基于三维打印技术的异烟肼/利福平双载药聚乳酸环形植入剂的制备

吴 贵，伍卫刚，周剑波，郑启新

1福建医科大学 附属第一医院骨科，福州 350005 2华中科技大学同济医学院 武汉协和医院骨科，武汉 430022

·论著·

基于三维打印技术的异烟肼/利福平双载药聚乳酸环形植入剂的制备

吴 贵1，伍卫刚2，周剑波2，郑启新2

1福建医科大学 附属第一医院骨科，福州 3500052华中科技大学同济医学院 武汉协和医院骨科，武汉 430022

目的探讨基于三维打印技术制备异烟肼/利福平/聚乳酸环形缓释制剂的可行性，并对打印的缓释剂的体外释放性能及生物相容性进行检测。方法将聚乳酸制成大小为75～100 μm的粉末，异烟肼和利福平药物分别溶解于有机溶剂中作为三维打印的黏结液，三维打印机通过层层黏结的原理，将聚乳酸逐层黏结成环形植入剂，用动态浸泡的方法研究该植入剂的体外释放特征，通过体外细胞培养实验检测植入剂的细胞相容性。结果将异烟肼或利福平溶解于黏结液中，以聚乳酸为载药基质能够实现多载药缓释植入剂的三维打印；在电镜下药物成巢状分布于植入剂内。双载药环形植入剂在体外能够持续释放32 d以上，在体外释放32 d测得的异烟肼和利福平的浓度高于药物的最低有效抑菌浓度。细胞毒性实验以及体外直接接触实验表明该植入剂无细胞毒性，具有良好的生物相容性。结论所配制的载药聚乳酸三维打印方法能够实现双载药植入剂的制备，为抗结核药物的局部缓释制剂的制备提供了新方法。

异烟肼；利福平；左旋聚乳酸；植入剂；三维打印

三维打印技术由美国麻省理工学院Sachs等[1]首先提出，它的基本原理是打印机通过粉末层层堆积，逐层黏结的方法，根据计算机设计的三维立体模型，在程序控制下，将粉末黏结成所设计的立体实物。快速成形技术方法简单，无需造模，能够较精确的控制模型的内部结构。在医药领域，学者们开始探索该技术在制备组织工程支架、个性化内植物或复杂结构的局部植入剂等方面的应用[2- 4]。药物的局部缓释技术将药物直接且持续的作用于病灶部位，提高药物的局部治疗作用，而血药浓度较低，减少药物的全身毒副作用。骨与关节结核通常需要多药联合的长疗程化疗，多药联合缓释植入剂是理想的抗结核药物。普通缓释片剂或球形植入剂随着药物的溶出，药物释放面积下降，同时药物溶出距离变大从而药物的溶出速度逐渐下降[5]。Kim[5]研制了特殊的中空的环形骨架片结构，能够在一定程度上代偿药物有效释药面积的减少，使药物释放过程更加平稳。既往多层片剂主要采用压片技术制备，然而这种制备方法容易出现层与层脱落的现象[6]，而三维打印技术采用一体成型的方法，能够克服压片技术制备多层片工艺上的缺点。本研究尝试利用三维打印技术，将异烟肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampicin，RIF)分别溶入三维打印的黏结液中，并用体内可降解的聚乳酸为载药基质，探讨三维打印技术制备多层多载药缓释片的可行性，及其体外的药物释放特征和它的细胞相容性。

材料和方法

材料与设备左旋聚乳酸(poly L-lactic acid，PLLA)(相对分子质量 100 000，成都迪康中科生物医学材料有限公司)；异烟肼及利福平原料药(台州天瑞化工有限公司)；丙酮(上海试一化学试剂有限公司，AR)；乙醇(上海试一化学试剂有限公司，AR)；CCK- 8检测试剂盒(日本同仁化学研究所)；聚乙烯吡咯烷酮(天津市科密欧化学试剂有限公司，AR)；LTY型立体打印快速成形机(上海富奇凡机电科技有限公司)；台式恒温震荡器(上海贺德实验设备厂)；日立L- 2000高效液相色谱仪；粉碎机(南京龙立天目超微粉体技术公司)。

