同位素标记相对和绝对定量蛋白组学技术筛选儿童哮喘不同病情控制水平血清差异蛋白

刘姬艳，王 瑛，王远照，朱佳文，戴芳甸

1杭州师范大学 生命与环境科学学院，杭州 310036 2浙江中医药大学 附属第一医院儿科，杭州 310006

·论著·

同位素标记相对和绝对定量蛋白组学技术筛选儿童哮喘不同病情控制水平血清差异蛋白

刘姬艳1，王 瑛1，王远照2，朱佳文2，戴芳甸1

1杭州师范大学 生命与环境科学学院，杭州 3100362浙江中医药大学 附属第一医院儿科，杭州 310006

目的从整体蛋白水平研究不同控制水平儿童哮喘患者血清的差异性蛋白，为防治儿童哮喘提供依据。方法采用同位素标记相对和绝对定量标记结合二维液相色谱串联质谱定量蛋白组学技术筛选鉴定控制、部分控制和未控制儿童哮喘患者血清中差异表达蛋白，通过酶联免疫吸附测定法进行差异蛋白验证。结果共鉴定蛋白260种，筛选出不同控制水平儿童哮喘间两两比较均有差异的蛋白57种(变化倍数<0.8或变化倍数>1.2)，主要参与21种生物过程，主要具有8种分子功能类型，主要为17种细胞成分类型。酶联免疫吸附测定结果显示控制组的玻连蛋白含量(573.92±412.43)μg/ml高于未控制组的(382.27±238.64)μg/ml，差异有统计学意义(P=0.0399)。结论发现不同病情控制水平儿童哮喘患者血清中的差异性蛋白57种，这些差异蛋白可作为控制儿童哮喘的潜在生物学靶点。

儿童哮喘；定量蛋白组学；差异性蛋白；质谱

支气管哮喘(以下简称哮喘)是严重影响人类健康的慢性气道炎症性疾病，世界卫生组织估计全球由于哮喘丧失的伤残调整生命年数目每年达到1380万，约占总伤残调整生命年的1.8%[1]，全球哮喘患病率为2.62‰～4‰，其中5岁以下儿童的患病率达8.1‰～14‰[2]。哮喘作为儿童期常见的疾病，严重威胁儿童的身心健康和成长，及时有效地控制哮喘需要在临床上正确评估病情控制水平，才能选择合适的治疗方案。目前全球哮喘防治创议根据哮喘的控制程度将疾病严重度分为控制、部分控制和未控制[3- 4]。对于病情控制程度的评估主要基于临床症状的评估和肺功能等体格检查，但临床症状缺乏指标的金标准，而肺功能测定及支气管激发试验在幼龄儿童也并不可靠[5]，因此，目前临床对于儿童哮喘病情控制程度的评估尚缺乏更为精准和敏感的客观指标，以动态地监测疾病进展。本研究采用同位素标记相对和绝对定量标记结合二维液相色谱串联质谱技术 (isobaric tags for relative and absolute quantification，two-dimensional liquid chromatography，nanoelectrospray ionization and high-resolution tandem mass spectrometry using the hybrid quadrupole time-of-flight platform，iTRAQ- 2DLC-MS/MS)寻找鉴定不同控制水平儿童哮喘患者血清中差异表达的蛋白，试图从整体蛋白水平研究儿童哮喘不同病情控制水平的差异蛋白质，以获得能反映儿童哮喘病情控制水平的蛋白标志物。

对象和方法

对象选取2014年12月至2015年5月浙江中医药大学附属第一医院儿科就诊的哮喘儿童患者165例。哮喘诊断标准参照2014年全球哮喘防治创议[6]，不同病情控制水平的儿童哮喘组按全球哮喘防治创议方案评估病情控制水平[4]，分为控制组、部分控制组、未控制组。排除同时合并有除呼吸系统疾病以外的其他疾病诊断者；怀疑或已经诊断为活动性肺结核、肺脓肿等呼吸系统疾病者；近4周内患有呼吸道感染者，如咽炎、支气管炎、肺炎等患者。本研究经杭州师范大学附属医院伦理委员会批准，所选患者均签署知情同意书。

