骨髓间充质干细胞对低转移肝癌细胞的影响*

禹名卉 王福利 李天然

·基础研究·

骨髓间充质干细胞对低转移肝癌细胞的影响*

禹名卉① 王福利② 李天然③

目的：观察人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）对植入低转移肝癌细胞动物模型生长的影响情况以及对转移潜能和凋亡趋势的影响。方法：制作人低转移肝癌细胞MHCC97-L动物模型，将动物随机分为模型实验组、对照组。实验组在接种肿瘤后第7 d开始尾静脉注射BMSCs 5×105/只，模型对照组相同时间尾静脉注射BMSCs培养液0.2 mL/只。于实验开始后每周用卡尺测一次皮下肿瘤体积，分别于肿瘤接种后第14d（2周）、21 d（3周）、28 d（4周）、35 d（5周）、42 d（6周）处死动物，完整剖取瘤块并称瘤重和体积，计算肿瘤抑制率。Real-time PCR法检测低转移肝癌动物模型标本中转移相关因子骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨唾液蛋白（bone salivary protein，BSP）、整合素（integrinαⅤ）基因以及凋亡相关因子Bcl-2、Bax、caspase3基因的表达。结果：骨髓间充质干细胞对肿瘤重量和体积的抑制作用在第3周具有统计学意义，实验组肿瘤重量显著低于对照组。骨髓间充质干细胞对肿瘤的抑制作用在第2、3、5、6周均具有统计学意义，实验组肿瘤体积显著低于对照组。实验组肿瘤转移相关因子表达均低于对照组，骨髓间充质干细胞干预后肿瘤促凋亡因子Bax、caspase3的表达呈升高趋势，抗凋亡因子Bcl-2的表达逐渐下降。结论：骨髓间充质干细胞对低转移肝癌细胞MHCC97-L的生长具有抑制作用，且第3周时抑制效果最好，随着时间的延长，肿瘤抑制率逐渐下降。

骨髓间充质干细胞 肝细胞癌 动物模型 转移 凋亡

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全世界最常见的恶性肿瘤之一，发病率有上升趋势［1］。HCC逐渐从肝硬化发展为肝衰竭，最终导致全身侵袭和转移，手术切除仍是目前最有效的治疗手段［23］。肝移植由于其昂贵的治疗成本以及供体器官的缺乏通常使该方法难以实施。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓衍生的非造血基质细胞［3］，是具有增殖能力和分化潜能的干细胞，能够分化成多种类型的细胞，可以产生肝细胞以及间质细胞。BMSCs容易获得，具有体外增殖的潜力并且不易丢失［4］。有研究表明BMSCs可以分泌一些肝细胞生长刺激因子促进肝细胞增殖［5］，包括人类生长因子HGF，血管生成因子VEGF，碱性成纤维细胞生长因子bFGF和许多白细胞介素。自体骨髓干细胞移植已被用于治疗失代偿性肝硬化，表明干细胞移植是一种新颖、安全有效的方法［3］。本实验的前期研究中同时采用高、低转移潜能肝细胞癌小鼠模型进行研究，研究结果显示低转移潜能肝癌细胞在BMSCs干预后OPN、β3、TGFβ1、αv表达下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）［6］。本文着重阐述BMSCs对低转移肝细胞癌的作用，以期弥补低转移肝细胞癌研究方面的空缺，为清楚阐明其作用机制提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 60只健康Balb/c裸鼠，体质量14～17 g，6周龄，雌雄各半，SPF级，由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供，实验动物质量合格证号SCXK（京）2009-0017。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

1.1.2 细胞株 人骨髓间充质干细胞，由广州赛业科技有限公司提供。流式细胞分析结果显示，BMSCs细胞表达CD29、CD44、CD105抗原均大于70%，表达CD45、CD14抗原均小于5%；进行成脂、成骨、成软骨诱导分化实验，分别经油红O染色、茜素红染色、阿利新蓝染色呈阳性，检测结果合格，符合试验标准。人低转移潜能肝癌细胞（MHCC97-L），由上海复旦大学肝癌研究所提供。

1.1.3 试剂 无菌0.9%氯化钠注射液，由北京双鹤药业股份有限公司生产；无水乙醇（Ethyl alcohol，absolute A.R.），由北京北化精细化学品有限责任公司生产。

