可耐受高温对黑曲霉生物膜体外模型构建的影响

曾 荣，童建波，刘宇甄，陈 青，林 彤，李 岷，吕桂霞

1 中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所，南京 210042 2 江苏省血液中心，南京 210042 3江苏省皮肤性病学分子生物学重点实验室，南京 210042

·论著·

可耐受高温对黑曲霉生物膜体外模型构建的影响

曾 荣1，童建波1，刘宇甄1，陈 青2，林 彤1，李 岷3，吕桂霞1

1中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所，南京 2100422江苏省血液中心，南京 2100423江苏省皮肤性病学分子生物学重点实验室，南京 210042

目的在可耐受高温作用下构建黑曲霉生物膜模型，探讨可耐受高温效应对其形成结构及活力的影响。方法对比37℃下，分别采用共聚焦激光扫描显微镜和甲基四氮盐法探索在不同高温效应下(39℃或41℃)体外黑曲霉生物膜形成过程中的多个时间观察点(4、8、10、16、24、48和72 h)的超微结构差异及活力变化。结果与37℃相比，在4 h时，温度较高的39℃组和41℃组黏附率均显著降低(t=8.603，P=0.047；t=14.550，P=0.008)，黏附浓度也均显著降低(t=8.315，P=0.0021；t=11.748，P=0.0015)；在8 h时，温度越高，出芽率越低(t=8.906，P=0.049；t=23.310，P=0.009)、菌丝长度越短(t=35.118，P=0.039；t=63.450，P=0.006)；在10～16 h菌丝生长阶段，温度越高菌丝极性生长破坏越严重，菌丝越弯曲，且分枝越多，活力越高(t=24.262，P=0.038；t=7.556，P=0.031)；24 h时，温度越高生物膜厚度越薄(t=2.375，P=0.043，t=5.263，P=0.031)，菌丝方向性越差，活力越低(t=24.262，P=0.038；t=7.556，P=0.031)。结论可耐受高温作用能够在一定程度上抑制黑曲霉生物膜的形成及其活力。

黑曲霉；生物膜；高温作用

黑曲霉是侵袭性曲霉病的重要致病菌之一，在多个调查中均发现其处于常见致病曲霉菌的前3位[1- 2]。据统计该病的致死率可达30%～90%[3- 4]。造成如此高的致死率可能与曲霉在体内形成生物膜形态相关。生物膜是一种菌体和生物膜基质混合形成的菌体复合体。生物膜耐药性及致病性均较悬浮菌显著增加。外源性的持续可耐受高温效应常被用于肌肉拉伤、感染等方面疾病的治疗[5- 6]。因此，本研究拟使用可耐受高温作用于黑曲霉生物膜形成过程探索可耐受高温作用对黑曲霉生物膜形成的影响，为日后可耐受高温应用于黑曲霉生物膜相关感染的临床治疗提供理论依据。

材料和方法

菌株、主要试剂及仪器黑曲霉菌标准菌株(ATCC16404)购自美国(American Type Culture Collection，ATCC)；FUN- 1(Invitrogen)、XTT(Sigma)、RPMI- 1640(Gibco)；共聚焦激光扫描显微镜(OLYMPUS-FV1000)、酶标仪(Thermo)、恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)。

生物膜体外模型构建构建方法参考曲霉的生物膜构建方法[7]。按要求菌悬液制备完成后，将菌悬液分别接种于24孔组织培养板中。24孔组织培养板培养孔在菌悬液接种前提前放置圆形无菌细胞爬片(直径13 mm)。后分别置于3个不同的温度下(37℃、39℃或41℃)进行培养。

不同温度作用下黑曲霉生物膜形成过程和结构特征采用共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)对不同可耐受高温作用下(37℃、39℃和41℃)孢子的黏附率、黏附浓度、出芽率、菌丝生长长度及菌丝的形态差异进行对比观察。通过拍摄5个以上的激光共聚焦显微镜照片计算孢子在细胞爬片上的黏附浓度(个/mm2)及黏附率。使用CLSM对生物膜的整个形成过程进行扫描观察，并使用软件(Olympus Fluo View Vesion 3.1 Viewer)对菌丝的形态、长度进行测量及对生物膜的立体结构进行三维重建并对生物膜的厚度进行测量(图1)。操作方法按照试剂说明书配制FUN- 1荧光染料缓冲液。使FUN- 1荧光染料终浓度为25 μmol/L。在预先设定的时间点4、8、10、16、24、48及72 h取出细胞爬片。使用1×PBS清洗生物膜表面，反复3次。在生物膜表面加入200 μl上述FUN- 1液体。室温避光孵育30 min后，使用CLSM进行观察，激发光波长为488 nm。