材料和仪器Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；iTRAQ标记试剂- 8 plex购自AB sciex公司；Spin-X 0.22 μm超滤管购自Corning公司；VIVACON 500 10K Da超滤管购自Sartorius公司，人玻连蛋白酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)试剂盒购自Raybiotech公司。人14 多重亲和去除系统色谱柱购自Agilent公司；LTQ Velos质谱仪购自Thermo公司；Q-Exactive 质谱仪购自Thermo公司；EASY色谱柱购自Thermo scientific公司；AKTA Purifier 100色谱购自GE Healthcare公司；超声波系统150- 96购自Biosafer公司；真空离心浓缩仪购自Eppendorf公司；小胶电泳系统Mini-PROTEAN Tetr购自BioRad公司，酶标仪购自Thermo公司。

样本收集抽取空腹患者周围静脉全血3 ml，4℃垂直放置1～2 h，使血液凝结，4000×g离心10 min，取血清储存于-80℃冰箱备用，避免反复冻融。

去除血清高丰度蛋白控制组、部分控制组和未控制组患者各15例的血清样本分别混合后使用人14多重亲和去除系统色谱柱去除各组血清中14种高丰度蛋白质，去除高丰度蛋白后的各组样本收集低丰度洗脱峰并合并，使用15 ml 5K Da超滤管进行超滤浓缩，并用25 mmol/L碳酸氢铵溶液进行置换，保持最后的总体积为40 μl。向各组样本中加入40 μl裂解液(4% 十二烷基硫酸钠，pH 8.0 100 mmol/L Tris HCl，100 mmol/L二硫苏糖醇)，充分混匀，100℃加热5 min，BCA法进行蛋白浓度定量后用聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，观察高丰度蛋白去除效果。

样品酶解3组样品各取300 μg，每份样品加入200 μl 蛋白水化液(8 mol/L尿素、150 mmol/L Tris-HCl pH 8.5)混匀，转移至30K Da超滤管中，14 000×g室温离心30 min，弃滤出液，重复3次。加入100 μl 碘乙酰胺(iodoacetamide，IAA)(50 mmol/L IAA 于尿素中)，于恒温混匀仪上600 r/min振荡混匀1 min，避光室温 300 r/min孵育30 min，14 000×g 室温离心 30 min。加入100 μl蛋白水化液室温14 000×g离心30 min，重复3次。加入100 μl 1/10溶解缓冲液(500 mmol/L 三乙基碳酸氢铵)，室温14 000×g离心30 min，重复3次。最后弃滤出液并加入40 μl 胰酶溶液(2 μg 胰酶置于40 μl 1/10 溶解缓冲液中)，放置恒温混匀仪上(300 r/min，18 h，37 ℃)。室温14 000×g离心30 min，收集滤出液，换新收集管，加入40 μl 25 mmol/L 1/10 溶解缓冲液，室温14 000×g离心30 min，取滤液，光密度280肽段定量。

iTRAQ试剂标记各组样品分别取约100 μg，按照AB公司iTRAQ Reagent- 8plex Multiplex Kit(AB SCIEX)试剂盒说明书进行标记，其中控制组报告标签为116、部分控制组报告标签为115、未控制组报告标签为114。将标记后的所有肽段分别混合，进行强阳离子交换色谱柱预分级。采用蛋白纯化系统AKTA Purifier 100 (GE Healthcare)，色谱柱：肽阳离子交换色谱柱Polysulfoethyl 4.6 mm×100 mm(5 μm，200Å) (PolyLCInc，Maryland，USA)；缓冲液：缓冲液A 为10 mmol/L KH2PO4pH 3.0，25%乙腈；缓冲液 B 为10 mmol/L KH2PO4pH 3.0，500 mmol/L KCl，25% 乙腈。每次强阳离子交换色谱柱分级后，收集穿流及洗脱片段约40份，根据色谱图合并成6份，冻干后C18 墨盒(Sigma)脱盐。

