苦豆子总碱及其单体对白色念珠菌抑制作用的研究※

吕姣姣 周 凯 李 豪 张 涓

(陕西中医药大学2015级硕士研究生，陕西 咸阳 712046)

苦豆子总碱及其单体对白色念珠菌抑制作用的研究※

吕姣姣 周 凯 李 豪 张 涓△

(陕西中医药大学2015级硕士研究生，陕西 咸阳 712046)

目的对比观察苦豆子总碱及其苦参碱(matrine)、槐定碱(sophoridine)单用和联用对白色念珠菌的抑制作用。方法通过对白色念珠菌的培养，观察真菌菌丝形成；并进行抑菌圈实验测定药物的敏感性；再用噻唑蓝微量稀释(MTT)法检测最低抑菌浓度；通过磷钼酸比色法测定吸光度，判断白色念珠菌细胞外液磷含量，推测药物对白念珠菌细胞膜通透性的影响；最后用薄层色谱法观察药物对白色念珠菌细胞膜成分麦角甾醇等合成有无抑制作用。结果药物对白色念珠菌菌丝形成能力的影响由强到弱依次为：苦豆子总碱组、混合组(苦参碱∶槐定碱8∶5)、苦参碱组、槐定碱组、氟康唑组；白色念珠菌对苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱具有较强敏感性且最低抑菌浓度分别是：2.500 mg/mL、3.125 mg/mL、6.25 mg/mL；苦豆子总碱组细胞外磷含量(0.175 2 μg/mL)，混合组(0.147 3 μg/mL)，苦参碱(0.110 1 μg/mL)，槐定碱(0.103 9 μg/mL)，氟康唑组(0.181 4 μg/mL)；由薄层色谱法可知麦角甾醇的斑点由小到大依次为苦豆子总碱组、混合组、苦参碱组、槐定碱组。结论苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱均对白色念珠菌有明显抑菌作用；混合组对白色念珠菌细胞膜成分麦角甾醇合成有明显抑制作用；苦参碱和槐定碱单用时对麦角甾醇合成和细胞膜通透性影响效果没有两药联用效果好。

苦豆子;生物碱类；药理学；念珠菌,白色

关于中药抗真菌实验研究，很多学者都做了大量的研究工作[1-3]。苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)为豆科槐属植物，其别名又称苦干草、苦豆根、苦豆草，广泛分布于西北各地。其有效成分生物碱的含量较高，全草中总生物碱含量为6.11%～8.03%，种子中含量约8.11%，主要含有氧化槐碱、氯化苦参碱、槐定碱、槐果碱、苦参碱、苦豆碱、金雀花碱等20多种[4-5]。大量研究表明,苦豆子生物碱在抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗心律失常、免疫调节等方面具有重要的药理活性和应用前景[6-9]。苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、氧化槐果碱、氧化槐定碱及苦参总碱体外对须癣毛菌、紫色毛癣菌和白色念珠菌有着较好的抑制作用[10-11]。随着白色念珠菌耐药性的慢慢产生,近年来中药成为大家关注中的热点[12-15]。本实验主要探讨中药苦豆子中的苦豆子总碱及其2种主要单体碱(苦参碱、槐定碱)单用和联用对白色念珠菌的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌种 白色念珠菌(ATCC10231)，由温州市康寿生物科技有限公司提供，以沙氏琼脂培养基4 ℃保存。

1.1.2 试剂及仪器 皂化剂[即新鲜配制的含15%氢氧化钠(NaOH)的90%乙醇溶液]。对照品：麦角甾醇(SIGMA-ALDRICH，生产批号：111-02-4)、羊毛甾醇(SIGMA-ALDRICH，生产批号：79-63-0)、角鲨烯(SIGMA，生产批号：57-87-4)，对照品分别用环己烷配成0.25 mg/mL溶液，-20 ℃保存。YX280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器(宁波永兴医疗器械有限公司)，BT22S电子天平(陕西英泽仪器科技有限公司)，303-3电热保温箱(上海阳光实验仪器有限公司)，美国Bio-Tek ELX808IU全自动酶标仪，日本日立CR22GⅡ高速冷冻离心机，2号麦氏比浊管(北京威泰科生物技术有限公司，生产批号：20061114)，移液枪(Gilson，法国)，XDS-IB倒置生物显微镜等。

