腺苷酸活化蛋白激酶在星形胶质细胞中的表达

师忠芳，徐立新，闫旭，董丽萍，袁芳

缺血性脑损伤的主要发生机制之一是能量代谢障碍，脑损伤后神经元利用葡萄糖产生三磷腺苷（adenosine triphosphate，ATP）能力减低，转而由星形胶质细胞为其提供乳酸作为能量底物[1]。有研究发现谷氨酸抑制星形胶质细胞线粒体氧化磷酸化作用，增加有氧糖酵解产生乳酸[2]。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphateactivated protein kinase，AMPK）是机体重要的能量感受器，AMPK激活后增加脂肪酸氧化和糖酵解[3]。大量研究显示缺血性脑损伤后AMPK被激活对神经元产生重要影响[4-6]，AMPK在星形胶质细胞中的作用研究较少。AMPK由不同亚基形成至少12种异源三聚体发挥其生物学功能，但是星形胶质细胞中以何种三聚体存在没有相关报道，本文拟利用培养的大鼠星形胶质细胞检测AMPK各亚基的表达情况探讨其在星形胶质细胞中的异源三聚体形式，为进一步深入研究AMPK在缺血性脑损伤的发生发展中的作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试剂 新生1 d的Wistar大鼠由中国医学科学院实验动物研究所[合格证号：SCSK（京）2005-0013]提供。实验过程按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀，并通过北京市神经外科研究所动物福利伦理审查（No.201401007）。最低必需培养基（minimum essential medium，MEM）（Gibco，Grand Island，NY，USA）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco）、胰蛋白酶（Merck，Darmstadt，Germany）、兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗体（Dako Glostrup，Denmark）、小鼠抗大鼠S100β多克隆抗体（Abcam，Cambridge，UK）、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG及Alexa Fluor 546标记山羊抗小鼠IgG二抗（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）、含4'6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）的荧光封片剂（中杉金桥）、EastepTM总核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取试剂盒（Promega，Madison，WI，USA）、反转录试剂盒（Promega）、2×EasyTaq聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司，GoldViewTM核酸染料及脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）marker购自北京赛百盛基因技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养 大鼠星形胶质细胞原代培养参考McCarthy的方法并加以改良[7]，无菌条件下，取新生1 d的Wistar乳鼠大脑皮层组织，将其切割成约1 mm3小块，吹打过滤后，接种于培养瓶中，置37℃、5%CO2培养箱，每3～4 d换液1次。原代培养约10 d后进行传代培养，经过大约10 d进行实验，GFAP和S100β免疫细胞荧光染色鉴定培养细胞纯度。

1.2.2 GFAP和S100β免疫荧光染色 根据师忠芳已发表文献的方法进行实验[7]，培养细胞丙酮固定30 min，正常羊血清封闭15 min，加入兔抗大鼠GFAP抗体（1∶50），小鼠抗大鼠S100β抗体（1∶100），阴性对照用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗，4℃过夜。Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG及Alexa Fluor 546标记山羊抗小鼠IgG（1∶100）避光孵育3 h，含DAPI的荧光封片剂封片，倒置荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.3 反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法检测AMPK各亚基表达 使用EastepTM总RNA提取试剂盒提取培养细胞总RNA，应用Promega公司反转录试剂盒合成cDNA，然后进行PCR实验。按照GenBank大鼠AMPK各亚基序列进行引物设计（表1），由深圳华大基因科技服务有限公司合成。PCR反应体系包括：2×EasyTaq PCR SuperMix 10 µl，上游引物、下游引物各1 µl，模板cDNA 1 µl，无核酸酶的水7 µl，反应体系共20 µl。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸25 s，40个循环，72℃终延伸7 min。阴性对照为只加入引物不加入模板。整个PCR反应过程在PCR系统（美国Life Technologies，型号Proflex）内完成。PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad，型号 ChemiDocTMMP）观察，拍照，分析AMPK各亚基的表达情况。该实验分别在3次独立培养的星形胶质细胞中进行。

表1 AMPK各亚基基因引物序列

2 结果

2.1 培养细胞形态观察及免疫荧光染色 倒置相差显微镜下观察星形胶质细胞呈大致均一的单层扁平细胞，具有短而粗大的细胞突起（图1）。GFAP和S100β细胞免疫荧光染色显示，培养细胞95%以上为免疫荧光染色阳性细胞（图2）。

2.2 RT-PCR实验 应用AMPK各亚基引物对细胞进行RT-PCR分析，凝胶电泳实验结果显示，阴性对照没有出现任何条带，在正常的星形胶质细胞中有AMPK α1、α2、β1、γ1及γ2亚基特异性目的条带的出现，没有AMPK β2亚基目的条带的出现。在出现的5种目的条带中，AMPK α1及γ2亚基目的条带表达量相对较少，AMPK α2、β1及γ1亚基目的条带表达量相对较多，结果提示AMPK α2、β1及γ1亚基构成的三聚体可能在星形胶质细胞能量代谢调节中发挥重要作用（图3）。