高效液相色谱-质谱联用每份分级样品采用纳升级液相色谱系统Easy nLC进行分离。缓冲液：A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为84%)。色谱柱以95%的A液平衡。样品由自动进样器上样到上样柱Thermo scientific EASY column(2 cm×100 μm 5 μm-C18)，再经分析柱Thermo scientific EASY column(75 μm×100 mm 3 μm-C18)分离，流速为250 nl/min。样品分离后用Obitrap-Elite质谱仪(Thermo Finnigan)进行质谱分析。分析时长：120 min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300～1800 m/z，一级质谱200 m/z处分辨率为70 000，自动增益控制值为3e6，一级离子注入时间为10 ms，扫描范围数目：1，动态排除：40.0 s。多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集10个碎片图谱，二级质谱激活类型为：HCD，隔离窗口：2 m/z，二级质谱在200 m/z处分辨率为17 500，二级离子注入时间为60 ms，碰撞能量归一：30 eV，填充率：0.1 %。

蛋白的鉴定与定量质谱分析原始数据为RAW文件，用软件Protein Discovery 1.4进行查库鉴定、定量和数据分析。本次使用数据库：Uniprot_human_20150723_147897.fasta(蛋白质序列共147 897条，下载日期为20150723)。搜库参数如下：单一同位素峰检测、胰酶酶切、允许最大两个漏切位点、固定修饰为半胱氨酸脲甲基化、可变修饰为蛋氨酸的氧化、iTRAQ- 8plex(K)、iTRAQ- 8plex(N-Term)。肽段价态为：2+、3+和4+，母离子误差：20 ppm，MS/MS 误差 0.1 Da。软件抽提肽段报告离子峰强度值信息，肽段定量结果为参考样品所在标签的信号强度值与内标的信号强度值的比值。蛋白质定量结果为鉴定肽段定量结果的中位数。检索结果使用Protein FDR≤0.01，PSM FDR≤0.01筛选过滤，变化倍数<0.8为下调蛋白，变化倍数>1.2为上调蛋白。

生物信息学分析利用DAVID(版本：6.8，http：//david.ncifcrf.gov)进行基因功能注释(gene ontology，GO)功能分析，对蛋白进行细胞成分、分子功能和生物过程的功能分类分析和功能富集分析。利用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库进行信号转导通路富集分析。利用检索相互作用基因/蛋白质的搜索工具软件(http：//string.embl.de/)进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。

ELISA法验证差异蛋白选取儿童哮喘不同控制水平间差异蛋白玻连蛋白，采用人玻连蛋白ELISA试剂检测控制组儿童哮喘患者、部分控制组儿童哮喘患者和未控制组儿童哮喘患者血清中玻连蛋白的含量。根据ELISA试剂盒(Raybiotech)说明书进行实验，血清稀释倍数为1∶ 10 000。

统计学处理采用GraphPad Prism 5软件进行单因素方差分析的Tukey post-hoc test法分析ELISA验证结果。

结 果

一般资料共收集165例儿童哮喘患者的血清样本，控制组共55例，其中男28例、女27例，年龄(5.72±1.78)岁；部分控制组共55例，其中男37例、女18例，年龄(5.76±1.79)岁；未控制组共55例，其中男36例，女19例，年龄(5.43±3.03)岁。3组间性别、年龄两两比较差异无统计学意义(控制组比部分控制组：年龄t=0.1175，P=0.9067；性别χ2=3.046，P=0.081；控制组比未控制组：年龄t=0.6120，P=0.5418；性别χ2=2.391，P=0.122；部分控制组比未控制组：年龄t=0.6954，P=0.4883；性别χ2=0.041，P=0.840)。

差异蛋白的筛选通过iTRAQ-2DLC-MS/MS分析，比较控制组、部分控制组、未控制组的iTRAQ报告离子强度比值被用于计算蛋白表达的倍数变化，获得这3组的总蛋白有260个，总肽段有1753个，唯一性肽段有1379个。对控制组、部分控制组、未控制组进行两两比较，选择变化倍数<0.8或>1.2的蛋白质，发现共有57个蛋白质在儿童哮喘不同病情控制水平组之间两两比较均有差异性表达(变化倍数<0.8或变化倍数>1.2)(表1)。