1.1.3 供试药物与培养基 90%苦豆子总碱，98%苦参碱，98%槐定碱，供试药物均由陕西省宝鸡市万晟生物开发有限公司提供。氟康唑注射液(辰欣药业股份有限公司，国药准字H20140376，生产批号：1307052101，浓度2 mg/mL)。沙氏琼脂培养基(SDA，北京奥博星生物技术有限责任公司，按配方配置，生产批号：20130408)。酵母浸出粉胨葡萄糖(YEPD)培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司，生产批号：20141215)。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的制备 称取YEPD培养基3.5 g，加入100 mL蒸馏水，加热煮沸溶解直至透明，分装于锥形瓶中，121 ℃高压灭菌20 min，4 ℃保存备用。再取沙氏琼脂培养基70 g加入1 000 mL蒸馏水，加热煮沸至透明，115 ℃高压灭菌15 min备用。实验前，将沙氏琼脂培养基取出溶化待用。

1.2.2 白色念珠菌菌丝培养 首先取YEPD培养液18 mL,加入2 mL含10%小牛血清，即为菌丝培养液，待用；再将在沙氏琼脂培养基上传代2次后的白色念珠菌从保温箱中取出，用接种环刮取部分菌落，加入YEPD培养液中，混匀，用2号麦氏比浊管调整菌液的浓度为6×108CFU/mL，作为菌液。实验分6组，分别为空白组、苦参碱组、槐定碱组、苦豆子总碱组、混合组(苦参碱∶槐定碱组8∶5)、氟康唑组。各取上述菌液45 μL于10 mL玻璃管中,用YEPD培养液稀释至3 mL,最终使药物浓度为20 mg/mL,混合均匀后，置6孔板里，在303-3电热保温箱里38 ℃培养48 h。用XDS-1B倒置生物显微镜观察记录白色念珠菌的增殖能力和菌丝形成情况并拍照。

1.2.3 抑菌圈实验 将各生物碱溶于灭菌纯水中，使苦豆子总碱、槐果碱、苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱的浓度分别为200、17、80、200 mg/mL及1 g/mL并-4 ℃保存备用。取实验菌种，用0.9%氯化钠注射液制备菌悬液，菌液的浓度为0.5麦氏单位；将配好的0.5麦氏单位的菌液加入同容积的RPMI(Roswell Park Memorial Institute)-1640培养液配成0.5/2麦氏浓度的菌液。取培养皿倒入沙氏培养基，待冷却后用平板划线法将浓度为1×106CFU/mL的白色念珠菌涂布在培养基表面，在培养基表面中心处放钢管。其下沉后往钢管中加250 μL供试药液；将培养皿放置37 ℃恒温培养箱培养24 h，取出观察菌落生长情况，用十字交叉法测定钢管周围抑菌圈的大小，重复3次。根据药理学试验方法抑菌圈直径<10 mm为抗药；10 mm为轻度敏感；11～15 mm为中度敏感，>16 mm为高度敏感[16]。

1.2.4 噻唑蓝(MTT)微量稀释法测定最低抑菌浓度(MIC) 取无菌96孔酶标板，在A、B、C、D、E行2～12孔中均加入100 μL的RPMI-1640培养液，然后在每排1孔和2孔中分别加100 μL苦豆子总碱、槐果碱、苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱，混匀后取2孔100 μL移至第3孔中，以此类推进行倍比稀释直至第11孔混匀后弃掉100 μL；最后1～12孔中都加入100 μL菌悬液。F行第1孔加200 μL培养基为阴性对照，每排第12孔为阳性对照不含药物。将96孔板放入37 ℃恒温培养箱中培养48 h观察结果，测定其MIC值。

1.2.5 药物对细胞膜磷通透性的测定 根据药敏实验及最低抑菌浓度测定，苦参碱、槐定碱和苦豆子总碱的效果佳且稳定，故后续实验主要测定这些指标。采用磷钼酸比色法，首先精密称取经105 ℃干燥至恒质量的磷酸二氢钾4.39 mg,置250 mL容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,再精密量取上述溶液10 mL加水稀释至100 mL刻度摇匀,即得参比试剂。然后精密量取参比试剂分别为0、1、3、5、7、9 mL,各置25 mL量瓶中,加定磷试剂[水∶3 mol/L 硫酸∶0.25%钼酸铵∶10%维生素C(2∶1∶1∶1)]6 mL,再加水稀释至刻度,摇匀,置45 ℃水浴保温20 min,放冷,以第1瓶为空白对照,在630 nm的波长处测定吸光度,以吸光度与其对应的浓度,计算回归方程。最后将实验分为：苦参碱组、槐定碱组、混合组(苦参碱∶槐定碱8∶5)、苦豆子总碱组、氟康唑组和空白组，除空白组外每组药物的终浓度均为20 g/mL,分别给每组加入YEPD培养基后容积为6 mL即得。再各取白色念珠菌菌株接种于沙氏琼脂培养液中,活化2次，每次48 min,使其处于指数生长后期,取菌与2号比浊管(约6×108CFU/mL)，与配制6组药物分别在50 mL离心管共培养48 h后,3 000 r/min离心10 min。精密量取上清液5 mL,置凯氏烧瓶中加硫酸溶液(1→2)5 mL,用直火缓缓加热,待沸泡停止,加大火力沸腾至溶液呈淡黄色,放冷,滴加过氧化氢溶液数滴,继续加热至几乎无色,再加热15 min,放冷,精密量取5 mL,置25 mL量瓶中,照标准曲线制备时测定方法测得吸光度，由回归方程计算含磷量(μg/mL)。

