HOXA5基因转录起始点上游区域高甲基化水平与神经管缺陷的关系

张 继，田 甜，易德青，王琳琳，任爱国

北京大学生育健康研究所 卫生部生育健康重点实验室 北京大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，北京 100191

·论著·

HOXA5基因转录起始点上游区域高甲基化水平与神经管缺陷的关系

张 继，田 甜，易德青，王琳琳，任爱国

北京大学生育健康研究所 卫生部生育健康重点实验室 北京大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，北京 100191

目的探讨同源异形盒基因转录起始点(TSS)上游区域甲基化水平与神经管缺陷(NTDs)的关系。方法采用两阶段病例对照研究设计。第一阶段选择NTDs病例10例和对照8例作为研究对象，运用全基因组甲基化芯片检测其脑或脊髓DNA全基因组甲基化水平。针对HOXA5基因差异甲基化区域，在第二阶段扩大样本量(52例病例和23例对照)进行验证。提取脑或脊髓组织DNA，使用MassARRAY系统的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对HOXA5基因差异性甲基化区域进行验证。结果第一阶段在全基因组甲基化芯片结果中筛选出HOXA5基因TSS上游区27个CpG位点在病例组甲基化水平高于对照组(P<0.05)。第二阶段利用MassARRAY系统针对上述发现的差异区域进行检测，成功检测到10个可用于分析CpG位点。NTDs病例组及其亚型脊柱裂组和无脑畸形组中甲基化水平高于对照组的CpG位点数各有7、6和2个(P<0.005)。HOXA5 基因TSS上游区域病例组平均甲基化水平高于对照组[NTDs病例组：(31.3±13.9)%，对照组：(21.4±9.7)%]，调整胎儿性别和孕周后OR值为1.09(1.03～ 1.16)。结论HOXA5基因TSS上游区域高甲基化与胎儿神经管缺陷风险增加存在关联性。

神经管缺陷；甲基化；HOXA5基因；转录起始点

神经管缺陷(neural tube defects，NTDs)是一种由于胚胎发育早期神经管闭合不全导致的严重先天畸形，脊柱裂和无脑畸形是最常见的两种亚型[1]。NTDs病因复杂且发病机制尚不清楚，表观遗传学是近来最受关注的病因机制[2]。DNA甲基化是表观遗传学调控主要机制之一，通过在CpG位点的胞嘧啶引入甲基基团起到影响基因表达的作用，可以在不改变DNA序列的情况下造成稳定可遗传的表型改变。DNA甲基化受环境因素如营养、酒精、药物等的影响，被认为研究环境因素通过基因非核苷酸改变所致疾病之间关系的桥梁，有研究表明全基因组及某些关键基因甲基化水平的异常改变可能与NTDs的发生相关[3- 5]。同源异形盒基因(homeobox genes，HOX)是一组编码具有DNA序列特异性的转录因子的基因家族，在胚胎发育过程中对体轴前-后发育模式具有重要的调节作用，不同HOX基因的功能异常可导致体轴不同体节及部位的畸形[6]。本研究通过对NTDs病例病变处和对照组脑和脊髓DNA甲基化水平定量检测探讨HOXA5基因甲基化与NTDs的关系，为NTDs发生的分子机制研究提供线索。

对象和方法

对象选取2011至2014年在山西省5个县(太谷、平定、昔阳、寿阳和泽州)募集的引产NTDs胎儿作为病例，非先天畸形引产胎儿作为对照。病例的纳入标准为：(1)病例母亲为当地常住居民，且本次妊娠期间在本地居住；(2)汉族；(3)引产时间为孕12～27周；(4)不合并其他系统缺陷。对照组纳入标准为：(1)母亲为当地常住居民，且本次妊娠期间在本地居住；(2)汉族；(3)12～29孕周引产；(4)无缺陷。病例及对照组的排除标准为：排除母亲非汉族或当地常住居民，患有慢性疾病(如糖尿病、癫痫等)；患有严重妊娠并发症(如妊娠高血压、先兆子痫等)；最近1个月内服用药物(如抗癫痫药物)及合并其他先天缺陷胎儿样本。所有研究对象由经过培训的调查员使用结构式调查表，在引产前对病例和对照组胎儿母亲进行面对面询问调查。调查内容包括一般情况和胎儿产前诊断等信息。引产胎儿排出2 h内由病理医师按照尸体解剖操作规范，对引产胎儿进行尸体解剖，无菌条件下取材。取无脑胎儿的残存脑组织，脊柱裂胎儿病变处脊髓组织；对照胎儿的脑组织和脊髓组织。组织采集后，立即置-80℃冰箱保存。研究通过北京大学伦理委员会审查并获得研究对象知情同意。

