槐定碱抑制人胶质瘤U87MG细胞株增殖及其作用机制研究

王文鑫 陈少伟 廖圣芳 余锦刚 陈汉民

(1解放军第180医院神经外科，福建 泉州 362000; 2解放军总医院神经外科，北京 100853)

槐定碱抑制人胶质瘤U87MG细胞株增殖及其作用机制研究

王文鑫1, 2陈少伟1廖圣芳1余锦刚1陈汉民1*

(1解放军第180医院神经外科，福建 泉州 362000;2解放军总医院神经外科，北京 100853)

目的探讨槐定碱抑制人胶质瘤U87恶性胶质瘤(U87MG)细胞株增殖作用及其相关机制。方法将各个浓度的槐定碱加入到人胶质瘤U87MG细胞株中，应用四唑氮盐比色法测定槐定碱对肿瘤细胞生长的抑制作用，流式细胞仪测定槐定碱对U87MG细胞凋亡和细胞周期的变化，生化检验测定肿瘤细胞内活性氧簇(ROS)和谷胱甘肽(GSH)含量，实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹法分别检测肿瘤相关基因mRNA表达和蛋白表达的变化，荧光素酶报告基因法检测肿瘤细胞中泛素-蛋白酶体、叉头盒蛋白 M1(FoxM1)、核转录因子kappa B(NF-kb)、激活子蛋白-1(AP-1)的活性的变化。结果槐定碱能够显著抑制细胞增殖，阻滞细胞周期在G2/M期；诱导细胞凋亡，引起ROS产生和GSH含量减少；促使p27、周期蛋白依赖性激酶2、Survivin、Livin、B淋巴细胞瘤-2、E2启动子结合细胞因子1等基因表达下调，同时上调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/8、p53、线粒体来源的第2个半胱氨酸蛋白酶激活剂、c-Jun氨基末端激酶和p38-丝裂原活化蛋白激酶等基因的表达；显著抑制泛素-蛋白酶体活性和FoxM1、NF-kb、AP-1的转录活性。结论槐定碱可能通过诱导细胞凋亡和ROS积聚，激活线粒体信号通路来发挥抗肿瘤活性。槐定碱能够作为一种新的药物来治疗胶质瘤。

胶质瘤; U87恶性胶质瘤; 细胞凋亡; 槐定碱

槐定碱是一个从豆科槐属中的苦豆子提起出来的单分子构造的生物碱。使用基于细胞的小分子筛查方法，发现槐定碱能够选择性地杀死肿瘤细胞而不会伤害正常细胞，这归因于槐定碱增加细胞内活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)水平和提高细胞凋亡的作用[1-2]。进一步研究显示槐定碱通过抑制泛素-蛋白酶体来抑制肿瘤细胞[3]。因此，槐定碱是一种潜在的具有较高实际应用价值的天然抗肿瘤药物。但目前关于槐定碱作用于脑胶质瘤的研究很少。因此本研究主要研究槐定碱对人类胶质瘤U87恶性胶质瘤(U87 malignant glioma, U87MG)细胞的抑制作用，并且在氧化应激和泛素-蛋白酶体的抑制作用方面进行深入的研究。

材料与方法

一、主要试剂和仪器

人胶质瘤U87MG细胞株(北京中尚博奥生物技术有限公司)；槐定碱(Sigma公司)；细胞培养基(Sigma公司)；四唑氮盐[3-(4,5-dimethylthiazol-zyl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazoliuzolium, inner salt, MTS]试剂盒、细胞周期和凋亡检测试剂盒、应该蛋白酶体底物、ROS检测试剂盒、单克隆检测抗体、增强化学发光免疫印迹底物试剂盒(Abcam公司)；流式细胞仪(BD公司)；酶标仪(Bio-Rad公司)。

二、细胞培养

U87MG细胞株培养于10 cm培养皿中，放在包含5% CO2和饱和湿度的37 ℃保温箱中。培养基为90% F-12K和10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)。0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸用来消化和传代。在所有实验中使用对数生长期的细胞。

三、MTS比色法检测槐定碱对肿瘤细胞的抑制作用

对数生长期细胞以3×104～4×104个/mL、100 μL/孔种植在96孔微孔板里，培养过夜使细胞粘附。然后将各个浓度的槐定碱(0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/mL)加入到相应的孔内持续培养24 h。当移除培养基后，根据试剂盒说明书加入MTS试剂。最后，使用酶标仪在490 nm波长下测量光密度(optical density, OD)值，用来计算药物对细胞的抑制率。抑制率=(1-实验组的OD值/对照组的OD值)×100%。对应的抑制曲线用槐定碱的对数浓度作为横坐标、抑制率作为纵坐标来绘制。相当于50%抑制率所对应的浓度为半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)值。

