大鼠股骨Masquelet诱导膜实验模型的建立

曾志奎，黄枫，黄培镇，李悦，蔡群斌，周琦石，姜自伟，李定，郑升鹏

(1广州中医药大学，广州510405；2广州中医药大学第一附属医院)

·论著·

大鼠股骨Masquelet诱导膜实验模型的建立

曾志奎1，黄枫2，黄培镇2，李悦2，蔡群斌2，周琦石2，姜自伟2，李定1，郑升鹏1

(1广州中医药大学，广州510405；2广州中医药大学第一附属医院)

目的建立一种用于研究Masquelet诱导膜的SD大鼠股骨实验模型。方法选取雄性SD大鼠24只，随机分为观察组和对照组各12只。两组均在股骨中段取出4 mm骨块，均采用钢板固定，观察组置入PMMA骨水泥块，对照组不置入骨水泥块。统计两组术后进食、排便、行走、切口愈合及并发症发生情况。造模4周时分别采集观察组PMMA骨水泥块周围诱导膜组织及对照组截骨区诱导膜组织进行HE染色，观察组织病理学变化；对两组术肢拍摄X线片，观察截骨断端对位情况，以及钢板、螺钉在位情况。结果两组术后均能正常进食及排便，术后第2天均可正常行走，切口均愈合良好、未见感染。观察组1只大鼠术后出现术肢持续肿胀、膝关节活动受限。观察组诱导膜组织中含有大量细胞，形成丰富血管网及平行于PMMA骨水泥块的纤维组织；对照组诱导膜中所含血管明显少于观察组。两组截骨断端对位、对线均良好，钢板及螺钉均在位、无松脱。结论成功建立了用于研究Masquelet诱导膜的SD大鼠股骨实验模型。

骨缺损；诱导膜；Masquelet技术；大鼠

严重创伤、骨感染、慢性骨髓炎、骨不连、骨肿瘤保肢节段性切除等各种原因均可导致大段骨缺损。大段骨缺损治疗难度大，带血管腓骨移植、外支架骨搬运、自体髂骨移植等传统治疗方法均有不足[1～4]。2000年法国医生Masquelet提出了“诱导膜”的概念即诱导膜技术，该技术是在骨缺损处填充PMMA骨水泥块，4～6周骨水泥块周围形成诱导膜后，取出填充物植骨，有望应用于治疗大段骨缺损[5]。为深入研究诱导膜技术用于治疗负重肢体骨缺损的可行性，建立精确、可重复性强的实验模型至关重要。国内文献对诱导膜实验模型报道甚少，国外文献亦鲜有关于诱导膜模型精确截骨的描述。我们于2016年10月进行本研究，拟建立一种用于研究Masquelet诱导膜的SD大鼠股骨实验模型。现将制模过程及结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物：SPF级成年雄性SD大鼠24只，鼠龄 8～10周，体质量260～280 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(粤)2013-0020。大鼠分笼饲养，4只/笼，温度24～26 ℃，相对湿度50%～70%，光照时间昼14 h、夜10 h，自由进水及饮食，1周后用于实验。②器材：自制不锈钢大鼠股骨截骨导板及自制不锈钢6孔钢板(图1)，1.5 mm皮质骨自攻螺钉(江苏苏州悦来医疗器械有限公司)、0.42 mm超细金刚砂锯条(河北唐山鑫诚五金机电有限公司)，定制 0.5 mm克氏针(天津希翼瑞丰医疗器械有限公司)，JJ-12J组织脱水机、JB-P5生物组织包埋机(武汉俊杰电子有限公司)，Leica Autostainer XL自动染色机(Leica Biosystems，德国)，Nikon Eclipse CI正置光学显微镜(Nikon，日本)。

注：A为截骨导板，长15.37 mm、宽6 mm、高6 mm、厚1 mm，凹槽深5 mm；B为6孔钢板，长22.5 mm、宽3.5 mm、厚1 mm。

图1自制大鼠股骨钢板及截骨导板

1.2 动物分组及处理 将大鼠随机分为观察组和对照组，每组12只。两组禁食24 h、不禁水， 5%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.8 mL/100 g)；取左侧卧位，右腿备皮，75%乙醇消毒术区；股骨外侧皮肤纵行切口，切开皮肤及筋膜，于股外侧肌及股二头肌肌间隙进入，钝性分离，自股骨大转子至股骨髁显露股骨外侧面；放置6孔不锈钢钢板，调整好位置，使其位于股骨外侧面中心，远近端各钻入两枚克氏针临时固定；将第2、5两孔的克氏针穿过截骨导板孔后放置截骨导板于钢板上方，助手用两把弯钳固定导板并维持股骨位置，将线锯穿过导板凹槽分别行远近端截骨至股骨高度2/3，不完全截断；拔出第1孔的克氏针，钻孔，螺钉固定，第6孔同前；取出截骨导板，再拔出第2孔的克氏针，钻孔，螺钉固定，第5孔同前；钢板完全固定后，重复上述步骤将股骨远近端完全截断，取出4 mm骨块。将两根1-0丝线穿过钢板第3、4孔，观察组在骨缺损区卡入PMMA骨水泥块，丝线捆绑固定防止骨水泥块移位，对照组不放置骨水泥块。生理盐水冲洗术区，采用强生 4-0Vicryl可吸收缝线依次缝合肌肉、深筋膜，1-0 丝线缝合皮肤。术后连续5天每日给予青霉素(青霉素钠，华北制药股份有限公司，160万U/瓶，国药准字 H13020655)8万U肌内注以预防感染。术后禁水、禁食12 h，完全负重活动，单笼饲养4天至皮肤切口基本愈合后合笼。