1.1.4 仪器及设备 一次性使用注射器（美国BD公司）、奥豪斯电子精密天平（U.S.A OHAUS coep）、电子数显卡尺（桂林广陆数字测控股份有限公司）、日本NIKON倒置显微镜、Olympus/PM-6显微镜。

1.2 方法

1.2.1 动物处理方法 取经体外细胞培养已在裸鼠体内皮下接种生长良好的MHCC97-L肿瘤结节，无菌操作制成瘤细胞小块，用穿刺针接种于裸鼠腋窝皮下。将动物随机分为模型对照组、实验组，每组30只，称体重标号。实验组在接种肿瘤后第7 d开始尾静脉注射BMSCs（5×105/只）。模型对照组相同时间尾静脉注射BMSCs细胞培养液0.2 mL/只。裸鼠饲养在ⅣC-Ⅱ型（智能型）独立送风隔离笼具屏蔽系统辅以洁净层流柜的动物饲养室内，室温20～22℃，相对湿度40%～60%。裸鼠食用灭菌裸鼠饲料（SPF级，中国医学科学院实验动物研究所产品）。于实验开始后每周用卡尺测一次皮下肿瘤体积，分别于肿瘤接种后第14 d（2周）、21 d（3周）、28 d（4周）、35 d（5周）、42 d（6周）处死动物，完整剖取瘤块并称瘤重和体质量，计算肿瘤抑制率。

1.2.2 Real-time PCR法检测基因表达 Real-time PCR法检测低转移肝癌动物模型标本中转移相关因子OPN、BSP、IntegrinαⅤ以及凋亡相关因子Bcl-2、Bax、caspase3的表达。提取肿瘤标本RNA，进行浓度和纯度测定，符合要求后用RevertAid™M-MLV RT反应系统和Oligo（dT）合成cDNA，经特异性引物聚合酶链反应（PCR）扩增相应的cDNA。PCR条件：预变性95℃、5 min；变性 94℃、30 s，退火 58℃、30 s，延伸72℃、30 s，共30个循环，最后72℃、10 min。PCR产物电泳并经凝胶电泳处理系统扫描半定量分析。

1.2.3 Real-time PCR引物序列设计 引物序列来自Gen Bank数据库，由赛业（广州）生物科技公司合成，以人肌动蛋白β-Actin为内参照物，引物序列如下（表1）。

1.3 统计学分析

采用SPSS24.0统计软件进行统计学分析，所有数据以表示，组间比较采用t检验，相关分析采用Pearson积矩相关进行分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义，图中所有均数相关数据均采用标准差进行作图。

药效判定标准：

2 结果

实验组和对照组60只Balb/c裸鼠在造模过程中未出现死亡，数据记录完整，均可用于结果分析。

2.1 实验组与对照组肿瘤重量随时间变化比较分析

随着时间的延长，实验组与对照组肿瘤重量均呈现增长趋势，实验组肿瘤在第2、3、4、5、6周分别为 0.05±0.01、0.12±0.05、0.27±0.05、0.57±0.22、0.79±0.12，对照组分别为0.07±0.05、0.21±0.01、0.39±0.15、0.87±0.32、1.12±0.23（g），实验组肿瘤重量均低于对照组。统计学分析结果显示实验组与对照组肿瘤重量间的差异在第3周具有统计学意义（P=0.023），说明BMSCs在MHCC97-L生长的过程中表现出对其重量的抑制作用，并且抑制效果在第3周最为显著。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.2 肿瘤重量抑制率

根据上述肿瘤抑制率计算公式分别求得2、3、4、5、6周肿瘤重量抑制率随时间的变化情况，分别为28.57%、42.86%、30.77%、34.48%、29.46%。肿瘤重量抑制率在第3周达到峰值，随着时间的延长呈现下降趋势。

2.3 实验组与对照组肿瘤体积变化对比

随着时间的延长，实验组与对照组肿瘤体积均呈现增长趋势，实验组肿瘤体积在第2、3、4、5、6周分别为134.37±33.17、224.00±27.34、359.52±71.96、457.07±59.87、695.68±72.99，对照组分别为 222.36±43.06、377.43±63.75、560.53±115.15、699.20±19.88、986.47±91.49（mm3），实验组肿瘤体积始终小于对照组。统计学分析显示实验组与对照组肿瘤体积间的差异在第2、3、5、6周均具有统计学意义，P值分别为0.049、0.019、0.003、0.014。结果表明BMSCs表现出抑制肿瘤体积增长的作用，并且其抑制作用相对于重量抑制作用更为显著，持续时间更长。