四、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期

对数生长期的肿瘤细胞接种在6孔板持续培养24 h。磷酸缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)或1 mg/mL、2 mg/mL的槐定碱加入到实验孔连续培养24 h。获得胰蛋白酶消化和碘化丙啶/膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素染色后的细胞。用流式细胞仪检测凋亡细胞。

五、生化检验测定ROS和GSH含量

U87MG种在6孔板，培养过夜使细胞粘附。然后加入0.5 mg/mL、1 mg/mL的槐定碱和作为对照的PBS，连续培养24 h。用荧光探针2', 7'-二氯荧光黄双乙酸盐检测ROS。此外，为了检测谷胱甘肽(glutathione, GSH)，用蛋白免疫印迹法(Western Blot)的细胞裂解缓冲液来裂解细胞。所有特殊的实验遵照试剂盒说明书。

六、RT-PCR检测肿瘤相关基因mRNA表达的改变

U87MG种在6孔板，培养过夜使细胞粘附。然后加入0.5 mg/mL、1 mg/mL的槐定碱和作为对照的PBS，连续培养24 h。获得细胞，提取总的mRNA。用实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction, RT-PCR)法检测mRNA的表达。用β-actin作为内部参考。

七、Western Blot检测肿瘤相关的基因蛋白表达的变化

U87MG种在6孔板，培养过夜使细胞粘附。然后加入0.5 mg/mL、1 mg/mL的槐定碱和作为对照的PBS，连续培养24 h。获得细胞，提取蛋白。运用BCA分析法测定溶解产物中的蛋白含量。取等量蛋白用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法来分离并转移到聚偏二氟乙烯膜上，用相应的单克隆抗体[p27、周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinases2, CDK2)、Survivin、Livin、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、E2启动子结合细胞因子1(E2-promoter binding factor, E2F1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/8(cysteinyl aspartate-specific protease-3/8, caspase-3/8)、p53、线粒体来源的第2个半胱氨酸蛋白酶激活剂(second mitochondria derived activator of caspase, Smac)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, c-JNK)和p38-丝裂原活化蛋白激酶(p38-mitogen-activated protein kinase, p38-MAPK)]在室温下孵化4 h，检测目标蛋白含量。用β-肌动蛋白(β-actin)作为内部参考。

八、检测肿瘤细胞中泛素-蛋白酶体、叉头盒蛋白、核转录因子、激活子蛋白-1的活性

对数生长期的肿瘤细胞种在96孔板持续培养24 h。泛素-G76V-黄色荧光蛋白(ubiquitin-G76V-yellow fluorescent protein, Ub-G76V-YFP)质粒(加入基因)用来检测细胞内泛素-蛋白酶体活性，叉头盒蛋白M1(forkhead box M1, FoxM1)、核转录因子kappa B(nuclear transcription factor kappa B, NF-κb)、激活子蛋白-1(activator protein 1, AP-1)的荧光素酶质粒用来检测它们的转录活性。每个孔加入5 ng的质粒后，用转染剂(Life Science)来辅助转染24 h。洗掉未转染的质粒，更换新鲜的培养基。接着PBS、0.5 mg/mL和1 mg/mL的槐定碱加入到各自的实验孔持续培养24 h。最后用荧光酶标仪检测每个孔内的黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)的荧光强度。

九、统计分析

结 果

一、槐定碱显著抑制U87MG细胞的生长

槐定碱作用于体外U87MG细胞24 h后，用MTS比色法来评估其抑制作用。实验结果显示，槐定碱具有明显的抑制效果。24 h的平均IC50是5.3 mg/mL(图1)。

图1 各个浓度的槐定碱(0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/mL)对U87MG细胞增殖的抑制作用

Fig 1 The inhibitory effect of sophoridine at different concentrations (0, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 and 10.0 mg/mL) on U87MG cell proliferation

二、槐定碱显著增强细胞凋亡和阻滞U87MG细胞在G2/M期

实验结果显示， 1 mg/mL和2 mg/mL的槐定碱都能明显诱导肿瘤细胞凋亡(P<0.01)，1 mg/mL的槐定碱主要引起早期的细胞凋亡，而2 mg/mL的槐定碱更多地诱导晚期细胞凋亡(见图2A和图2B)。在0.5 mg/mL和1 mg/mL的槐定碱的作用下，细胞周期显著改变(P<0.05)，细胞周期被阻滞在G2/M期(图2C、2D)。