黏结液的配制及聚乳酸粉末的加工黏结液由有机溶剂构成，其中丙酮、乙醇和水按20∶ 4∶ 5的体积比配置，并在其中加入适量甘油、聚乙烯吡咯烷酮及十二烷基硫酸钠等助剂，优化有机溶剂从墨盒中喷出。将利福平和异烟肼原料药分别溶解于所配制的有机溶剂中制成浓度为150 g/L的含药黏结液。上述载药黏结液和空白黏结液分别注入空打印墨盒中作为三维打印的墨水。干燥的聚乳酸粉末用粉碎机充分粉碎后，筛选出粒径为75～100 μm的粉末，使粉末粒径均匀，将其保存于P2O5真空干燥仪中干燥备用。

植入剂的结构设计设计的植入剂为中空的环形柱状结构，植入剂分为3层，总高度为6.8 mm，上下表层为阻释层，其厚度各1 mm，中间分两层，分别含有异烟肼和利福平，每个载药层厚度为2.4 mm。植入剂外径为9 mm，内径为3 mm(图1)。

三维打印过程在工作平台上均匀铺上一层经过筛选的粒径合适的聚乳酸粉末，在控制软件中输入植入剂模型参数，打印机自动将聚乳酸粉末铺成200 μm层厚的粉末层，并在粉末层上根据所设定的环形图案喷洒上黏结剂，每层重复喷洒黏结液15次，以增加含药量和黏结强度。当完成一层黏结后，三维打印机下降200 μm，重新铺上粉末，打印机重新将聚乳酸粉末铺平，再次于粉末层的同一位置喷洒出环形图案的黏结剂。这样可将两层聚乳酸粉末黏结在一起，重复该过程，预先设置的模型便可通过层层叠加的方式，最后打印出所需要形状的植入剂(图2)。打印顺序为：

图1植入剂结构示意图

Fig1Structure diagram of the implant

阻释层-载异烟肼层-载利福平层-阻释层。其中上下阻释层各用空白黏结液打印5层，厚1 mm；载药层分别用含异烟肼和利福平的黏结液各打印12层，厚分别为2.4 mm。打印结束后，植入剂在粉末中静置30 min，干燥后去除多余的粉末。用丙酮喷雾加强植入剂表层的黏结。

体外生物相容性检测

鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养：选取4～6周雌雄不限SD大鼠，断颈处死后用70%酒精浸泡10 min；分离大鼠双侧后肢股骨及胫骨，用PBS液冲洗剥离软组织；剪断骨端，用含10%胎牛血清的培养基将骨髓冲至10 ml无菌离心管中。培养基总用量10 ml。将细胞悬液分离液加入15 ml离心管中，并分成等量的两管。室温下以100×g离心15 min。弃上清分别加入5 ml培养基并用滴管吹打使细胞悬浮。将上面细胞悬液接种于6孔板上，于37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养。接种24 h后对半换液，每3天换1次液，直到细胞生长融合至80%～90%时消化传代。

细胞毒性检测(CCK- 8法)：根据ISO10993- 12的标准制备植入剂浸提液，将植入剂以0.2 kg/L的比例浸泡入胎牛血清的低糖DMEM培养基中在37℃恒温箱中浸提1 d，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，取滤液，4℃冰箱保存备用。将鼠骨髓间充质干细胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。调整细胞密度为2×104/ml，以每孔200 μl，接种于96孔培养板，置于37℃，5%CO2培养箱中预培养1 d，使细胞贴壁。各取8孔作为实验组和阴性对照组。实验组分别用200 μl制备的浸提液培养24及48 h，对照组用普通DMEM培养基培养。在检测时间点，分别用DMEM和CCK- 8试剂的混合液(10∶ 1)100 μl替换各培养孔中的培养基。于37℃细胞培养箱中孵育1 h。用酶标仪在450 nm波长下，测定各孔的吸光度A450值。