2.4 肿瘤体积抑制率

肿瘤体积抑制率计算公式同上述肿瘤重量抑制率计算公式，分别求得2、3、4、5、6周肿瘤体积抑制率随时间的变化情况，分别为39.57%、40.65%、35.86%、34.63%、29.48%，肿瘤体积抑制率在第3周达到峰值，随着时间的延长呈现下降趋势。

2.5 肿瘤转移相关因子

RT-PCR检测结果显示，应用BMSCs干预后，肿瘤转移相关因子OPN、BSP、IntegrinαⅤ基因均为实验组低于对照组。统计学分析显示实验组与对照组间OPN 表达差异第2、3、4、5、6周P值分别为 0.422、0.382、0.142、0.066、0.060；实验组与对照组间BSP表达差异第 2、3、4、5、6周 P 值分别为 0.725、0.592、0.754、0.095、0.498；实验组与对照组间IntegrinαⅤ表达差异第 2、3、4、5、6周P值分别为 0.251、0.422、0.111、0.037、0.182。

2.6 肿瘤凋亡相关因子

RT-PCR检测结果显示，应用BMSCs干预后，肿瘤促凋亡相关因子Bax表达量在第2、3、4、5、6周分别为1.01±0.14，1.42±0.15，1.79±0.19，2.31±0.24，3.16±0.26；caspase3表达量分别为1.01±0.14，1.91±0.13，2.84±0.30，3.42±0.36，4.38±0.41；肿瘤抗凋亡相关因子Bcl-2表达量分别为1.00±0.11，0.86±0.12，0.60±0.06，0.41±0.03，0.26±0.05。肿瘤促凋亡相关因子Bax、caspase3均呈升高趋势，抗凋亡相关因子Bcl-2呈现下降趋势。

2.7 BMSCs干预后MHCC97-L动物模型肿瘤重量抑制率与转移及凋亡因子相关性分析

肿瘤重量抑制率与转移相关因子OPN进行相关分析得P=0.664，r=-0.267；肿瘤重量抑制率与转移相关因子BSP进行相关分析得P=0.540，r=-0.370；肿瘤重量抑制率与转移相关因子IntegrinαⅤ进行相关分析得P=0.516，r=-0.390。肿瘤重量抑制率与促凋亡相关因子Bax进行相关分析得P=0.712，r=-0.228；肿瘤重量抑制率与促凋亡相关因子caspase3进行相关分析得P=0.771，r=-0.180；肿瘤重量抑制率与抗凋亡因子Bcl-2进行相关分析得P=0.703，r=0.235。相关分析显示肿瘤重量抑制率与转移相关因子及凋亡相关因子无相关（P＞0.05，图1，2）。

2.8 BMSCs干预后MHCC97-L动物模型肿瘤体积抑制率与转移及凋亡因子相关性分析

肿瘤体积抑制率与转移相关因子OPN进行相关分析得P=0.269，r=0.616；肿瘤体积抑制率与转移相关因子BSP进行相关分析得P=0.533，r=0.376；肿瘤体积抑制率与转移相关因子IntegrinαⅤ进行相关分析得P=0.575，r=0.340。肿瘤体积抑制率与促凋亡相关因子Bax进行相关分析得P=0.010，r=-0.958；肿瘤体积抑制率与促凋亡相关因子caspase3进行相关分析得P=0.020，r=-0.934；肿瘤体积抑制率与抗凋亡相关因子Bcl-2进行相关分析得P=0.018，r=0.939。肿瘤体积抑制率与转移相关因子OPN、BSP、IntegrinαⅤ基因无相关（P＞0.05），与促凋亡相关因子Bax、caspase3及抗凋亡相关因子Bcl-2显著相关（P＜0.05）（图3，4）。

