非编码RNA在喉鳞状细胞癌中的研究进展*

·国家基金研究进展综述·

非编码RNA在喉鳞状细胞癌中的研究进展*

王馨 孙亚男

非编码RNA是一类不编码蛋白质的RNA，包括微小RNA（microRNA，miRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA，ln⁃cRNA）和环状RNA（circular RNA，circRNA）等。非编码RNA不仅在生物调节过程中扮演着重要角色，在包括肿瘤在内的多种疾病的发生机制中也起到了不可或缺的作用，其在喉癌的诊断、预后评估及治疗中同样具有重要的临床价值。喉鳞状细胞癌是喉癌中最常见的病理学类型，近年来发病率有明显增高的趋势，已严重危害人类健康及生存质量。本文总结了近年国内外研究，对miRNA、lncRNA和circRNA在喉癌发生发展的作用机制进行综述。

喉鳞状细胞癌 非编码RNA miRNA lncRNA circRNA

喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，随着吸烟率居高不下，人口老龄化、工业化加速所致环境污染日趋严重，喉癌的发病死亡状况不容乐观。在过去的40年，其5年生存率已呈下降趋势［1-2］。肿瘤的侵袭和转移是癌症患者死亡的重要原因，因此寻找特异、有效的喉癌的肿瘤标志物已成为喉癌研究的热点之一。近年来，非编码RNA在肿瘤的研究中取得了较大进展。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类短链非编码RNA，多在转录后水平调节靶基因的表达。大量研究表明，miRNA在喉癌中存在表达的上调或下调，从而发挥致癌或抑癌作用。长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是非编码RNA近年研究热点，特定lncRNA表达的改变与喉癌的发生、发展密切相关。环状RNA（circular RNA，cir⁃cRNA）是近年新发现的一类闭合环状RNA，具有结构稳定、丰度高等特征。这些非编码RNA可广泛参与生物体多种生理及病理过程，本文就非编码RNA在喉鳞癌中的研究进展进行综述。

1 非编码RNA的作用机制

1.1 miRNA的作用机制

miRNA是一类长度约18～22个核苷酸的内源性非编码RNA。miRNA的原始转录本长度约数千个核苷酸，其起始存在于细胞核中，经多种RNA酶作用后于细胞质中释放出成熟的miRNA。成熟miRNA 5′端的第2～8个核苷酸因可与靶mRNA结合形成种子配对而被称为“种子区”，其决定mRNA的特异性。成熟miRNA与靶mRNA若完全互补，则miRNA引导靶mRNA特异性切割；若不完全互补，则引起翻译抑制。miRNA通过与靶mRNA的3′非翻译区（3′UTR）完全或部分互补结合，导致mRNA降解或翻译受到抑制，从而在转录后水平负调控靶基因的表达［3-4］。自1993年发现miRNA以来，其与肿瘤就存在着紧密关联，目前miRNA已在肿瘤的发生、诊断、治疗等领域中取得了一系列研究进展［5］。

1.2 lncRNA的作用机制

lncRNA是一类转录本长度超过200 nt的长链非编码RNA，可通过表观遗传水平、转录及转录后水平调控基因的表达。相比miRNA互补结合靶基因mRNA序列，降解或抑制翻译过程的作用方式，ln⁃cRNA的作用机制则较为复杂及多样化。其作用机制包括：1）通过抑制RNA聚合酶Ⅱ活性、介导染色质重构以及组蛋白修饰，从而干扰下游基因的表达；2）与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切；3）与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，产生内源性内源性小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNA）；4）与特定蛋白质结合，改变其活性或细胞内分布；5）作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；6）作为miRNA、Piwi蛋白相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）的前体分子［6-7］。众多研究表明，lncRNA参与染色体沉默、转录后水平调节、基因组印记、组蛋白修饰、转录激活及干扰、核内蛋白转运等多种细胞过程，具有非常重要的生物学功能。截至目前，大量证据表明lncRNA与恶性肿瘤的发生发展存在密切关系，可通过多种调控方式影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、浸润和转移等生物学过程，从而为诊断及治疗肿瘤提供了一种新的方式［8］。

1.3 circRNA的作用机制

circRNA是近年来新发现的一种内源性非编码RNA［9］。在动物中，circRNA是一类丰富的、稳定的、普遍存在的非编码RNA，其通过外显子或内含子的环化将3‘和5’末端连接起来形成完整的共价环状结构。随着核糖核酸深度测序技术和生物信息学的发展，研究发现circRNA并非转录过程中的偶然错配，其在多种生物体内表达并发挥不同的生物学作用，尤其在肿瘤的形成及恶化过程中发挥着重要作用［10］。目前研究发现circRNA的主要功能主要有：1）充当内源性miRNA“海绵”；2）参与转录调控；3）参与蛋白质的翻译。circRNA是否还具有其他功能仍有待进一步研究。对于circRNA与肿瘤相关性的研究主要集中在circRNA充当内源性miRNA“海绵”的功能上。circRNA含有miRNA结合位点，可通过miR⁃NA应答元件（microRNA response element，MRE）竞争性结合相同的miRNA，解除或减轻miRNA对靶基因的抑制作用，调节靶基因的表达，这种作用机制称为竞争性内源性RNA（ceRNA）假说。“海绵”ceRNA均含有特异互补的结合位点MRE，均属于线性的RNA分子。由于“海绵”的结合位点是特定于miRNA的结合区域，这些RNA分子上表达这些结合区域，从而像“海绵”一样吸附特定类型的miRNA。因此，circRNA可以作为竞争性抑制剂（类似ceRNA）抑制miRNA，从而影响miRNA下游的靶miRNA产生生物作用［11］。