生物膜的活力测定按照说明书配制甲基四氮盐/维生素K3(XTT/VitK3)混合液。使XTT/VitK3混合液终浓度为XTT(0.5 mg/ml)/VitK3(10 mmol/L)测定生物膜活体部分的代谢活力，即生物膜活力，以此评价生物膜的生长情况。在预先设定的时间点4、8、10、16、24、48及72 h进行生物膜活力测定。取出培养板，先吸弃悬浮液，再使用PBS清洗24孔组织培养板中的生物膜3遍。然后向孔内加人500 μl XTT/VitK3混合液。铝箔纸包扎，避光37℃培养3 h。将上清吸至新的酶标仪板中使用酶标仪在490 nm波长下读取数据。记录相关数值。

统计学处理采用SPSS 16.0进行统计分析，所有数据以均数±标准差表示。采用两独立样本比较的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

可耐受高温对黑曲霉生物膜早期形成阶段(0～15h)的影响在4 h时37℃、39℃及41℃的黏附率分别为(26.1±5.2)%、(17.3±3.4)%及(14.6±4.1)%，黏附浓度分别为(130.5±12.3)/mm2、(85.6±8.3)/mm2及(70.6±7.2)/mm2。39℃及41℃组黏附率较37℃组均显著降低(t=8.603，P=0.047；t=14.550，P=0.008)；39℃及41℃组黏附浓度较37℃组均显著降低(t=8.315，P=0.002；t=11.748，P=0.002)；且温度越高，黏附率和黏附浓度越低；在8 h时37℃、39℃及41℃的孢子出芽率分别为(88.2±12.1)%、(68.4±10.3)%及(27.7±7.1)%。39℃及41℃组出芽率较37℃组均显著降低(t=8.906，P=0.049；t=23.310，P=0.009)；且温度越高，出芽率越低；在8 h时测量菌丝长度，37℃、39℃及41℃的菌丝长度分别为(45.50±2.44)mm、(24.50±1.67)mm及(9.20±1.24)mm。39℃及41℃组菌丝长度较37℃组均显著缩短(t=35.118，P=0.039；t=63.450，P=0.006)；且温度越高，菌丝长度越短(图2)；在10～15 h，37℃组菌丝直且长，而可耐受高温组菌丝短，且分枝多，且温度越高上述情况越显著(图1)。

可耐受高温对黑曲霉生物膜晚期形成阶段(16～72h)的影响16～24 h时，与37℃组相比，高温效应组菌丝极性生长情况进一步被破坏，菌丝卷曲明显，菌丝缠绕无序，不够致密，且温度越高，上述现象越明显(图1)。通过CLSM对黑曲霉生物膜形成过程进行逐层扫描，结果显示在16 h时，37℃、39℃及41℃的生物膜厚度分别为(129.5±2.2)μm、(141.0±3.2)μm及(154.3±5.2)μm。39℃组生物膜厚度较37℃对照组厚(t=2.375，P=0.043)；41℃组生物膜厚度较37℃组显著增厚(t=5.263，P=0.031)，且温度越高生物膜厚度越厚。然而在24～72 h时，3种温度作用下生物膜厚度出现了趋势逆反。在24 h时37℃、39℃及41℃的生物膜厚度分别为(177.5±3.3)μm、(165.7±4.5)μm及(151.3±2.5)μm。39℃及41℃组生物膜厚度较37℃组变薄(t=9.213，P=0.035；t=5.872，P=0.031)，且温度越高生物膜厚度越薄(t=3.826，P=0.043)(图3)。

可耐受高温对黑曲霉生物膜形成活力的影响在4～8 h时，与37℃正常温度相比，可耐受高温作用下生物膜活力差异无统计学意义(t=-0.213，P=0.256)。10 h时37℃、39℃和41℃的XTT值分别为0.543±0.04、0.355±0.02和0.154±0.09。39℃及41℃组XTT活力值较37℃组均显著降低(t=13.068，P=0.027；t=10.271，P=0.019)；且温度越高，生物膜活力值越低。然而在16 h时，37℃、39℃和41℃的XTT值分别为0.641±0.04、0.842±0.05和0.887±0.12。39℃及41℃组XTT活力值较37℃组均显著增高(t=24.262，P=0.038；t=7.556，P=0.031)。但在24 h后，37℃、39℃和41℃的XTT值分别为1.680±0.09、1.380±0.11和1.080±0.14。39℃及41℃组XTT活力值较37℃组均显著降低(t=23.541，P=0.046；t=7.264，P=0.033)，且温度越高，生物膜活力值越低(t=4.367，P=0.046)(图4)。