2.9 通过动物模型荧光成像观察BMSCs对MHCC97-L组织动物模型的干预作用

裸鼠皮下移植瘤模型进行荧光活体成像，预先打开活体成像仪20 min，将CCD相机冷却到-25℃以下。检测前使用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉裸鼠，按照组别顺序排列在活体成像仪拍摄仓内。使用激发光55 nm、发射光600 nm检测，曝光时间为10 s。同时在无激发光、发射光条件下，0.17 s拍摄，保存明场图像，荧光图像采用软件进行荧光强度分析。观察BMSCs与肝癌组织细胞融合图像发现BMSCs进入肿瘤组织。图中肿瘤组织细胞呈绿色，BMSCs细胞呈蓝色（图5）。

图1 肿瘤重量抑制率与转移因子相关性分析Figure 1 Correlation analysis of tumor weight inhibition rate and transfer factor

图2 肿瘤重量抑制率与凋亡因子相关性分析Figure 2 Correlation analysis of tumor weight inhibition rate and apoptosis factor

图3 肿瘤体积抑制率与转移因子相关性分析Figure 3 Correlation analysis of tumor volume inhibition rate and transfer factor

图4 肿瘤体积抑制率与凋亡因子相关性分析Figure 4 Correlation analysis of tumor volume inhibition rate and apoptosis factor

图5 BMSCs对肝癌（MHCC97-H）干预情况的病理切片荧光成像（fluorescence staining×200）Figure 5 Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on liver cancer(MHCC97-L)detected by fluorescence imaging(GFP label the tumor cells in green color,Ex,488 nm;Em,543 nm;DAPI mark the BMSCs in blue,Ex,358 nm;Em,461nm)(×200)

3 讨论

手术切除仍为HCC治疗的首选方法，但经手术切除治疗后的患者仍具有较高的术后复发率和转移率［7］。开辟新疗法成为了肝癌研究领域的重要任务。1974年首次从骨髓中分离获得BMSCs［8］，其具有对炎症和肿瘤发生位点的趋向性［9］，容易在体外培养进行繁殖并维持自我更新能力，集中向炎症组织和重塑组织迁移，具有较低的免疫原性和抗感染特性［10］，有助于器官和组织的快速修复，抑制免疫反应和抗肝纤维化。

BMSCs抑制MHCC97-L动物模型肿瘤增长的作用机制可能通过以下途径进行。OPN通过结合其受体整合素αvβ3促进肝癌细胞株HepG膜型CD44v6表达，而CD44v6与透明质酸结合促进肝癌转移，BMSCs通过抑制OPN与IntegrinαⅤ的表达来阻止肝癌的增长与转移。Bax与Bcl-2基因是目前在凋亡调控中研究较多的基因，Bax基因属于Bcl-2家族成员之一，Bcl-2蛋白表达减少或Bax蛋白表达增加时，促进细胞凋亡，而Bcl-2蛋白表达增加或Bax蛋白表达减少时，则抑制细胞凋亡［11］。关于Bax/Bcl-2的具体作用机制目前尚未完全明确［12］，可能通过调节促凋亡因子细胞色素C从线粒体的释放，进而影响caspase 3的激活而发挥其作用。caspase 3是caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，在细胞凋亡发生过程中扮演了关键角色。研究发现，caspase 3是肝星形细胞凋亡的重要途径之一［13］。caspase 3正常以酶原的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活，激活的cas⁃pase 3一方面通过水解特异性细胞蛋白直接导致凋亡，另一方面通过破坏DNA修复蛋白，如多聚ADP-核糖聚合酶，抑制DNA修复，协助凋亡的完成［14］。BMSCs通过增加Bax与caspase 3基因的表达，抑制Bcl-2基因的表达从而达到抑制肿瘤生长的作用。本研究中发现BMSCs干预后转移相关因子OPN、BSP、IntegrinαⅤ基因的表达均低于干预前，促凋亡相关因子Bax和caspase 3呈增高趋势，抗凋亡因子Bcl-2呈下降趋势。相关性分析显示肿瘤体积抑制率与凋亡相关因子显著相关，表明肿瘤生长过程中受凋亡因子影响明显，BMSCs可以通过调控转移相关因子的表达以及增加促凋亡相关因子，减少抗凋亡相关因子的表达而抑制肿瘤的生长。