直接接触实验：将环氧乙烷消毒过的植入剂，切割成2 mm×2 mm×2 mm的小方块。在持续搅拌的小鼠骨髓间充质干细胞悬浮液中吸取2 ml细胞悬浮液，注入培养皿内，共6孔，同时取3孔作为空白对照。转动器皿，使细胞均匀分散在每只器皿中。将培养皿置37℃，5%CO2培养箱中培养。培养细胞生长至近汇合。观察培养细胞的生长情况。将植入剂置于实验孔中。继续于37℃，5%CO2培养箱中培养，分别于24及72 h后，在倒置相差显微镜中观察植入剂周围细胞的形态和增殖情况。

体外药物释放实验植入剂的药物溶出实验在PBS(pH=7.4)中进行。将5 ml PBS液装入玻璃瓶中，植入剂用细丝线捆绑后悬挂于释放介质内。将该玻璃瓶置于37℃恒温振荡床内，并调整振荡频率为100 次/min。分别于2、4 d以及以后每4天取样1次直到第32天。在取样时间点吸取2 ml测浓度，移除剩余的溶液，并重新更换5 ml PBS液。用反向高效液相色谱法，利用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)检测样本的浓度。甲醇∶磷酸氢二钠(0.02 mol/L，用磷酸调pH至4.5)(75∶ 25)为流动相，紫外光检测波长254 nm，流速为1 ml/min。

统计学处理数据用SPSS 13.0软件进行统计分析，结果用均数±标准差表示，其中细胞毒性实验组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

A.打印机侧面观，打印机在平台上铺聚乳酸粉末层；B.打印机喷头在粉末层上喷涂黏结剂；C.打印机正面观，聚乳酸粉末层上喷出环形黏结液图形

A.lateral view of the printer and poly L-lactic acid powder was spread on the platform of the printer；B.binding liquid was injected on the powder through the printing head；C.anterior view of the printer and annulus patterns were printed on the poly L-lactic acid powder

图2三维打印原理图

Fig2Diagram of 3D printing

结 果

植入剂的结构实验制备的INH/RIF/PLLA环形植入剂粉末黏结较紧密，层与层之间无断开(图3A)。经过外围喷涂丙酮黏结液处理后，表面黏结紧密，表面无粉末脱落现象，植入剂体积略有收缩(0.2～0.5 mm)。植入剂在电镜下观察显示，阻释层表面结构致密无明显的孔隙，且表面无异烟肼及利福平结晶附着(图3B)；在含药层，可见许多直径为50～100 μm的微孔，微孔在植入剂表面分布较均匀，在微孔中包含着大量的药物结晶，结晶嵌入聚乳酸载药基质中(图3C)。

生物相容性

细胞毒性：INH/RIF/PLLA环形植入剂与细胞混合培养24及48 h后，两个时间点植入剂组与对照组的A450值差异无统计学意义[24 h：(0.58±0.03)比(0.50±0.05)，t=2.24，P=0.07；48 h：(0.53±0.03)比(0.53±0.04)，t=-0.75，P=0.94]。

直接接触实验结果：NH/RIF/PLLA环形植入剂与鼠骨髓间充质干细胞混合培养3 d，结果显示细胞形态良好，植入剂周围的细胞呈梭形，围绕植入剂周围生长；共培养24 h时植入剂周围细胞较稀疏，呈均匀分布，未发现植入剂周围有细胞畸形或变性区域；培养72 h时植入剂周边的细胞数量增多，细胞间距缩小，紧密围绕植入剂周围生长(图4)。

箭头：异烟肼

arrows：isoniazid

A.植入剂的大体相；B.阻释层的微观结构；C.含药层的微观结构

A.appearance of the implants；B.microstructure of the barrier layer；C.microstructure of the drug-loaded layer

图3植入剂的结构

Fig3Structure of the implants

黑色部分为异烟肼/利福平/聚乳酸植入剂

The black area was isoniazid/rifampicin/poly L-lactic acid implant

A.共培养24 h时的细胞形态；B.共培养72 h时的形态

A.cellular morphology after co-culture for 24 hours；B.cellular morphology after co-culture for 72 hours