表 1 不同病情控制水平儿童哮喘血清iTRAQ结合二维液相色谱串联质谱技术分析差异蛋白Table 1 Differentially expressed proteins quantified by iTRAQ，two-dimensional liquid chromatography，nanoelectrospray ionization，and high-resolution tandem mass spectrometry using the hybrid quadrupole time-of-flight platform analysis

续表1

续表1

iTRAQ:同位素标记相对和绝对定量标记

iTRAQ：isobaric tags for relative and absolute quantification

差异蛋白的功能聚类和通路富集分析利用GO分析，分别从57个差异蛋白涉及的生物过程、分子功能及细胞成分对差异蛋白进行分析。本实验筛选的差异蛋白中的53个差异蛋白参与诸多的生物过程，其中包括21个重要的生物过程，主要涉及代谢过程、定位、响应刺激、免疫系统过程、信号等；根据分子功能注释，差异蛋白中的52个蛋白主要具有8种分子功能，包括转运活性、结合功能、催化活性、分子功能调节器等；通过细胞成分分析，差异蛋白中的53个蛋白主要定位在17种不同的细胞结构，包括胞外区域、细胞器、细胞膜、细胞连接等(图1A)。利用通路富集 KEGG分析显示，57个差异蛋白中27个蛋白主要涉及44个通路，其中参与补体和凝血级联反应通路的差异蛋白有15个(图1B)，通过蛋白网络分析显示差异蛋白具有紧密的功能联系(图1C)。

APOD：载脂蛋白D；APCS：血清淀粉样P成分；APOE：载脂蛋白E；CA2：碳酸酐酶2；LYVE1：淋巴管内皮透明质酸受体1；HPX：血红素结合蛋白；MBL2：甘露糖结合蛋白C；CD5L：CD抗原样蛋白；GC：维生素D结合蛋白；SERPINA3：1-抗糜蛋白酶；KRT9：角蛋白Ⅰ型细胞骨架9；KRT10：角蛋白Ⅰ型细胞骨架10；SERPINF2：2-抗纤溶酶；AHSG：2-HS-糖蛋白；VTN：玻连蛋白；C4B：补体 C4-B；C4A：补体 C4-A；PF4：血小板因子4；SERPINA7：甲状腺素结合球蛋白；C5：补体C5；C8A：补体C8α链；C8G：补体C8γ链；SERPINC1：抗凝血酶Ⅲ；F5：凝血因子Ⅴ；AMBP：AMBP蛋白；HPR：结合珠蛋白相关蛋白；HBD：血红蛋白δ亚基；DPP4：二肽基肽酶4；PGLYRP2：N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶；SERPIND1：肝素辅因子2；F10：凝血因子X；CPB2：羧肽酶B；BTD：生物素酶；GP5：血小板糖蛋白 V；SERPINA5：血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂；HABP2：透明质酸结合蛋白2；ENSG00000224916：载脂蛋白C-Ⅱ；HBA：血红蛋白α亚基

APOD：apolipoprotein D；APCS：serum amyloid P-component；APOE：apolipoprotein E；CA2：carbonic anhydrase 2；LYVE1：lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1；HPX：hemopexin；MBL2：mannose-binding protein C；CD5L：CD5 antigen-like；GC：vitamin D-binding protein；SERPINA3：alpha- 1-antichymotrypsin；KRT9：keratin，type Ⅰ cytoskeletal 9；KRT10：keratin，type Ⅰ cytoskeletal 10；SERPINF2：alpha- 2-antiplasmin；AHSG：alpha- 2-HS-glycoprotein；VTN：vitronectin；C4B：complement C4-B；C4A：complement C4-A；PF4：platelet factor 4；SERPINA7：thyroxine-binding globulin；C5：complement C5；C8A：complement component C8 alpha chain；C8G：complement component C8 gamma chain；SERPINC1：antithrombin-Ⅲ；F5：coagulation factor Ⅴ；AMBP：protein AMBP；HPR：haptoglobin-related protein；HBD：hemoglobin subunit delta；DPP4：dipeptidyl peptidase 4；PGLYRP2：N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase；SERPIND1：heparin cofactor 2；F10：coagulation factor X；CPB2：carboxypeptidase B2；BTD：biotinidase；GP5：platelet glycoprotein Ⅴ；SERPINA5：plasma serine protease inhibitor；HABP2：hyaluronan-binding protein 2；ENSG00000224916：apolipoprotein C-Ⅱ；HBA：hemoglobin subunit alpha