1.2.6 菌醇成分分析-薄层层析法(TLC)检测 同样将实验分为苦参碱组、槐定碱组、混合组(苦参碱∶槐定碱8∶5)、苦豆子总碱组、氟康唑组和空白组，除空白组外每组药物的终浓度均为20 mg/mL,分别给每组加入YEPD培养基后容积为6 mL即得。再各取白色念珠菌菌株接种于沙氏琼脂培养液中,活化2次，每次48 min,使其处于指数生长后期,取菌与2号比浊管比(约6×108CFU/mL)，与配制6组药物分别在50 mL离心管共培养48 h后,3 000 r/min离心10 min，用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗涤2次至上清液无色,弃上清,称各菌湿质量。各精密称取湿菌约0.5 g于50 mL圆底烧瓶中,加PBS 2.5 mL和新鲜配制的皂化剂6 mL,混匀,80 ℃油浴皂化60 min,加石油醚(沸程30～60 ℃)12 mL提取3次,合并提取液,加饱和食盐水12 mL洗涤3次,醚层于60 ℃水浴挥干,得未皂化脂,加环己烷使溶液容积为1 mg/mL湿菌，-20 ℃保存。最后取对照品及各样品溶液点于高效硅胶板上，在展开剂环己烷∶乙酸乙醋(4∶1)展开8 cm，并用10%硫酸乙醇溶液喷雾,110 ℃显色60 min。

2 结 果

2.1 菌丝的显微观察 真菌菌丝形成能力是与其感染能力相关的毒力因子有关。5组药物对白色念珠菌菌丝形成能力的影响由强到弱依次为：苦豆子总碱组、混合组(苦参碱∶槐定碱8∶5)、苦参碱组、槐定碱组、氟康唑组。白色念珠菌在含胎牛血清的YEPD培养液中培养,可产生菌丝相和酵母相,在苦参碱、槐定碱、苦豆子总碱的作用下，均能抑制白色念珠菌菌丝的形成，只表现酵母相,并且白色念珠菌的增殖能力也受到抑制,氟康唑组白色念珠菌主要表现酵母相,但仍有少量的假菌丝产生，空白组可获得较纯的白色念珠菌(见图1)。

2.2 抑菌圈试验可判定白色念珠菌对生物碱具有敏感性 测得苦豆子总碱、槐果碱、苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱对白色念珠菌的抑菌圈直径分别为(30.1±0.1)mm(高度敏感)、无、(25.1±0.1)mm(高度敏感)、(20.2±0.2)mm(高度敏感)、无，即苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱对白色念珠菌具有强敏感性。

苦参碱组 槐定碱组 混合组(苦参碱∶槐定碱8∶5)

苦豆子总碱组 氟康唑组 空白组

图1 白色念珠菌菌丝形成情况

2.3 利用MTT法可判定MIC值 白色念珠菌MIC：苦豆子总碱2.500 mg/mL、苦参碱3.125 mg/mL、槐定碱6.25 mg/mL，氧化苦参碱和槐果碱没有测出MIC，表明氧化苦参碱、槐果碱几乎无抑菌效果，苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱对白色念珠菌抑菌效果较明显。

2.4 药物对细胞膜磷通透性的影响 测得1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL磷标准液的吸光度，得标准曲线。苦豆子中的生物碱抑制白色念珠菌，使其细胞膜磷通透性增强，细胞内容物外泄，则可以对比细胞外液中磷的含量，推断苦豆子中生物碱抑制白色念珠菌强弱。由白色念珠菌细胞外磷含量吸光度计算真菌细胞外磷含量。从图2可知，苦豆子总碱组细胞外磷含量(0.175 2 μg/mL)与阳性对照氟康唑组(0.181 4 μg/mL)的细胞外磷含量相似，且明显高于空白组(0.085 2 μg/mL)，则推测苦豆子总碱组使细胞膜通透性增强从而达到抑制白色念珠菌的作用；混合组(0.147 3 μg/mL)低于氟康唑组，则抑菌作用相对于苦豆子总碱组弱些，但高于苦参碱组、槐定碱组；苦参碱(0.110 1 μg/mL)、槐定碱(0.103 9 μg/mL)抑菌作用较弱且相似，但均高于空白组。