图4倒置相差显微镜观察植入剂周围细胞的形态

Fig4Cellular morphology around the implant under the inverted phase contrast microscope

体外药物释放实验结果植入剂的体外释放实验观察了32 d。在最初的第2和4天药物溶出量较多，INH累积溶出量为(46.85±11.45)mg/L，RIF累积溶出量为(40.25±8.20)mg/L。在随后的时间里，植入剂内的药物逐渐缓释，溶出的量逐渐下降，到第32天时，异烟肼和利福平的浓度均高于1 mg/L(图5)。并且植入剂在浸泡的过程中未出现层与层脱落的现象。

讨 论

三维打印技术是目前研究较为热门的增材制造技术。根据打印机不同的工作原理可分为选择性激光烧结技术、光固化成形技术以及熔融堆积成形技术等[7]。然而目前研究较为成熟的三维打印技术所制备的材料通常由单一组份构成，例如用选择性激光烧结技术制备的钛合金支架[8]、熔融堆积成形技术制备的聚合物材料等[9]。然而随着研究的深入，学者们逐渐开始对复合材料的三维打印展开研究，以实现组织器官和复合材料等非单一成份物件的三维打印[10- 11]。骨与关节结核病灶周围常发生栓塞性动脉炎，病灶内血供差或成为无血供区，经静脉或口服给药抗结核通常效果不理想，在病灶清除手术的基础上结合局部应用抗结核药物缓释制剂有利于骨与关节结核的治疗。其中异烟肼和利福平是抗结核治疗的一线用药，可抑制或杀灭结核杆菌。本研究利用三维打印技术的优势，以体内可降解的聚乳酸为载药基质，通过熔融堆积成形技术制备载INH/RIF的抗结核植入剂。

图5异烟肼/利福平/聚乳酸植入剂的药物体外缓释曲线图

Fig5Drug release curve of isoniazid/rifampicin/poly L-lactic acid implantinvitro

聚乳酸具有良好的生物相容性，是目前已被批准的可用于人体的可降解有机材料[12]。它被用于制造成多种医用可吸收植入物，并且广泛应用于临床，例如可降解骨螺钉[13]、可降解的医用防黏连膜[14]等。聚乳酸易溶于有机溶剂，溶剂挥发干燥后可固化成具有一定强度的固体实物，因此符合熔融堆积成形技术对粉末的要求。此外三维打印技术还要求粉末具有良好的流动性[15]，本研究将聚乳酸粉末加工成微小颗粒，并选用其中粒径为75～100 μm的颗粒，实验过程可见该粉末具有良好的流动性，能够顺利完成200 μm层厚的铺粉。将异烟肼及利福平溶解于有机溶剂黏结液中通过墨盒喷涂能够逐层将聚乳酸粉末黏结，并经过逐层累积最终打印出中空环形植入剂。该植入剂在显微镜下可见颗粒状的聚乳酸粉末被溶解并再干燥后呈薄片状，INH/RIF则呈巢穴状均匀分布于植入剂内。而植入剂上下阻释层则致密无孔隙，用以预防因药物自上下表层释放而影响缓释效果。

1965年，Cleave[16]提出一个数学理论，认为如果在环形的片剂中间制备出一个或多个孔隙，有可能使片剂在溶解过程中保持表面积相对恒定，从而使药物释放更加平稳。Sundy和Danckwerts[6]用自制的冲压机制备羟丙基甲基纤维素复合明胶多层环形缓释片，体外缓释5 h，结果显示该缓释片初期表现出突释效应，随后药物逐渐从多层缓释片中释放，表明多层环形片结构能够在一定程度上使药物释放更加平稳，然而该研究的缓释时间持续较短，而结核及肿瘤等药物的局部治疗时间要求达到几周甚至几个月。本研究用体内降解周期较长的聚乳酸为载药基质，用三维打印技术制备长效多层环形植入剂，本研究缓释实验的初期可见植入剂较快地缓释出较多的异烟肼和利福平，这可能与表层药物的快速溶蚀有关，而随着观察时间的延长，药物持续从植入剂中释放，且释放的速度逐渐下降，在第32天观察终末时药物的浓度仍高于1 mg/L，均高于两种抗结核药物在体内最低的有效作用浓度(异烟肼：0.025～0.05 mg/L；利福平：0.06～0.25 mg/L)。用冲压机制备多层片，层与层之间并非一体成形，因此用该种方法冲压制备长效的缓释植入剂有可能出现层与层脱落的现象，而破坏了植入剂的结构。三维打印技术通过逐层黏结的方法，在不同层连接处也达到一样的黏结效果，因此能够更加稳固的黏结。在缓释实验中层与层未见有脱落的现象。