A. 基因功能注释富集分析；B. 通路富集分析；C. 蛋白互作网络分析

A. gene ontology function enrichment analysis；B. pathway enrichment analysis；C. protein-protein interaction network analysis

图1差异蛋白功能聚类和通路富集分析

Fig1Functional clustering and pathway enrichment analysis of differentially expressed proteins

差异蛋白ELISA验证采用ELISA试剂盒检测40例控制组儿童哮喘患者、40例部分控制组儿童哮喘患者和40例未控制组儿童哮喘患者血清中玻连蛋白含量。One-way ANOVA 分析显示，控制组的玻连蛋白含量(573.92±412.43)μg/ml高于未控制组的(382.27±238.64)μg/ml(P=0.0399)(图2)。

讨 论

随着哮喘的发病及病情的进展，机体内的相关蛋白水平随之发生动态变化。日益完善的蛋白组学技术为从整体水平高通量动态地研究哮喘和相关蛋白之间的关系，以及蛋白间的调控网络提供方法[7]。近年蛋白组学技术在哮喘诊断治疗、病情评估监测、致病机制阐明等应用中进展快速[8]，卢洪华等[9]采用二维差异凝胶电泳结合基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱的蛋白组学技术研究稳定期哮喘儿童和健康儿童血浆中的差异蛋白，结果显示稳定期哮喘儿童的抗凝血酶Ⅲ表达高于对照组，α2-巨球蛋白和补体C3表达低于健康对照组。Verrills等[10]采用二维差异凝胶电泳结合基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱技术从哮喘患者血浆中筛选了相比健康对照组，在哮喘组显著高表达的结合珠蛋白、血浆铜蓝蛋白和血红素结合蛋白。

iTRAQ- 2DLC-MS/MS技术是将iTRAQ稳定同位素标记技术、二维液相色谱技术和串联质谱技术联用的定量蛋白组学技术平台，具有高通量、高灵敏度、较好的定量效果、较高重复性等特点[11- 13]。本研究以iTRAQ- 2DLC-MS/MS技术寻找和鉴定57个儿童哮喘不同控制

aP=0.0399

图2不同控制水平儿童哮喘患者血清玻连蛋白表达水平

Fig2Serum vitronectin levels among childhood asthma patients at different control levels

水平的血清差异蛋白(变化倍数<0.8或变化倍数>1.2)，相关差异表达蛋白主要参与人体21种重要的生物过程，主要具有8种分子功能类型和17种细胞成分类型，主要参与44个通路。iTRAQ- 2DLC-MS/MS实验结果的差异比值和生物信息学分析结果显示，玻连蛋白在控制组儿童哮喘患者、部分控制组儿童哮喘患者和未控制组儿童哮喘患者血清中的含量呈逐渐降低趋势。文献报道肺上皮损伤是许多肺部疾病如哮喘的发病机制，因此，上皮修复对于肺内平衡起着至关重要的作用，同时可以治疗炎症和防止瘢痕形成[14]。玻连蛋白作为一种主要的细胞外基质成分，在损伤后的上皮修复中发挥重要作用。本研究对玻连蛋白采用ELISA法扩大样本量进行验证，结果显示儿童哮喘控制组的玻连蛋白含量高于未控制组(P<0.05)，玻连蛋白在儿童哮喘控制组、部分控制组和未控制组血清中的含量变化趋势与iTRAQ- 2DLC-MS/MS实验结果相符。