讨 论

黑曲霉是侵袭性曲霉病感染的重要致病菌。该菌的发病率呈现逐年上升的趋势。虽然有不少新型抗真菌药物的出现，但是其致死率仍较高。因此，寻求其他有效治疗黑曲霉感染的方法十分必要。可耐受高温效应在一些疾病的治疗方面取得了欣喜的效果，本研究试图探索该方法是否有助于抑制黑曲霉生物膜的形成。

生物膜形成过程包括孢子黏附、出芽、菌丝生长、菌丝缠绕和生物膜基质的形成。本研究结果显示黑曲霉悬浮菌在3个不同温度(37℃、39℃和41℃)培养4 h后，温度越高、黏附率越低，表明温度高可能会抑制黑曲霉孢子黏附，而黏附正是生物膜形成的第一步，也是真菌重要的致病因素之一。Cho等[8]在高温效应下构建白念珠菌生物膜模型时发现37℃、39℃和41℃组孢子的黏附率、黏附浓度无差异。笔者推测可能是因为白念珠菌更能耐受这个范围的高温作用。而有可能这一特性正是导致白念珠菌临床发病率显著高于黑曲霉的重要原因之一。在8 h时，与37℃正常温度相比，39℃和41℃菌丝生长长度显著短于正常温度组，且温度越高，菌丝长度越短，表明从孢子萌芽至菌丝初步生长阶段37℃是最适宜的生长温度。在10～16 h时，本研究显示37℃组菌丝细长，呈现极性生长，既有横向方向性生长，又有竖直方向的生长状态，而高温组39℃、41℃组菌丝方向性生长较差，菌丝较细短，且过早出现弯曲、分枝，温度越高，上述现象越明显，表明高温会影响菌丝的极性生长。在丝状真菌中极性生长是其重要的生长方式，这和它的致病性密切相关[9]。孢子在出芽前先经历了一小段时间的对称性生长后就会进入极性生长阶段，这个阶段一直会持续调控菌丝的生长及延长，虽然有不少对极性生长方面的研究，但是其具体机制仍不清楚。Zhang等[10]发现在常温作用下，烟曲霉温度敏感株△fcwh41菌株不能够呈现极性生长，而正常野生株在同样温度下可进行极性生长。Castillo-Lluva等[11]在玉蜀黍黑粉菌温度敏感株cdk5突变株也发现了类似现象。然而Chen等[12]使用绿色荧光蛋白标记钙调素的构巢曲霉菌株上发现在37℃和42℃作用下，控制菌丝生长方向的绿色荧光蛋白均处于极性生长的顶端，菌丝均呈极性生长。黑曲霉与其存在差异可能是因为构巢曲霉要更多地适应自然环境，因此需要更好地耐受自然界的高温环境，而作为人体常见的致病菌黑曲霉并不需要具备这项能力。

图1利用共聚焦激光扫描显微镜观察黑曲霉生物膜在3种不同温度(37℃、39℃和41℃)作用下的各个时间点(4、8、10、16、24 h)的形成情况(A～E)，并使用该显微镜自带三维重建软件对生物膜进行三维重建(F)

Fig1Images ofAspergillusnigerbiofilm formation at 37℃，39℃，and 41℃ obtained by confocal laser scanning microscopy at different time points (4，8，10，16，and 24 hours) (A-E)，three-dimensional images of biofilm were construct by 3D reconstruction software of confocal laser scanning microscopy (F)

aP=0.047；bP=0.008；cP=0.0021；dP=0.0015；eP=0.049；fP=0.009；gP=0.0039；hP=0.006

A.菌悬液接种4 h后的黏附率；B.菌悬液接种4 h后孢子在细胞爬片上的黏附浓度；C.菌悬液接种8 h后孢子的出芽率；D.菌悬液接种8 h后菌丝的长度

A.the adherence rates after 4 hours of inoculation；B.the concentration of cells after 4 hours of inoculation；C.the germination rate after 8 hours of inoculation；D.the hyphal lengths after 8 hours of inoculation

图2在不同温度作用下黑曲霉生物膜早期形成阶段的动态变化

Fig2The dynamic change ofAspergillusnigercells in biofilm formation after treatment with different mild heat temperature

t=2.375，a1P=0.043；t=5.263，b1P=0.031；t=9.213，a2P=0.035；t=5.872，b2P=0.031

图3共聚焦激光扫描显微镜测定不同时间点在37℃、39℃ 和 41℃作用下生物膜形成过程中厚度变化

Fig3The thickness of biofilm under different mild heat stress conditions at 37℃，39℃，and 41℃ by confocal laser scanning microscopy at different time points

t=13.068，a1P=0.027；t=10.271，b1P=0.019；t=24.262，a2P=0.038；t=7.556，b2P=0.031；t=23.541，a3P=0.046；t=7.264，b3P=0.033