本研究使用的黏结剂及载药基质中含有较多的化学物质，因此在体内应用前有必要对植入剂的毒性进行检测。将植入剂浸提液用于培养骨髓间充质干细胞，实验结果表明，实验组与对照组相比细胞的数量差异无统计学意义。植入剂与细胞共培养3 d，植入剂周围细胞生长形态良好，随着观察时间延长，植入剂周围的细胞数量逐渐增殖。植入剂与细胞之间未出现无细胞条带，表明本研究所制备的植入剂在体外具有良好的生物相容性，对细胞无毒性作用。

综上，本研究采用三维打印技术以聚乳酸为载药基质制备异烟肼/利福平双载药缓释植入剂是一种可行的方法。环形植入剂在体外能够达到1个月以上的缓释作用，并且所制备的植入剂具有良好细胞相容性。聚乳酸是制备体内可降解缓释植入剂的良好载体，将不同的药物溶入黏结液中，可以制备不同治疗功能的缓释制剂，本研究为制备长效缓释植入制剂提供新的方法。

[1] Sachs E，Cima M，Cornie J，et al. Three-dimensional printing：the physics and implications of additive manufacturing[J].CIRP Annals，1993，42(1)：257- 260. doi：10. 1016/S0007- 8506(07)62438- X.

[2] He J，Xia P，Li D. Development of melt electrohydrodynamic 3D printing for complex microscale poly (epsilon-caprolactone) scaffolds[J].Biofabrication，2016，8(3)：035008. doi：10. 1088/1758- 5090/8/3/035008.

[3] Xiao JR，Huang WD，Yang XH，et al. En bloc resection of primary malignant bone tumor in the cervical spine based on 3-dimensional printing technology[J].Orthop Surg，2016，8(2)：171- 178. doi：10. 1111/os. 12234.

[4] Schwam ZG，Chang MT，Barnes MA，et al. Applications of 3-dimensional printing in facial plastic surgery[J].J Oral Maxillofac Surg，2016，74(3)：427- 428. doi：10. 1016/j. joms. 2015. 10. 016.

[5] Kim CJ. Release kinetics of coated，donut-shaped tablets for water soluble drugs[J].Eur J Pharm Sci，1999，7(3)：237- 242. doi：10. 1016/S0928- 0987(98)00029- 3.

[6] Sundy E，Danckwerts MP. A novel compression-coated doughnut-shaped tablet design for zero-order sustained release[J].Eur J Pharm Sci，2004，22(5)：477- 485. doi：10. 1016/j. ejps. 2004. 05. 004.

[7] Malik HH，Darwood ARJ，Shaunak S，et al. Three-dimensional printing in surgery：a review of current surgical applications[J].J Surg Res，2015，199(2)：512- 522. doi：10. 1016/j. jss. 2015. 06. 051.

[8] Wang L，Cao T，Li X，et al. Three-dimensional printing titanium ribs for complex reconstruction after extensive posterolateral chest wall resection in lung cancer[J].J Thorac Cardiovasc Surg，2016，152(1)：e5- e7. doi：10. 1016/j. jtcvs. 2016. 02. 064.