方法本研究采用两阶段病例对照研究设计。第一阶段，采用小样本病例对照(10例病例和8例对照)进行全基因组甲基化检测，找出病例组和对照组差异的高甲基化CpG位点；然后，针对目标位点，采用更大的病例对照(取52例病例和23例对照)进行验证。最终确定与NTDs发病相关的差异化甲基化位点。

组织DNA提取：取-80℃低温保存的病例组和对照组脑和脊髓组织标本，使用DNA提取试剂盒(DNeasy Blood & Tissue Kit，QIGEN公司)，按照试剂盒标准流程提取病例组及对照组脑和脊髓组织DNA，由NanoDrop2000超分光光度计(ND2000，Thermo Scientific 公司) 测定浓度和纯度后置于-80℃保存。

第一阶段全基因组甲基化水平检测：将研究对象按纳入时间进行排序，选取最早纳入的10例病例，然后按照孕周(病例对照孕周相差不超过3周)和性别(病例对照性别相同)匹配对照，由于符合条件的对照样本不足，匹配比例为1∶ 1～2∶ 1，共匹配了8例对照样本，采用Illumina Infinium 450 k全基因组甲基化芯片检测其脑或脊髓组织全基因组DNA甲基化水平，具体方法参考文献[7]，实验由上海伯豪生物技术有限公司完成。

甲基化检测位点的预测和引物设计：使用EpiDesigner网站(Sequenom，http：//www.epidesigner.com)在第一阶段检测结果中有差异的区域进行第二阶段HOXA5基因CpG位点的预测以及PCR引物在线设计，综合考虑PCR产物长度、所覆盖CpG位点数及预实验可检测CpG位点数选择MassARRAY系统进行检测的PCR片段。正向引物：5’- aggaagagagGGGAAGGGGGAAA-GCCATTTAGCCA- 3’；反向引物：5’-cagtaatacgactcactatag-ggagaaggctAGCTGAGAGGCAAGTGGAGTCTCCC- 3’。

待测样本上机检测前的预处理：待测DNA使用亚硫酸盐转化试剂盒(EZ DNA Methylation kit，Zymo公司)进行重亚硫酸盐处理，将未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，甲基化胞嘧啶保持不变。处理后的DNA采用5 μl体系进行PCR扩增，反应条件为95℃ 4 min；45个循环，95℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 3 min。然后使用虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)孵育37℃ 20 min，85℃ 5 min纯化PCR产物，使用2.5%琼脂糖电泳确认PCR产物。使用T切割转录酶(T Cleavage Mix)37℃孵育3 h进行碱基特异性酶切反应(MassCLEAVE)。转录切割产物使用384孔微孔板进行脱盐处理。

HOXA5转录起始点上游CpG位点甲基化水平定量检测：对第一阶段发现的差异化CpG位点所在区域(共41个检测位点)采用MassARRAY系统，对52例病例和23例对照相同区域进行检测。使用Epi-Typer软件进行峰值检测，信号噪声计算和CpG位点的甲基化水平定量计算。亚硫酸盐转化后的未甲基化位点由于胞嘧啶转化为尿嘧啶，与未转化为尿嘧啶的甲基化位点之间产生相对分子质量16的差异，每个片段的相对分子质量水平可被MassARRAY系统以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行检测，通过检测PCR扩增和碱基特异性酶切后的大量DNA片段，Epi-Typer软件可通过对每个CpG位点所有检测片段的质量密度分析得到每个CpG位点甲基化片段的相对甲基化水平。