研究发现BMSCs能够抑制肝细胞的炎症反应，减少肝细胞凋亡，逆转肝纤维化［15］，证实其具有修复受损肝组织的功能［16］。Abdelaziz等［17］发现BMSCs可以增加肝癌细胞的凋亡率。BMSCs可以减少转化生长因子的表达从而达到抑制肝脏纤维化的作用。BMSCs已被认为是治疗和预防HCC的分子疗法的特定靶标［18］。但也有研究已经证明BMSCs有助于乳腺癌和前列腺癌肿瘤干细胞的发展［19］。有研究表明BMSCs分泌白介素IL-6会促进肿瘤细胞的转移，IL-6是一种促炎细胞因子，报道显示其能够促进HCC［20］、胃癌［21］、乳腺癌［22］及肺癌［23］的转移，但目前IL-6对BMSCs影响的作用机制及作用效果尚待研究。本实验采用小鼠尾静脉注射的方法证实了BM⁃SCs对MHCC97-L的生长确有抑制作用，为BMSCs在HCC治疗中的应用提供了新证据。为明确BMSCs的抑瘤作用，以及使用BMSCs后肿瘤生长的实质性变化，尚需大量实验研究进行证实。对于BMSCs的未来研究可以尝试在小鼠原发性肝癌模型上进行，其能否广泛应用于临床肿瘤的治疗以及应用效果如何有待于进一步的研究。

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Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on low metastatic hepatocellular carcinoma cells

Minghui YU1,Fuli WANG2,Tianran LI3

Fuli WANG;E-mail:wangfuli304@126.com

1Jinzhou Medical University PLA General Hospital First Affiliated Hospital Graduate Training Base,Jinzhou 121001,China;2Medical Department,First Affiliated Hospital of PLA General Hospital,Beijing 100048,China;3Radiology Department,First Affiliated Hospital of PLA General Hospital,Beijing 100048,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81271607)and China Postdoctoral Foundation(No.2015M572810)

Objective:Toobservetheeffect of humanbonemarrowmesenchymal stemcells(BMSCs)onthegrowth,metastasis andapoptosis of hepatocarcinoma cells with low metastatic potential.Methods:Mouse model with low metastatic liver cancer cells were used.Mice were randomly divided into the model experimental group and the control group.In the experimental group,BMSCs(5×105)were injected into the tail vein of each mouse on the 7th day after inoculation with hepatocarcinoma cells.Mice in the control group were injected with the culture solution(0.2 mL per mouse)of BMSCs through the tail vein at the same time.The subcutaneous tumor volume was measured every week after the start of the experiment.Animals were sacrificed at day 14(2 weeks),day 21(3 weeks),day 28(4 weeks),day 35(5 weeks),and day 42(6 weeks)after inoculation of tumor cells.Complete dissection of the tumor blocks was done and the tumor inhibition rate was calculated by weight and volume.Real-time PCR was used to detect the expression of the osteopontin,bone salivary protein,and integrinαⅤgenes and the expression of Bcl-2,Bax,and caspase3 genes.Results:The inhibitory effect of BMSCs on tumor weight was statistically significant at 3 weeks.The tumor weight of the samples from the experimental group was significantly lower than that of the samples from control group.The inhibitory effect of BMSCs on tumor volume was statistically significant at 2,3,5,and 6 weeks.The tumor volume of the samples from the experimental group was significantly lower than that of the samples from the control group.The expression of pro-apoptotic factors,Bax and caspase3,in BMSCs was increased,and the expression of anti-apoptotic factor,Bcl-2,decreased gradually.Conclusion:BMSCs inhibited the growth of low metastatic hepatocellular carcinoma cells.The inhibition rate on tumor weight and volume was highest at the third week,and the tumor inhibition rate decreased gradually with time.

bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs),hepatocellular carcinoma(HCC),animal model,metastasis,apoptosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.23.184

①锦州医科大学解放军总医院第一附属医院研究生培养基地（辽宁省锦州市121001）；②解放军总医院第一附属医院医务部；③解放军总医院第一附属医院放射科

*本文课题受国家自然科学基金（编号：81271607）和中国博士后基金（编号：2015M572810）资助

王福利 wangfuli304@126.com

（2017-10-25收稿）

（2017-12-12修回）

（编辑：郑莉 校对：武斌）

禹名卉 专业方向为流行病与卫生统计学。E-mail：1213549627@qq.com