[9] Melocchi A，Parietti F，Maroni A，et al. Hot-melt extruded filaments based on pharmaceutical grade polymers for 3D printing by fused deposition modeling[J].Int J Pharm，2016，509(1- 2)：255- 263. doi：10. 1016/j. ijpharm. 2016. 05. 036.

[10] Rezende RA，Kasyanov V，Mironov V，et al. Organ printing as an information technology[J].Procedia Engineering，2015，110(Supplement C)：151- 158. doi：10. 1016/j. proeng. 2015. 07. 023.

[11] Kang HW，Lee SJ，Ko IK，et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity[J].Nat Biotechnol，2016，34(3)：312- 319. doi：10. 1038/nbt. 3413.

[12] Qiao T，Song P，Guo H，et al. Reinforced electrospun PLLA fiber membrane via chemical crosslinking[J].Eur Polym J，2016，74(Supplement C)：101- 108. doi：10. 1016/j. eurpolymj. 2015. 11. 012.

[13] Oba Y，Yasue A，Kaneko K，et al. Comparison of stability of mandibular segments following the sagittal split ramus osteotomy with poly-l-lactic acid (PLLA) screws and titanium screws fixation[J].Orthod Waves，2008，67(1)：1- 8. doi：10. 1016/j. odw. 2007. 10. 001.

[14] Lee JH，Go AK，Oh SH，et al. Tissue anti-adhesion potential of ibuprofen-loaded PLLA-PEG diblock copolymer films[J].Biomaterials，2005，26(6)：671- 678. doi：10. 1016/j. biomaterials. 2004. 03. 009.

[15] Butscher A，Bohner M，Roth C，et al. Printability of calcium phosphate powders for three-dimensional printing of tissue engineering scaffolds[J].Acta biomaterialia，2012，8(1)：373- 385. doi：10. 1016/j. actbio. 2011. 08. 027.

[16] Cleave JP. Some geometrical considerations concerning the design of tablets[J].J Pharm Pharmacol，1965，17(11)：698- 702. doi：10. 1111/j. 2042- 7158. 1965. tb07591. x.

FabricationofIsoniazid/Rifampicin/PolyL-lacticAcidDonut-shapedImplantsviaThreeDimensionalPrintingTechnique

WU Gui1，WU Weigang2，ZHOU Jianbo2，ZHENG Qixin2

1Department of Orthopedics，First Affiliated Hospital，Fujian Medical University，Fuzhou 350005，China2Department of Orthopedics，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

WU Gui Tel：0591- 87982105，E-mail：wugui_1985@sina.com

ObjectiveTo investigate the possibility of manufacturing dual-drug loaded isoniazid/rifampicin/poly L-lactic acid (PLLA) implant with donut-shaped structure via three-dimensional (3D) printing technique and study the drug release characteristic and biocompatibility of the implantinvitro.MethodsPLLA was crushed into particles with diameters around 75- 100 μm.Isoniazid and rifampicin bulk drugs were dissolved into the organic dissolvent respectively to be the binding liquid.The 3D printing machine fabricated the donut-shaped implant via binding the PLLA powder layer by layer.Dynamic socking method was used to study theinvitrorelease characteristics，and cell culture experiment was used to test the cytocompatibility of the implant.ResultsPLLA slow-release implants were made by using the PLLA powder as matrix and isoniazid/rifampicin organic solvent as binding liquid through 3D printing.The drugs in the implants distributed in nest under electron microscope.The concentrations of both drugs were still higher than the lowest effective bacteriostasis concentration after release for 32 days.Cytotoxicity and direct contact tests indicated that the implants had rare cytotoxicity and favorable biocompatibility.ConclusionThe donut-shaped implants can be successfully fabricated using the 3D printing method，which offers a new method for the manufacturing of topical slow-release anti-tuberculosis drugs.

isoniazid；rifampicin；poly L-lactic acid；implant；three-dimensional printing

ActaAcadMedSin，2017,39(6)：743-748

吴 贵 电话：0591- 87982105，电子邮件：wugui_1985@sina. com

R978.3

A

1000- 503X(2017)06- 0743- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.06.002

2017- 04- 24)