实验质量控制：设置完全甲基化阳性对照和零甲基化阴性对照，所有样本重复实验至少1次。

统计学处理利用PASS 11.0软件进行第二阶段样本量的计算，选择两样本均值等效性检验(差值)模块，参数设置为=0.05，1-=0.9，差异限值=±3.5，均数差值=0，标准差4.0，按照2∶ 1的病例对照匹配，所需最小样本量为44/22，结合现场样本募集情况，本研究实际检测分析的样本量为52/23。利用SPSS 20.0软件进行相关资料的统计学分析。使用χ2检验分析胎儿性别和孕周在病例组和对照组间的分布情况；使用成组t检验逐一分析全基因组甲基化检测和MassARRAY系统检测结果中各CpG位点甲基化水平在病例组和对照组间的差异是否具有统计学意义，第一阶段全基因组检测数据采用阳性发现错误率(positive false discovery rate，FDR)法进行多重校正，校正后检验水准要求P<0.05，第二阶段MassARRAY CpG位点检测数据采用Bonferroni法进行多重校正，校正后检验水准要求P<0.005；计算第二阶段研究MassARRAY系统检测中每个样本10个CpG位点平均甲基化水平作为该研究区域甲基化平均水平，使用非条件多因素Logistic回归，P<0.05为入选标准，P>0.1为剔除标准，控制胎儿性别和孕周，以OR值及其95%CI作为关联强度指标，计算检测区域平均甲基化水平与神经管缺陷之间关系。Bonferroni多重校正后P<0.005为差异有统计学意义，其余检验以P<0.05判断为差异有统计学意义。

结 果

人口学特征两阶段分别分析，病例组和对照组在胎儿性别和孕周的分布差异均无统计学意义(P>0.05)。第二阶段的相关信息见表1。

表 1 研究对象人口学特征[n(%)]Table 1 Demographic data of subjects [n(%)]

IlluminaInfinium450kDNA甲基化芯片检测结果使用Illumina Infinium 450 k DNA全基因组甲基化芯片检测最先纳入队列的10例神经管缺陷病例及8例对照脑或脊髓组织DNA甲基化水平。HOXA5转录起始点(transcription starts site，TSS)上游区共检测到41个CpG位点，其中95.1%(39/41)的CpG位点病例组甲基化水平高于对照组，经检验，有27个(65.9%)CpG位点在两组间差异具有统计学意义(P<0.05)；另外4.9%(2/41)的CpG位点病例组甲基化水平有低于对照组的趋势，但差异均无统计学意义(表2)。

表 2 NTDs病例对照的HOXA5基因TSS上游区域第一阶段全基因组甲基化差异Table 2 Genome-wide methylation difference of TSS upper stream region within HOXA5 gene between case and control groups in the first stage

NTDs：神经管畸形；TSS：转录起始点；a：采用阳性发现错误率法进行多重校正，显著性标准为P<0.05

NTDs：neural tube defects；TSS：transcription starts site；a：positive false discovery rate was used for multiple comparison test with a significance level ofP<0.05

MassARRAY系统甲基化定量检测结果根据第一阶段中甲基化芯片检测出的病例对照有差异的区域，设计MassARRAY系统检测位点，经Epidesigner网站设计该片段上共19个可检测位点，10个可分析CpG位点。由于两种方法学差异，MassARRAY系统设计位点中只有4个位点与450 k甲基化芯片检测位点完全相同，分别为CpG_3、CpG_6.7、CpG_10.11 和CpG_12(图1)。使用Bonferroni法进行多重校正，显著性标准为0.005(0.05/10)。结果显示，在总病例组中除CpG_8、CpG_9、CpG_10.11外，各位点甲基化水平均高于对照组，脊柱裂组中除CpG_4、CpG_5、CpG_9、CpG_13.14位点，其余各位点甲基化水平均高于对照组，无脑畸形组中CpG_4和CpG_13.14甲基化水平高于对照组(表3)。

HOXA5TSS上游区域第二阶段甲基化水平与NTDs的关系所有NTDs病例组、脊柱裂组、无脑畸形组平均甲基化水平高于对照组，平均甲基化水平分别为(31.27±13.85)%、(34.00±15.88)%、(27.84±10.08)%、(21.35±9.74)%，以是否为NTDs，是否为脊柱裂，是否为无脑畸形为因变量，平均甲基化水平作为自变量探究甲基化与NTDs及其亚型的危险度的关系，在调整了胎儿性别和孕周后，总病例组及其各亚型组中HOXA5 TSS上游区域的高甲基化均与胎儿NTDs的发生相关，平均甲基化水平每增加1%(OR=1.092，95%CI=1.028～ 1.160)，NTDs风险增加9%(OR=1.105，95%CI=1.035～ 1.181)，脊柱裂风险增加11%(OR=1.083，95%CI=1.009～ 1.162)，无脑畸形风险增加8%。

