量和需要输血的患者数都明显减少，显著降低围手术期的输血风险。Car⁃less PA等［20］学者的一项纳入了22项临床研究，包括1 589患者的荟萃分析，结果显示使用APP可减少择期成人手术围手术期输注异体RBC的患者比例。

但并非所有的研究都支持APP血液保护效果。Ford SM等［11］学者设计的一项前瞻性随机对照实验中，研究对象为54名冠状动脉旁路移植术和心脏瓣膜手术患者，两组患者在失血量、血制品输注和血小板计数上没有统计学差异。考虑原因是PRP组的血小板分离过程中血小板功能受损，影响了其血液保护的效果。van der Wal MT等［21］学者设计了一项包含104名患者的随机对照研究，手术方式为冠状动脉移植术或主动脉瓣置换，入选患者随机分为三组，第一组为CPB前放血组：术中未行分离血小板，CPB结束后回输全血。第二组APP组。第三组为对照组。第一组和第二组采集全血量约10 ml／kg，研究结果三组之间的围术期出血量、异体输血量和术后短期并发症并无显著性差异，作者分析其血液保护效果不明显的原因可能为术前采血量不足。

6 小结

综上所述，如果APP中收集到PRP中血小板数量和功能有保证，其在CPB的心血管手术中的血液保护效果是明确的。但是临床中应用APP技术的适应证及规范化操作流程尚待规范；且全血采集的过程有一定的风险，会影响到患者血流动力学的稳定，需要多种血流动力学监测设备和经验丰富的麻醉医师维持循环稳定，自体血小板分离设备和一次性耗材费用较高，分离血小板过程需要一定的时间，这些客观因素都影响了该项技术在临床上的广泛开展。如何最大程度的简化技术流程，降低技术难度，安全有效的应用APP技术，发挥其血液保护功能，使出血的高危患者获益，还需要进一步的探索和研究。