玻连蛋白是一种相对分子质量75 000的黏附糖蛋白，是整合素家族成员之一，涉及多种生物学过程，包括凝血途径的调节、膜攻击复合物的形成、细胞黏附和迁移、伤口愈合和组织重塑[15]。在呼吸系统，有研究表明玻连蛋白在呼出气冷凝液中存在[16]。Salazar-Peláez等[17]采用免疫组织化学分析和三维激光共聚焦图像的共定位分析研究哮喘和健康对照支气管组织和支气管上皮细胞，结果显示玻连蛋白在哮喘患者中低表达。Kadowaki等[18]研究显示乳腺导管癌患者的血清玻连蛋白水平显著高于健康对照，可作为原发性乳腺癌诊断中的血清标志物。舒博等[19]研究显示，在良性前列腺增生患者的血清中玻连蛋白含量高于前列腺癌未转移患者，而前列腺癌未转移患者血清中的玻连蛋白含量高于前列腺癌转移患者，提示玻连蛋白可能与前列腺癌的发生和转移相关，血清的玻连蛋白有助于前列腺癌的诊断和疾病进展评估。另外，Koukoulis等[20]研究显示玻连蛋白可被作为肝脏纤维化的生物标志物。

综上，本研究对不同病情控制水平的儿童哮喘血清中的玻连蛋白含量进行检测，结果显示未控制组儿童哮喘中玻连蛋白低于控制组。玻连蛋白在未控制儿童哮喘血清中的下调机制尚不明确，尚需在后续研究进一步阐明，玻连蛋白可能为儿童哮喘评估不同病情控制水平潜在标志物，可在临床和功能方面进一步验证。

[1] Vos T，Flaxman AD，Naghavi M，et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990- 2010：a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010 [J]. Lancet，2012，380(9859)：2163- 2196. doi：10.1016/S0140- 6736(12)61729- 2.

[2] Sircar G，Saha B，Bhattacharya SG，et al. Allergic asthma biomarkers using systems approaches [J]. Front Genet，2014，4：308. doi：10.3389/fgene.2013.00308.

[3] 洪建国. 2006年版全球哮喘防治创议[J]. 实用儿科临床杂志，2007，22(16)：1278- 1280.

[4] Global Initiative for Asthma. Pocket guide for asthma management and prevention in children 5 years and younger[EB/OL]. [2015- 05- 08]. http：//www.ginasthma.org.

[5] 李昌崇，张维溪. 儿童哮喘诊断治疗中存在问题探讨[J]. 临床儿科杂志，2005，23(1)：15- 17.

[6] Global Initiative for Asthma. Global strategy for asthma management and prevention[EB/OL].[2015- 05- 08]. http：//www.ginasthma.org.

[7] Jean Beltran PM，Federspiel JD，Sheng X，et al. Proteomics and integrative omic approaches for understanding host-pathogen interactions and infectious diseases [J]. Mol Syst Biol，2017，13(3)：922.doi：10.15252/msb.20167062.

[8] Park CS，Rhim T. Application of proteomics in asthma research [J]. Expert Rev Proteomics，2011，8(2)：221- 230. doi：10.1586/epr.11.4.

[9] 卢洪华，刘丽，常明，等.儿童哮喘相关蛋白靶标筛选[J].中国实验诊断学，2013，17(12)：2166- 2169.

[10] Verrills NM，Irwin JA，He XY，et al. Identification of novel diagnostic biomarkers for asthma and chronic obstructive pulmonary disease [J]. Am J Respir Crit Care Med，2011，183(12)：1633- 1643.doi：10.1164/rccm.201010- 1623OC.

[11] Bouchal P，Roumeliotis T，Hrstka R，et al. Biomarker discovery in low-grade breast cancer using isobaric stable isotope tags and two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry (iTRAQ- 2DLC-MS/MS) based quantitative proteomic analysis [J]. J Proteome Res，2009，8(1)：362- 373.doi：10.1021/pr800622b.

[12] Cheung CHY，Juan HF. Quantitative proteomics in lung cancer[J]. J Biomed Sci，2017，24(1)：37.doi：10.1186/s12929- 017- 0343-y.

[13] Vidova V，Spacil Z. A review on mass spectrometry-based quantitative proteomics：targeted and data independent acquisition [J]. Anal Chim Acta，2017，964：7- 23. doi：10.1016/j.aca.2017.01.059.