讨 论

NTDs的发生机制尚未研究清楚，本研究在表观遗传学领域探讨与神经管缺陷的发生风险相关的因素。本研究运用候选位点筛选及扩大样本量验证两阶段病例对照设计，通过对NTDs病例组和对照组脑/脊髓HOXA5基因TSS上游区域甲基化水平检测，发现HOXA5 TSS 上游区域平均甲基化水平每增加1%，NTDs发生风险增加9%(OR=1.092，95%CI=1.028～ 1.160)。

HOX基因是一组编码具有DNA序列特异性的转录因子的基因家族，其表达可调控胚胎发育和细胞的生长及分化，在哺乳动物中分为HOX A、B、C、D 4个基因簇，分别位于7、17、12、2号染色体上[8- 9]。其中横向同源基因组1- 4表达于脑组织，基因组5- 13表达于脊柱[10]。不同HOX基因的功能缺失可以造成不同位置脊柱变形、缺失及神经及其支配组织功能异常。

HOXA5基因位于7号染色体上A基因簇上。小鼠模型研究表明HOXA5基因表达于起源于中胚层的组织结构中，包括脊柱、自主神经节、肺、胃、肠和肾，是细胞分化和组织特异性发育的重要调控因子，对颈椎和胸椎上段的发育尤为重要[11- 12]。HOXA5基因是一种重要的肿瘤抑制因子，其表达水平降低与非小细胞性肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌的发生及其预后和肿瘤细胞的侵袭性相关[13- 15]，但是关于HOXA5基因在人类胚胎发育过程中的调控机制还少有研究。

UTR：非翻译区

UTR：untranslated region

图1甲基化芯片及MassARRAY系统检测CpG位点在HOXA5基因上的分布情况

Fig1Distribution of CpG sites on HOXA5 gene detected by methylation bead chip and MassARRAY platform

表 3 NTDs各组与对照组各CpG位点病例对照甲基化水平Table 3 Methylation level on CpG sites in NTDs groups and control group(±s，%)

t1、P1：所有NTDs组与对照组比较；t2、P2：脊柱裂组与对照组比较；t3、P3：无脑畸形组与对照组比较

t1，P1：total NTDs groupvs. control group；t2，P2：spinal bifida groupvs. control group；t3，P3：anencephaly groupvs. control group

本研究通过Illumina Infinium 450 k全基因组甲基化芯片检测和MassARRAY系统检测发现神经管缺陷病例组的HOXA5基因TSS上游区域甲基化水平高于对照组，脊柱裂亚型和无脑亚型组甲基化水平也高于对照组，HOXA5基因转录起始点上游80%～90% CpG位点也表现出病例组甲基化水平升高现象。提示HOXA5基因TSS上游区域的高甲基化可能与NTDs的发生相关。研究表明印记基因、转座子基因、平面细胞极化通路和细胞连接通路基因的异常甲基化与NTDs的发生相关[5，7，15- 16]，目前国内外尚无HOXA5基因甲基化改变与NTDs关系的报道，仅有1篇HOX甲基化与NTDs关系的研究，此研究表明HOXB7基因低甲基化与脊髓脊膜膨出畸形的发生相关[17]，然而此篇报道的样本来源于血液淋巴细胞，而非病变组织。

DNA甲基化会在胞嘧啶上引入一个甲基，这种改变会妨碍转录因子与DNA结合，同时会聚集转录抑制因子或组蛋白修饰复合物，促进异染色质形成，从而抑制基因的转录和表达[18- 19]。TSS附近区域的甲基化对基因表达的调控有重要作用[20]。小鼠模型研究表明HOXA5基因表达于神经管和上肢发生区域，其甲基化状态具有组织特异性且甲基化水平高的组织其表达水平显著降低[21- 22]。提示本研究中的HOXA5基因TSS上游区域的高甲基化可能通过抑制基因的转录和翻译，降低蛋白表达水平导致胎儿NTDs的发生。