2 非编码RNA与喉鳞状细胞癌

2.1 miRNA与喉鳞状细胞癌

喉癌中异常表达的miRNA见表1。

表1 喉癌中异常表达的miRNATable 1 The abnormal miRNAs in laryngeal cancer

2.1.1 发挥原癌基因作用的miRNA miR-93属于miR-106-25基因簇，位于染色体的7q22.1。已有相关文献报道miR-93在多种恶性肿瘤中表达增高。Xiao等［12］应用荧光素酶技术验证miR-93可与细胞周期蛋白cyclin G2（CCNG2）的3′非编码区结合，同时发现CCNG2在喉鳞癌组织中的表达较癌旁组织显著降低，且miR-93的表达量与CCNG2呈负相关。另外有数据表明，miR-93表达上调能促进细胞分裂、降低细胞凋亡率，并促进细胞迁移和侵袭，miR-93表达下调可减弱这种致癌进程［13］。此研究结果表明，miR-93-CCNG2调控轴可参与肿瘤细胞的增殖和进展，为喉癌的治疗与预后提供了新的治疗靶点。miR-1290是最近研究发现的参与喉鳞状细胞癌发病机制的原癌基因，其致癌作用是通过使靶基因ITPR2和MAF表达下调实现的。Janiszewska等［14］结合生物信息学方法与功能分析设定ITPR2和MAF为miR-1290的靶基因，ITPR2和MAF在喉鳞癌中表达下调，发挥类似抑癌基因的作用，进而调控肿瘤细胞的凋亡。miR-221在喉癌患者血浆中表达上调。Yilmaz等［15］进一步通过定量PCR分析得出结论，miR-221在喉癌术后患者血浆中表达下调。另外，有研究发现miR-221通过靶向作用于肿瘤抑癌基因凋亡蛋白酶活化因子（Apaf-1）发挥作用［16］。本研究组研究发现miR-21通过调节Ras表达在喉癌中发挥类似原癌基因的作用，因此miR-21可作为喉癌基因治疗的重要靶点［17］。

2.1.2 发挥抑癌基因作用的miRNA miR-145在喉鳞癌组织中表达明显下调，其在抑制上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）中发挥至关重要的作用，miR-145可通过调控SOX2的表达参与喉鳞状细胞癌的发生、预后、转移、耐药及复发［18-19］。miR-375位于染色体的2q35，Guo等［20］发现miR-375与miR-206在喉癌中同样发挥类似抑癌基因的作用。miR-375是通过靶向调节转录因子KLF4从而抑制喉癌细胞增殖、转移及浸润，并诱导细胞凋亡，并且miR-375单方面的抑癌作用优于miR-375与miR-206两者的协同作用。Wang等［21］认为miR-375和miR-205两者通过协同调节AKT介导的EMT参与喉鳞状细胞癌的侵袭及转移。Cybula等［22］发现PIK3R1、HACE1、miR-139-3p以及miR-885-5p均为抑癌基因，其中miR-885-5p和PIK3R1为判断喉癌组织与正常黏膜组织的最佳标志物。

2.2 lncRNA与喉鳞状细胞癌 HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是研究最为深入的lncRNA之一。HOTAIR表达上调可以沉默特定抑癌基因并促进多种上皮系统来源的恶性肿瘤，如乳腺癌、结直肠癌等的发生及转移。在喉癌中，HORAIR的作用与其调节PTEN甲基化有关，因此HORAIR具有成为预测肿瘤进展、复发与转移的特殊分子标志物的潜能［23］。此外，本研究组发现喉鳞癌患者血清中HOTAIR的表达明显高于声带息肉患者，并且HOTAIR对于早期喉鳞癌的分级、临床分期及淋巴结转移有重要意义［24］。

H19在多种恶性肿瘤中发挥类似原癌基因的作用，如TGF-β在肿瘤中可诱导H19的表达及EMT的发生；H19作为miRNA海绵可通过激活Wnt信号通路促进EMT的发生；IGF2和H19印记丢失可参与肿瘤细胞的转移。本研究组发现H19在喉鳞癌细胞中表达上调，敲除H19可抑制喉鳞癌细胞增生、转移及侵袭，并且还发现H19是通过调节miR-148a-3p/DN⁃MT1轴参与喉鳞癌的发病机制［25］。另有研究表明，H19和miR-675表达水平与患者复发风险高度相关，敲除miR-675可降低喉鳞癌细胞的生存、迁移及侵袭能力。