图4甲基四氮盐法检测不同时间点在37℃、39℃ 和 41℃作用下生物膜活力变化

Fig4The dynamic change of biofilm under different mild heat stress conditions at 37℃，39℃，and 41°C by 2，3-bis(2-methoxy- 4-nitro- 5-sulfophenyl)- 2H-tetrazolium- 5-carboxanilide reduction assay at different time points

本研究显示极性生长可能与生物膜形成的厚度密切相关。在16 h时可耐受高温组41℃和39℃虽然菌丝数量及XTT检测活力均高于37℃正常温度对照组，但是在菌悬液培育24 h后生物膜整体厚度及活力反而较37℃正常温度对照组薄，且整体活力低，推测这可能与观察到可耐受高温组菌丝过早出现分枝，且分枝在垂直于生物膜生长接触面方向较短，导致生物膜竖直方向生长空间狭小有关。因此笔者推测极性生长状态的菌丝能够构建更厚的生物膜是因为极性生长能够使菌丝在接触面的垂直方向更好地生长。37℃是黑曲霉极性生长的最佳温度，因此，笔者推测37℃是最适合生物膜生长的温度，过高的温度将削弱生物膜的形成。

综上，本研究显示可耐受高温作用能够较好地抑制黑曲霉生物膜的形成，该效应能否运用于临床治疗尚需要更多的动物实验及大量的临床试验进行验证。

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InVitroEfficacyofContinuousMildHighTemperatureontheBiofilmFormationofAspergillusNiger

ZENG Rong1，TONG Jianbo1，LIU Yuzhen1，CHEN Qing2，LIN Tong1，LI Min3，LÜ Guixia1

1Institute of Dermatology，CAMS and PUMC，Nanjing 210042，China2Jiangsu Province Blood Center，Nanjing 210042，China3Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases & STDs，Nanjing 210042，China

LIN Tong Tel：025- 85478000，E-mail：ddlin@hotmail.com；

ObjectiveTo investigate whether continuous mild high temperature (increased temperature without causing significant damage to host cells) can inhibit the biofilm formation ofAspergillusniger(A.niger) and its vitality.MethodsA.nigerbiofilms were formed on a coverslip in 24-well tissue culture plate and were checked at the time points 4，8，10，16，24，48 and 72 hours.Confocal laser scanning microscopy (CLSM) was used to image and quantifyA.nigerbiofilm formation under three different continuous mild high temperatures at 37℃，39℃，and 41℃.Furthermore，2，3-bis(2-methoxy- 4-nitro- 5-sulfophenyl)- 2H-tetrazolium- 5-carboxanilide (XTT) assay was used to quantify the dynamic growth ofA.nigerbiofilm under the above conditions.ResultsCompared with the culture condition 37℃，CLSM analysis at 39℃ or 41℃ showed that higher temperature induced later germination at 4 hours (t=8.603，P=0.047；t=14.550，P=0.008)，poorer hyphal elongation at 8 hours(t=35.118，P=0.039；t=63.450，P=0.006)，poorer polar growth，and reduced biofilm thickness from 10 to 24 hours.The XTT assay showed that higher temperature (39℃ or 41℃) lead to lower vitality at 10 hours，higher vitality at 16 hours，but finally lower vitality from 24 to 72 hours (t=24.262，P=0.038；t=7.556，P=0.031).ConclusionContinuous mild high temperature may have a negative regulatory effect on biofilm formation ofA.nigerand its vitality.

Aspergillusniger；biofilm；continuous mild high temperature

ActaAcadMedSin，2017,39(6)：762-767

国家自然科学基金(81502739、81371750)、江苏省自然科学基金(BK20150068)、北京协和医学院青年基金(3332016108)、中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(CIFMS- 2017-I2M- 1- 017)和973项目(2013CB531605)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (81502739，81371750)，Jiangsu Nature Sciences Foundation (BK20150068)，PUMC Youth Fund (3332016108)，CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS- 2017-I2M- 1- 017)，and Program 973 (2013CB531605)

林 彤 电话：025- 85478000，电子邮件：ddlin@hotmail.com；

李 岷 电话：025- 85478151，电子邮件：drlimin@sina.cn

R379.6

A

1000- 503X(2017)06- 0762- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.06.005

LI Min Tel：025- 85478151，E-mail：drlimin@sina.cn

2017- 03- 10)