本研究为探究NTDs的发生机制提供了可能的研究思路。HOXA5基因TSS上游区域高甲基化可能与NTDs的发生相关，通过对基因的表观遗传学干预可能有助于降低神经管缺陷的发生。基因的表观遗传学改变是一种复杂的调控过程，受到机体内外多种因素的影响，下一步需要针对HOXA5基因甲基化的功能研究进行进一步深入探讨。

[1] Greene ND，Copp AJ. Neural tube defects[J]. Annu Rev Neurosci，2014，37：221- 242.doi：10.1146/annurev-neuro- 062012- 170354.

[2] Copp AJ，Greene ND. Genetics and development of neural tube defects[J]. J Pathol，2010，220(2)：217- 230. doi：10.1002/path.2643.

[3] Wu L，Wang L，Shangguan S，et al. Altered methylation of IGF2 DMR0 is associated with neural tube defects[J]. Mol Cell Biochem，2013，380(1- 2)：33- 42. doi：10.1007/s11010- 013- 1655- 1.

[4] Chen X，Guo J，Lei Y，et al. Global DNA hypomethylation is associated with NTD-affected pregnancy：a case-control study[J]. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol，2010，88(7)：575- 581.doi：10.1002/bdra.20670.

[5] Shangguan S，Wang L，Chang S，et al. DNA methylation aberrations rather than polymorphisms of FZD3 gene increase the risk of spina bifida in a high-risk region for neural tube defects[J]. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol,2015，103(1)：37- 44.doi：10.1002/bdra.23285.

[6] Quinonez SC，Innis JW. Human HOX gene disorders[J]. Mol Genet Metab，2014，111(1)：4- 15.doi：10.1016/j.ymgme.2013.10.012.

[7] Wang L，Lin S，Zhang J，et al. Fetal DNA hypermethylation in tight junction pathway is associated with neural tube defects：a genome-wide DNA methylation analysis[J]. Epigenetics，2017，12(2)：157- 165.doi：10.1080/15592294.2016.1277298.

[8] Volcik KA，Blanton SH，Kruzel MC，et al. Testing for genetic associations in a spina bifida population：analysis of the HOX gene family and human candidate gene regions implicated by mouse models of neural tube defects[J]. Am J Med Genet，2002，110(3)：203- 207.doi：10.1002/ajmg.10435.

[9] Hutlet B，Theys N，Coste C，et al. Systematic expression analysis of Hox genes at adulthood reveals novel patterns in the central nervous system[J]. Brain Struct Funct，2016，221(3)：1223- 1243.doi：10.1007/s00429- 014- 0965- 8.

[10] Krieger KE，Abbott MA，Joksimovic M，et al. Transgenic mice ectopically expressing HOXA5 in the dorsal spinal cord show structural defects of the cervical spinal cord along with sensory and motor defects of the forelimb[J]. Brain Res Dev Brain Res，2004，150(2)：125- 139.doi：10.1016/j.devbrainres.2004.03.005.

[11] Dony C，Gruss P. Specific expression of the Hox 1.3 homeo box gene in murine embryonic structures originating from or induced by the mesoderm[J]. EMBO J，1987，6(10)：2965- 2975.

[12] Zhang ML，Nie FQ，Sun M，et al. HOXA5 indicates poor prognosis and suppresses cell proliferation by regulating p21 expression in non small cell lung cancer[J]. Tumour Biol，2015，36(5)：3521- 3531.doi：10.1007/s13277- 014- 2988- 4.

[13] Teo WW，Merino VF，Cho S，et al. HOXA5 determines cell fate transition and impedes tumor initiation and progression in breast cancer through regulation of E-cadherin and CD24[J]. Oncogene，2016，35(42)：5539- 5551.doi：10.1038/onc.2016.95.

[14] Tan SH，Barker N. Stemming colorectal cancer growth and metastasis：HOXA5 forces cancer stem cells to differentiate[J]. Cancer Cell，2015，28(6)：683- 685.doi：10.1016/j.ccell.2015.11.004.