三、槐定碱诱导U87MG细胞里ROS产生，同时引起GSH含量的减少

由于槐定碱一个主要的抗肿瘤作用的机制是诱导细胞产生ROS[2,4]，因此本研究评估了槐定碱是否能够增加细胞内ROS水平。结果显示，相比PBS，0.5 mg/mL、1 mg/mL的槐定碱显著增加U87MG细胞内ROS水平(P<0.05)，且1 mg/mL的槐定碱增加更明显；进一步的研究显示，0.5 mg/mL、1 mg/mL的槐定碱使能够清除ROS的GSH的浓度下降(P<0.05)，1 mg/mL的槐定碱下降更明显，这进一步放大了ROS的作用。

四、槐定碱调节U87MG细胞内的肿瘤相关基因表达

为了进一步研究槐定碱诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞的机制，我们检测了相关基因的变化。结果显示，槐定碱在蛋白水平和mRNA水平显著下调了p27、CDK2、Survivin、 Livin、Bcl-2和E2F1等基因的表达，同时上调了caspase-3/8、p53、Smac、c-JNK和p38-MAPK等基因的表达(图3A、B)。研究也发现了槐定碱下调了FoxM1、NF-κb和AP-1的转录水平，这些是关键的肿瘤相关的信号通路的转录因子(图3C)。

五、槐定碱抑制U87MG细胞内泛素-蛋白酶体活性

因为Ub-G76V-YFP在正常环境下被细胞内泛素-蛋白酶体持续分解，没有或者只有很微弱的YFP蛋白的荧光能够被检测到。但如果泛素-蛋白酶体被抑制，导致细胞内Ub-G76V-YFP积聚，细胞内的YFP荧光将得到增强。实验结果显示槐定碱治疗组荧光强度比对照组显著提高，暗示着槐定碱明显抑制肿瘤细胞内泛素-蛋白酶体(图4)。

图2 槐定碱诱导U87MG细胞凋亡和细胞周期阻滞

Fig 2 Sophoridine induced cell-cycle arrest and apoptosis in U87MG cells

A: 1 mg/mL and 2 mg/mL sophoridine exposure in U87MG cells assessed by Annexin V-fluorescein isothiocyanate and propidium iodide (PI) double staining and fluorescence-activated cell sorter analysis; B: The percentage of apoptotic cells in U87MG cells; C: Cells were treated with 0.5 mg/mL and 1 mg/mL sophoridine for 24 h. PI staining was used to analyze the cell cycle distribution; D: Cell cycle distribution of U87MG cells.

aP<0.01,vscontrol group.

图3 槐定碱调节U87MG细胞内肿瘤相关基因表达

Fig 3 Sophoridine regulated tumor-related gene expression in U87MG cells

A: Immunoblotting assay was used to measure the expression of tumor-related gene in protein level; B: Real-time PCR assay was used to measure the expression of tumor-related gene in mRNA level; C: Report gene assay for the transcriptional activity of FoxM1, NF-κb and AP-1.

aP<0.01,vscontrol group;bP<0.05,vscontrol group.

图4 槐定碱抑制U87MG细胞内泛素-蛋白酶体活性

Fig 4 Sophoridine inhibited ubiquitin-proteasome activity in U87MG cells

aP<0.01, control group;bP<0.05,vscontrol group.

讨 论

槐定碱是从中草药中获得的天然产物，具有广泛的药理作用，近年来发现具有抗肿瘤作用，能诱导体内和体外各种肿瘤细胞凋亡及坏死[5-7]。在本实验中，我们研究槐定碱对人胶质瘤U87MG细胞是否具有抑制作用及其作用机制。

我们用MTS比色法检测槐定碱是否能够抑制U87MG细胞增殖，测量到IC50为5.3 mg/mL，这和文献报道的槐定碱对其它肿瘤的抑制强度相似[8-9]。在随后的实验中为了阐明槐定碱介导的抑制肿瘤生长的模式，我们检测肿瘤细胞的凋亡和细胞周期分布。结果显示较高浓度(1、2 mg/mL)的槐定碱显著增强细胞凋亡，而较低浓度(0.5、1 mg/mL)的槐定碱阻滞肿瘤细胞周期在G2/M期。用Western Blot来进一步研究槐定碱介导的肿瘤抑制的分子机制。我们发现，在线粒体相关的凋亡通路中的抗凋亡蛋白，如Survivin、Livin、Bcl-2和E2F1，明显下调，而caspase-3/8、p53、Smac则明显上调。这提示线粒体通路在槐定碱介导的细胞凋亡中起到重要的作用。此外，Western Blot检测也提示了肿瘤细胞内的p27和CDK-2在槐定碱治疗后显著下降。在肿瘤细胞进入到有丝分裂后，p27和CDK-2是关键的调节蛋白，这提示槐定碱通过下调p27和CDK-2，阻滞肿瘤细胞在G2/M期。这些结果与槐定碱治疗前列腺肿瘤的机制一致[10]。