[14] Adair JE，Stober V，Sobhany M，et al. Inter-alpha-trypsin inhibitor promotes bronchial epithelial repair after injury through vitronectin binding [J]. J Biol Chem，2009，284(25)：16922- 16930. doi：10.1074/jbc.M808560200.

[15] Hao W，Zhang X，Xiu B，et al. Vitronectin：a promising breast cancer serum biomarker for early diagnosis of breast cancerin patients [J]. Tumour Biol，2016，37(7)：8909- 8916. doi：10.1007/s13277- 015- 4750-y.

[16] Carpagnano GE，Kharitonov SA，Wells AU，et al. Increased vitronectin and endothelin- 1 in the breath condensate of patients with fibrosing lungdisease [J]. Respiration，2003，70(2)：154- 160.

[17] Salazar-Peláez LM，Abraham T，Herrera AM，et al. Vitronectin expression in the airways of subjects with asthma and chronic obstructive pulmonarydisease [J]. PLoS One，2015，10(3)：e0119717. doi：10.1159/000070062.

[18] Kadowaki M，Sangai T，Nagashima T，et al. Identification of vitronectin as a novel serum marker for early breast cancer detection using a new proteomic approach [J]. J Cancer Res Clin Oncol，2011，137(7)：1105- 1115. doi：10.1007/s00432- 010- 0974- 9.

[19] 舒博，张玲，牛越，等. 前列腺癌组织Vitronectin表达临床意义研究 [J]. 中华肿瘤防治杂志，2014，21(6)：447- 450. doi：10.16073/j.cnki.cjcpt.2014.06.004.

[20] Koukoulis GK，Shen J，Virtanen I，et al. Vitronectin in the cirrhotic liver：an immunomarker of mature fibrosis [J]. Hum Pathol，2001，32(12)：1356- 1362. doi：10.1053/hupa.2001.29675.

ScreeningSerumDifferentialProteinsforChildhoodAsthmaatDifferentControlLevelsbyIsobaricTagsforRelativeandAbsoluteQuantification-basedProteomicTechnology

LIU Jiyan1，WANG Ying1，WANG Yuanzhao2，ZHU Jiawen2，DAI Fangdian1

1College of Life and Environmental Science，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China2Department of Pediatrics，the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310006，China

LIU Jiyan Tel：0571- 81316321，E-mail：liujiyan_garce@163.com

ObjectiveTo screen serum differential proteins for childhood asthma at different control levels，which provided the basis for the prevention and treatment of childhood asthma.MethodsIsobaric tags for relative and absolute quantification，two-dimensional liquid chromatography，nanoelectrospray ionization，and high-resolution tandem mass spectrometry using the hybrid quadrupole time-of-flight platform was used to screen the differential proteins in serum samples from pediatric patients with controlled，partly controlled，or uncontrolled childhood asthma. Differential proteins were validated using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsA total of 260 expressed proteins were identified. Among them 57 differentially expressed proteins were found among the different control levels of childhood asthma (fold<0.8 or fold>1.2). The differentially expressed proteins were involved mainly in 21 biological processes and 8 molecular functions and were located in 17 cellular components. ELISA showed that the serum vitronectin level was significantly higher in controlled group [(573.92±412.43) μg/ml] than in uncontrolled group[(382.27±238.64)]μg/ml (P=0.0399).ConclusionWe identified 57 differential proteins for childhood asthma at different control levels，which may be used as potential biological targets for the control of childhood asthma.

childhood asthma；quantitative proteomics；differential proteins；mass spectrometry

ActaAcadMedSin，2017,39(6)：817-826

浙江省科技计划项目(2015C33266)、杭州市科技发展计划项目(20150633B01)和国家自然科学基金(81403280) Supported by the Science and Technology Plan Project of Zhejiang Province(2015C33266)，Hangzhou Science and Technology Development Plan Project(20150633B01)，and the National Natural Sciences Foundation of China (81403280)

刘姬艳 电话：0571- 81316321，电子邮件：liujiyan_garce@163.com

R562.2

A

1000- 503X(2017)06- 0817- 10

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.06.014

2017- 09- 19)