[15] Wu L，Wang L，Shangguan S，et al. Altered methylation of IGF2 DMR0 is associated with neural tube defects[J]. Mol Cell Biochem,2013，380(1- 2)：33- 42.doi：10.1007/s11010- 013- 1655- 1.

[16] Wang L，Wang F，Guan J，et al. Relation between hypomethylation of long interspersed nucleotide elements and risk of neural tube defects[J]. Am J Clin Nutr，2010，91(5)：1359- 1367.doi：10.3945/ajcn.2009.28858.

[17] Rochtus A，Izzi B，Vangeel E，et al. DNA methylation analysis of homeobox genes implicates HOXB7 hypomethylation as risk factor for neural tube defects[J]. Epigenetics，2015，10(1)：92- 101.doi：10.1080/15592294.2014.998531.

[18] Jaenisch R，Bird A. Epigenetic regulation of gene expression：how the genome integrates intrinsic and environmental signals[J]. Nat Genet，2003，33(Suppl)：245- 254.doi：10.1038/ng1089.

[19] Robertson KD. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web[J]. Oncogene，2002，21(35)：5361- 5379.doi：10.1038/sj.onc.1205609.

[20] Jones PA. Functions of DNA methylation：islands，start sites，gene bodies and beyond[J]. Nat Rev Genet，2012，13(7)：484- 492.doi：10.1038/nrg3230.

[21] Hershko AY，Kafri T，Fainsod A，et al. Methylation of HoxA5 and HoxB5 and its relevance to expression during mouse development[J]. Gene，2003，302(1- 2)：65- 72.doi：10.1016/S0378111902010910.

[22] Joksimovic M，Jeannotte L，Tuggle CK. Dynamic expression of murine HOXA5 protein in the central nervous system[J]. Gene Expr Patterns，2005，5(6)：792- 800.doi：10.1016/j.modgep.2005.03.008.

RelationshipofMethylationwithinUpperStreamRegionofTranscriptionStartsSiteofHOXA5GenewithNeuralTubeDefects

ZHANG Ji，TIAN Tian，YI Deqing，WANG Linlin，REN Aiguo

Institute of Reproductive & Child Health，Ministry of Health Key Laboratory of Reproductive Health，Department of Epidemiology and Biostatistics，School of Public Health，Peking University，Beijing 100191，China

WANG Linlin Tel：010- 82802976，E-mail：linlinwang@bjmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the relationship between the methylation level of transcription starts site (TSS) upper stream of homeobox gene and the neural tube defects (NTDs).MethodsA case-control study of two stages was designed. In the first stage，10 cases and 8 controls were extracted，in whom Illumina Infinium Human Methylation 450 k genome-wide beadchip was used for the quantification of DNA methylation levels of brain and spinal tissue. In the second stage，differentially methylated region within HOXA5 gene was detected with a larger numbers of samples (52 cases and 23 controls). DNA of brain or spinal tissue was extracted，and Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry technique of MassARRAY platform was employed for the validation of differentially methylated region of HOXA5 gene.ResultsIn the first stage，27 CpG sites within TSS region of HOXA5 gene were found to be significantly hyper-methylated in case group compared to control group (P<0.05). In the second stage，a total of 10 CpG sites were analyzable within the differentially methylated region in the first stage. In the NTD case group，spinal bifida subgroup，and anencephaly subgroup，there were 7，6，and 2 sites with significantly higher methylation levels than that of control group (P<0.05). The average methylation level of TSS upper stream region within HOXA5 gene was higher in case group than control group [case group：(31.3±13.9)%，control group：(21.4±9.7)%]，and the odds ratio after adjusting gender of fetus and pregnant week was 1.09 (1.03- 1.16).ConclusionHypermethylation within TSS upper stream region of HOXA5 gene in fetus is associated with a higher risk of NTDs.

neural tube defects；methylation；HOXA5 gene；transcription starts site

ActaAcadMedSin，2017,39(6)：785-791

王琳琳 电话：010- 82802976，电子邮件：linlinwang@bjmu.edu.cn

国家自然科学基金(81472987)和北京自然科学基金(7162094)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (81472987)and the Beijing Natural Sciences Foundation (7162094)

R714.7

A

1000- 503X(2017)06- 0785- 07

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.06.009

2017- 03- 27)