长链非编码RNA核富集转录体1（nuclear para⁃speckle assembly transcript1,NEAT1）位于细胞核内一种称为旁斑（paraspeckle）的结构上，对该结构的形成和维持至关重要。NEAT1有两种异构体，分别是片段长度为3.7 kb的NEAT-1和片段长度为23kb的NEAT-2。本研究组发现NEAT1在喉鳞癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。敲低NEAT1则抑制喉鳞癌细胞的增生和侵袭。此外，本研究组还发现NEAT1可通过抑制miR-107的表达上调细胞周期蛋白依赖性激酶6（CDK6），这些研究结果表明NEAT1-miR-107-CDK6调控网络在喉鳞癌的发病机制中发挥促进作用［26］。

上述lncRNA均在喉鳞癌中发挥类似原癌基因的作用，类似抑癌基因作用的lncRNA在喉鳞癌中研究成果较少。本研究组发现lncRNA LET在喉癌细胞中表达明显下调，并且与临床分期、淋巴结转移等相关，在喉癌中发挥类似抑癌基因的作用［27］。

2.3 circRNA与喉鳞状细胞癌

目前关于circRNA与喉鳞状细胞癌的研究成果较少，现有两种circRNA被证明具有miRNA分子“海绵”功能：小脑退化相关蛋白1反义转录物（antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript，CDR1as）和性别决定区Y（sex-determining region Y，SRY）的反义转录物。circRNA ciRS-7（也称为CDR1as）是第一个被证实具有生物学效应的环状RNA，其含有多个串联的miR-7结合位点，因此可作为内源性的miRNA海绵抑制miR-7活性，参与基因转录后调控，所以ciRS-7有可能成为影响肿瘤细胞生长繁殖的重要调节因子［28-29］。另一条作为miRNA分子“海绵”的circRNA分子Sry也具有类似的特征和功能，含有miR-138的16个结合位点，通过竞争性结合miR-138，从而减弱miR-138的抑制作用。circRNA在疾病发生中的作用与机制研究，目前尚处于起步阶段［30］。

本研究组运用微阵列芯片技术分析了4对喉癌与癌旁组织中circRNA的表达情况，发现在喉癌组织中有302种circRNA表达上调，396种circRNA表达下调。本研究组进一步采用qRT-PCR方法检测得出hsa_circrna_100855为表达最显著上调的circRNA，hsa_circrna_104912为表达最显著下调的circRNA，并且两者均与喉癌的临床分级、颈部淋巴结转移及临床分期相关。研究数据表明，circRNA在喉癌的发生发展中发挥重要作用，因此有望成为喉癌早期诊断、治疗的理想生物标志物［31］。circRNA提供疾病机制的新思路，进一步研究circRNA在喉癌及其他癌症的功能机制是必不可少的。目前，越来越多的证据表明circRNA不仅与人类多种疾病密切联系，而且具有潜在的癌症诊断价值。

3 结语

综上所述，非编码RNA在喉癌的发生发展机制中发挥举足轻重的作用。目前有关喉癌的发生机制尚有大量关键问题有待阐明，而非编码RNA在其中的重要位置正逐渐成为研究的热点。此外，由于非编码RNA所具有的复杂结构及多样功能，其也很可能成为喉癌的诊断标记物及治疗靶点。因此，针对非编码RNA在肿瘤发生发展中作用的研究，以及将非编码RNA作为肿瘤诊疗标记物的新思路的探索具有相当重大的意义。未来针对非编码RNA的研究仍有广阔的前景，大量关键问题亟待进一步研究。

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Research progress on the role of non-coding RNAs in laryngeal squamous cell carcinoma

Xin WANG,Yanan SUN

Yanan SUN;E-mail:syn2767@126.com

Department of Otorhinolaryngology,Head and Neck Surgery,The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81272965,81772874)

Non-coding RNAs(ncRNAs)are a class of RNAs that do not encode proteins,including microRNAs(miRNAs),long non-coding RNAs(lncRNAs),and circular RNAs(circRNAs).The ncRNAs play a vital role not only in the regulation of biological processes but also in the development of a variety of diseases,including cancer.The ncRNAs show significant clinical value in the diagnosis,prognosis,and therapy of laryngeal cancer(LC).Laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC),the most common pathological type of LC,shows a recent trend in increasing incidences with a serious impact on human health and quality of life.In this paper,we summarize the research progress in recent years,and review the role of miRNAs,lncRNAs,and circRNAs in the development and progression of LC.

laryngeal squamous cell carcinoma,non-coding RNA,miRNA,lncRNA,circRNA

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.23.552

哈尔滨医科大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科（哈尔滨市150001）

*本文课题受国家自然科学基金（编号：81272965，81772874）资助

孙亚男 syn2767@126.com

（2017-05-19收稿）

（2017-12-04修回）

王馨 专业方向为喉癌基础研究及临床治疗。

E-mail：wangxin_0816@126.com