2.5 菌醇成分分析-TLC检测 菌醇成分分析-TLC检测结果见图3。通过薄层色谱,能较好分离白色念珠菌中的各个成分,且能直接通过肉眼观察,根据各个成分的斑点大小来判断药物的抑菌的强弱。各组的薄层色谱图中麦角甾醇、角鲨烯、羊毛甾醇的变化进一步说明抑菌强弱情况，麦角甾醇斑点由小到大排列顺序为氟康唑组、苦豆子总碱组、混合组、苦参碱组、槐定碱组、空白组，羊毛甾醇斑点小到大排列顺序为空白组、槐定碱组、苦参碱组、混合组、苦豆子总碱组、氟康唑组，角鲨烯斑点由小到大排列顺序和麦角甾醇一样。表明氟康唑、苦豆子总碱对白色念珠菌的抑菌作用较为显著，槐定碱、苦参碱的抑菌作用相对较弱。

图2 白色念珠菌细胞外磷含量

1 苦参碱组 2 槐定碱组 3 混合组 4 苦豆子总碱组 5 氟康唑组 6 空白组

3 讨 论

苦豆子还具有抗炎、病毒及抗肿瘤等作用。本研究主要是通过体外实验观察药物对白色念珠菌的影响，为后期的机制研究提供依据。实验中发现，在苦参碱、槐定碱、苦豆子总碱、氟康唑的作用下,白念珠菌菌丝的形成能力受到抑制,进而抑制白色念珠菌的增殖能力，达到抑菌作用。然后通过观察测定苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱、苦参碱和槐定碱混合物等各生物碱对白色念珠菌的抑制作用。一般情况下，MIC值越小，说明越敏感，其抗菌药物作用越强，抑菌效果显著，通过药敏实验和最低抑菌浓度的测定，可发现苦豆子总碱组、苦参碱组、槐定碱组及混合组具有稳定的抑菌作用，进而测定了槐定碱组、苦参碱组、苦豆子总碱组及其混合组的细胞膜磷通透性和菌醇成分，研究了3种生物碱及其混合组对白色念珠菌的作用。苦豆子生物碱对白念珠菌细胞膜通透性的结果是：苦豆子总碱组通透性强于混合组，混合组又强于单独用药组(即苦参碱组、槐定碱组)。薄层色谱中麦角甾醇斑点由小到大排列顺序为苦豆子总碱组、混合组、单独用药组，则说明苦豆子总碱、苦参碱、槐定碱、苦参碱和槐定碱以8∶5混合的4组苦豆子生物碱对白念珠菌细胞膜成分麦角甾醇合成有抑制作用，细胞膜结构破坏，抑制真菌细胞生长，角鲨烯会随羊毛甾醇累积而增加，与文献报道结果基本一致[15]，进而导致细胞膜通透性增大，细胞内容物外泄，细胞外液中磷的浓度增加，细胞结构破坏，麦角甾醇合成受阻。其他作用机制还有与胞膜脂质双分子层中的麦角甾醇和胆固醇结合，形成微孔，最终导致细胞崩解，从而达到抑制真菌的作用。实验结果表明，苦参碱和槐定碱单用时对麦角甾醇和细胞膜通透性影响没有两药联用效果好。

由于时间等问题TLC实验是只做了定性试验，未能做麦角甾醇等斑点大小的定量试验。下一步试验可用薄层扫描仪进行麦角甾醇、羊毛甾醇及角鲨烯定量测定。此次实验为苦豆子抗白色念珠菌的活性及机制的后续研究提供了实验依据，为其进一步开发利用奠定了良好的基础。

[1] 徐文晖,李兴从.抗真菌天然化合物研究进展[J].中草药,2011，42(5)：1009-1017.

[2] 徐云辉,张帅,张念,等.土荆皮抗真菌化学成分研究[J].中草药,2012,43(2)：220-222.

[3] 周万青，沈瀚，张之烽,等.白念珠菌临床分离调查及基因分型研究[J].中国真菌学杂志，2012，7(1):20-23.

[4] 杨巧丽，顾政一,黄华.中药苦豆子的研究进展[J].西北药学杂志，2011，26(3):232-234,封3,封4.