3 讨论

AMPK通过调节机体的能量代谢维持机体能量的供求平衡。星形胶质细胞对维持脑内能量代谢的稳定起重要作用。本实验通过RT-PCR的方法发现在培养的大鼠星形胶质细胞中AMPK α2、β1及γ1亚基表达相对较多，AMPK α1及γ2亚基表达相对较少，AMPK β2亚基没有表达，提示AMPK在星形胶质细胞中形成AMPK α2/β1/γ1三聚体。

星形胶质细胞是中枢神经系统内数量最多的一类细胞，在神经元的发育分化、修复再生、信号传递、突触形成和消除、免疫调免疫调节、学习记忆和呼吸调节等方面具有重要生物学作用[8]。近年来对星形胶质细胞在各种脑疾病中的作用研究越来越多，尤其是缺血性脑损伤后星形胶质细胞对神经元的保护作用受到研究者关注[9-10]，但由于在体研究干扰因素较多，不能区别是原发损伤还是继发损伤，利用体外培养星形胶质细胞进行疾病相关研究受到研究者重视。在本实验中，我们利用新生大鼠进行星形胶质细胞培养，并使用GFAP[11]和S100β[12]进行鉴定证实培养细胞95%以上为GFAP和S100β免疫荧光染色阳性的星形胶质细胞。

图1 倒置相差显微镜下观察培养大鼠星形胶质细胞（200×）

AMPK是1994年由Carling等[13]首次从细胞内提取并进行基因测序，当细胞内AMP水平升高或ATP/AMP比率下降时，AMPK即可被激活，进而促进糖原分解、糖酵解、脂肪酸氧化等分解代谢来增加ATP的生成，同时抑制糖原合成、脂肪酸合成等合成代谢，以减少ATP的消耗[14]。研究显示，缺血性脑损伤后AMPK活化可产生神经保护作用[5，7，15-16]，但也有研究证实，脑组织中的AMPK活化是有害的[5，17-18]。AMPK在缺血性脑损伤病理生理学过程中的作用机制有待于进一步研究。

AMPK是由α、β和γ亚基组成的一种异源三聚体，每种亚基又由不同基因编码形成不同的亚型。其中α亚基由2种基因编码形成α1和α2，β亚基同样由2种基因编码形成βl和β2，而γ亚基由3种基因编码形成γ1、γ2和γ3。α亚基作为催化亚基，β和γ亚基是调节亚基，γ亚基具有AMP结合位点，β亚基主要是起连接α和γ亚基的作用。现有研究显示AMPK各亚基的组织、细胞和亚细胞定位以及各亚型的不同组合方式决定了AMPK在不同组织内的生物学作用。有研究显示除AMPK γ3亚基外，其余各亚基均表达在脑内神经元[19]，本实验利用培养星形胶质细胞研究发现，星形胶质细胞中有较多AMPK α2、β1及γ1亚基表达，提示在星形胶质细胞中AMPK由α2、β1及γ1亚基形成三聚体在其能量代谢调节中起重要作用。Turnley等[19]利用免疫组化的方法在星形胶质细胞检测到AMPK α2亚基高表达，只在神经毡发现少量AMPK α1亚基表达，这与我们的结果是相似的。Li等[18]分别利用敲除小鼠AMPK α1和α2基因进行研究发现脑缺血再灌注损伤后只有AMPK α2基因的激活会加重脑组织损伤，AMPK α1基因无此作用。由以上结果推测，星形胶质细胞上的AMPK α2/β1/γ1三聚体极可能参与缺血性脑损伤的发生发展并在其中扮演重要角色。有文献报道，AMPK β1亚基主要表达在脑内，对正常脑的发育是必需的[20]，在本次实验中我们也检测到了星形胶质细胞上AMPK β1亚基的高表达，推测其可能参与脑的发育。在本次实验中我们没有检测到AMPK β2亚基的表达，有文献报道AMPK β2亚基主要表达在骨骼肌中[21]。在我们的研究中发现星形胶质细胞上AMPK γ1亚基高表达，Turnley等[19]在实验中通过免疫组化的方法没有在星形胶质细胞中检测到有AMPK γ1亚基的大量表达，这可能与实验条件及检测方法等有关。已有的研究显示AMPK γ3亚基仅在骨骼肌细胞中可见[22]。由以上结果推测在星形胶质细胞中由AMPK α2、β1及γ1亚基所形成的三聚体的功能可能比较复杂，其在脑内能量代谢障碍相关疾病特别是缺血性脑损伤中的作用有待进一步研究。

图2 培养大鼠星形胶质细胞GFAP和S100β免疫荧光染色（200×）

图3 AMPK各亚基表达在培养的大鼠星形胶质细胞

总之，本研究发现在体外培养大鼠星形胶质细胞中有大量AMPK α2、β1及γ1亚基表达，提示AMPK在星形胶质细胞形成AMPK α2/β1/γ1三聚体在星形胶质细胞能量代谢调节中发挥重要作用，为进一步探讨AMPK在缺血性脑损伤发生发展中的作用机制提供实验依据。

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【点睛】本研究发现在体外培养大鼠星形胶质细胞中有大量AMPK α2、β 1及γ 1亚基表达，提示AMPK在星形胶质细胞形成AMPK α2/β1/γ1三聚体在星形胶质细胞能量代谢调节中发挥重要作用。