目前认为槐定碱一个主要的抗肿瘤的作用机制是诱导肿瘤细胞产生能够杀死肿瘤细胞核诱导肿瘤细胞凋亡的ROS。在本研究中，我们也发现在治疗后的U87MG细胞中，ROS水平明显增加，清除ROS的GSH水平明显下降，这进一步放大ROS在肿瘤细胞中的作用。而且，槐定碱也能够下调Bcl-2和survivin的表达来促进肿瘤细胞凋亡[4]。在一些关键信号通路中关于关键蛋白和重要转录因子的研究中，我们发现槐定碱上调c-JNK和p38-MAPK信号通路的活性，这两个通路活性的提高能够抑制细胞周期，从而抑制肿瘤细胞生长[11]。实际上，JNK和p38信号通路能够发挥更广泛的作用。一些报道显示，槐定碱能够通过激活脑胶质瘤细胞里的JNK和p38上调细胞内活性自由基，下调FoxM1、NF-κb和AP-1的转录活性，从而杀死肿瘤细胞。

泛素-蛋白酶体在控制多种细胞内蛋白的含量、活性和位置中起到关键的作用[12]。在大多数肿瘤细胞中能够观察到，泛素-蛋白酶体被不正常地激活，导致一些肿瘤抑制基因如p53的快速降解和失活。因此靶向的泛素-蛋白酶体是一个潜在的抗肿瘤治疗[13]。一种已经研发出来的这种蛋白酶体的抑制剂硼替佐米，已经成功地应用于淋巴瘤和骨髓瘤的治疗中。目前已经发现天然产物包括槐定碱，能够在肿瘤细胞中抑制泛素-蛋白酶体[14]，这就提供了一个阐明槐定碱抗肿瘤作用机制的新观点。同样地，本研究也显示槐定碱显著抑制胶质瘤细胞U87MG中的泛素-蛋白酶体活性。我们的结果也提示泛素-蛋白酶体的抑制伴随着ROS的升高。因此，泛素-蛋白酶体活性的抑制是槐定碱诱导的肿瘤细胞中的ROS升高原因的的更深的分子机制水平。

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SophoridineinhibitsproliferationofhumangliomaU87MGcelllineanditsmechanism

WANGWenxin1, 2,CHENShaowei1,LIAOShengfang1,YUJingang1,CHENHanmin1

1DepartmentofNeurosurgery,The180thHospitalofPLA,Quanzhou362000;2DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofPLA,Beijing100853, China

ObjectiveThe effect and mechanism of sophoridine on proliferation inhibition in human U87 malignant glioma (U87MG) cell line were investigated.MethodsSophoridine at different concentrations were added into human neuroglioma U87 line cells. 3-(4,5-dimethylthiazol-zyl)-5-(3- carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazoliuzolium, inner salt assay was employed to detect the inhibitory effect of sophoridine in tumor cells, flow cytometry to detect apoptosis and cell cycle, and biochemical assay to determinate intracellular reactive oxygen species (ROS) and glutathione (GSH) contents, real time-polymerase chain reaction to detect the changes in tumor-related gene mRNA expression, Western Blot to detect the changes in tumor-related gene protein expression, and luciferase report gene assay to detect the activity of ubiquitin-proteasome, forkhead box M1 (FoxM1), nuclear transcription factor kappa B (NF-κb) and activator protein 1 (AP-1) in tumor cells.ResultsSophoridine significantly inhibited the cell proliferation, G2/M phase arrest, induced cell apoptosis and caused ROS generation and GSH content reduction. Sophoridine also triggered significantly the down-regulating of the expression of p27, cyclin-dependent kinases2, Survivin, Livin, B-cell lymphoma-2, E2-promoter binding factor and the transcriptional activity of FoxM1, NF-κb and AP-1, meanwhile, up-regulating of the expression of cysteinyl aspartate-specific protease-3/8, p53, second mitochondria derived activator of caspase, c-Jun N-terminal kinase and p38-mitogen-activated protein kinase. Sophoridine significantly inhibited the activity of ubiquitin-proteasome in tumor cells.ConclusionSophoridine shows obvious anti-cancer activity on glioma cells by inducing cell apoptosis, ROS accumulation, and activating mitochondrial signal pathways. Sophoridine can be used as a new drug for the treatment of glioma.

Glioma; U87MG; Cell apoptosis; Sophoridine

1671-2897(2017)16-207-05

王文鑫，主治医师，博士，E-mail: wangwx_2012@163.com

*通讯作者： 陈汉民，主任医师，E-mail: qz180chm@sina.com

R 742.1

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2016-09-01；

2016-12-20)