[5] 张为民,张彦明,张涛,等.苦豆子生物碱抑菌抗炎作用研究[J].动物医学进展,2005,26(10):82-85.

[6] 邱天尧，赵宏英.苦豆子类生物碱的药理作用研究[J].黑龙江医药，2007，20(5):508-509.

[7] 刘军锋,丁泽,欧阳艳,等.苦豆子生物碱抗菌活性的测定[J].北京化工大学学报:自然科学版,2011,38(2):84-88.

[8] 李艳艳,冯俊涛,张兴,等.苦豆子化学成分及其生物活性研究进展[J].西北农业学报,2005,14(2):133-136,140.

[9] 刘静，罗维林.苦豆子生物碱现代药学研究进展[J].海峡药学，2014,26(9):1-4.

[10] 吴岚，周曾同，周永梅,等.苦参碱对白色念珠菌生物膜的体外抑制作用[J].上海口腔医学，2009，18(4):415-418.

[11] 赵靖霞.抗真菌药物的筛选及作用机制研究[D].上海：第二军医大学，2005.

[12] 郑玉荣，刘涛峰，张虹亚,等.中药成分抗白念珠菌的实验研究进展[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2011,10(6):399-400.

[13] 朱丹婷,李景,俞立英.白念珠菌致病性研究进展[J].中国真菌学杂志,2015,10(1)：54-58.

[14] 刘丽英，刘涛，毕文超,等.白色念珠菌的生长曲线和世代时间测定[J].武警医学院学报，2009,18(3):230-231.

[15] Wan CX,Luo JG,Ren XP，et al.Interconverting flavonostilbenes with antibacterial activity from Sophora alopecuroides[J].Phytochemistry,2015,116(1):290-297.

[16] 孙茜,左国营,郝晓燕,等.22种中草药提取物体外抗菌实验研究[J].贵阳医学院学报,2015,40(2):125-129.

Inhibitoryeffectsoftotalalkalodidofsophoraalopecuroideanditsmonomeroncandidaalbicans

LVJiaojiao,ZHOUKai,LIHao,etal.

2015-GradeMasterofShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,ShanxiXianyang712046

ObjectiveTo compare and observe the inhibitory effects of total alkaloids of sophora alopecuroide, matri ne, sophoridine use single and combined on candida albicans.MethodsThe fungal hyphae formation was observed through the culture of candida albicans, and the drug sensitivity was detected by antibacterial circle experiment. Then the minimum inhibitory concentration was determined by MTT assay. Absorbance was measured by phosphomolybdic acid colorimetric method to determine the extracellular liquid phosphorus content of candida albicans, and speculate the effects of drugs on cell membrane permeability of candida albicans. Finally, the drug whether had inhibition effects on composition of ergosterol of candida albicans cell membrane were observed by thin layer chromatography.ResultsThe influences of the drug on the formation of candida albicans mycelia from strong to weak in turn: the total alkaloids of sophora alopecuroide, the mixed group (matrine:sophoridine, 8∶5), matrine group, sophoridine group, Fluconazole group. Candida albicans had strong sensitivity on sophora alopecuroide, matrine, sophoridine, and the minimum inhibitory concentrations were as follows: 2.500 mg/mL, 3.125 mg/mL, 6.25 mg/mL. The extracellular liquid phosphorus content in total alkaloid of sophora alopecuroide was 0.175 2 g/mL, in the mixed group was 0.147 3 μg/mL, in the matrine was 0.110 1 μg/mL, and in the sophoridine was 0.103 9 μg/mL, in the fluconazole group was 0.181 4 μg/mL.By thin layer chromatography, the ergosterol spots from small to large were as follows: total alkaloid of sophora alopecuroide, mixed group (as above), matrine group, sophoridine group.ConclusionThe total alkaloids of sophora alopecuroide, matrine and sophoridine have obvious antibacterial activity against candida albicans. The matrine combine with sophoridine has obvious inhibitory effects on composition of ergosterol of candida albicans cell membrane. The effects of combination of the two drugs were better than the single use of matrine and sophoridine.

Sophora alopecuroide; Alkaloids; Pharmacology; Candida;Albicans

实验研究

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.11.024

R282.710.5;R379.4

A

1002-2619(2017)11-1695-05

※ 项目来源：陕西省2014年省级大学生创新创业训练计划项目(编号：1573)

△ 通讯作者:陕西中医药大学药理教研室，陕西 咸阳 712046

吕姣姣(1989—)，女，硕士研究生在读。研究方向：中药防治脑血管病及抗感染的研究。

2017-06-13)

董军杰)