1.3 相关指标观察 ①一般情况：观察两组术后进食、排便、行走、切口愈合情况，统计术后4周内并发症发生情况。②诱导膜组织病理学观察：造模4周时分别采集观察组PMMA骨水泥块周围及对照组截骨区的诱导膜组织，10%甲醛固定48 h，脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋，组织切片机切取 5 μm厚薄片，常规HE染色，显微镜下观察组织病理学变化。③截骨断端影像学表现：造模4周时对两组术肢拍摄X线片，观察截骨断端对位情况以及钢板、螺钉在位情况。

2 结果

2.1 两组一般情况 两组术后均能正常进食、排便，术后第2天均可正常行走，切口均愈合良好、未见感染。观察组术后1只大鼠术肢持续肿胀、膝关节活动受限。

2.2 两组诱导膜组织病理学改变 观察组诱导膜组织中含有大量细胞，形成丰富的血管网及平行于PMMA骨水泥块的纤维组织；对照组诱导膜中所含血管明显减少。

2.3 两组截骨断端影像学表现 术后4周时两组截骨断端对位、对线均良好，钢板及螺钉均在位、无松脱。

3 讨论

目前，临床治疗节段性骨缺损的方法主要有带血管腓骨移植、外支架骨搬运、自体髂骨移植等，但带血管腓骨移植需局部显微外科技巧、易损伤神经血管；外支架骨搬运治疗周期长，易导致针眼感染、对接端骨不连；自体髂骨移植供区骨量有限，可导致感染、血肿形成等[1～4]。Moghaddam等[6]报道，诱导膜技术可用于治疗大段骨缺损。但随着Masquelet诱导膜技术的发展，暴露出骨源不足、骨爬行替代慢等问题；与骨组织工程技术有效结合可能是解决Masquelet诱导膜技术上述不足的途径[6～8]。建立稳定的诱导膜动物模型是研究其应用的前提。既往报道的诱导膜动物模型存在截骨长度难掌控、固定物不牢靠、操作困难等问题[9,10]。故有必要建立一种稳定、操作简单的诱导膜实验模型。

能否做到精确至毫米的截骨是影响诱导膜模型制模效果的重要因素。目前多数研究采用SD大鼠建立诱导膜模型，但大鼠骨骼细小，做到精确截骨非常困难。传统先用克氏针打孔再截骨的方法往往容易导致骨骼劈裂甚至造模失败。本课题组自行设计了截骨导板，并与钢板有效结合，截骨端非常整齐，范围精确，且操作方法容易掌握。

既往研究中对诱导膜骨缺损模型固定的方法主要有钢板、髓内钉、外支架、克氏针等[11～13]。Zhao等[13]采用单边外支架成功制备了SD大鼠股骨极限骨缺损模型，经12周观察未见松动迹象，认为这种外支架能为负重部位极限骨缺损的早期活动提供稳定性保证。但外支架可导致针眼感染、周围组织激惹等并发症；同时，大鼠负重时外支架中不同克氏针的应变将导致其周围骨质承受不同的应力，一旦这种应力达到极限可能导致局部骨溶解，引起外支架松动。Wingerter等[14]对比钢板和克氏针固定SD大鼠股骨临界骨缺损模型的效果，造模4周拆除内固定物，组织学显示克氏针组呈现出特有的纤维愈合模式，只有少量新生骨痂形成，固定的机械性不稳定引起微动是纤维愈合产生的原因；钢板组出现自缺损远近端向中心生长的自然内向性新生骨痂，源于钢板固定的临界骨缺损模型为骨愈合提供了稳定的愈合环境。有学者提出，髓内钉不适合固定大鼠的股骨骨缺损，原因是操作困难、抗旋转差、易出现术中骨折及锁钉失效等并发症[15]。骨折周围的机械微环境对骨折愈合非常重要，其决定了骨折愈合的方式。机械环境如轴向、剪切、骨碎片间微动对骨修复均有影响。Heiner等[16]研究了钢板和髓内钉固定对SD大鼠股骨骨折愈合局部相关基因mRNA表达的影响，结果表明大部分生长因子、神经因子和造血因子等随着骨折而出现mRNA表达改变。研究发现，髓内钉固定可明显上调与软骨、炎症、细胞分化及乙酰胆碱相关的转录因子表达，钢板固定则上调与巨噬细胞活性相关的转录因子表达[16]。

本研究采用钢板固定诱导膜实验模型。因为诱导膜组织在造模后第4周时新生血管活性最强，诱导膜中骨髓间充质干细胞(MSCs)含量最高，血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)、TGF-β表达达到高峰[17～19]，故本研究在术后4周取材进行相关分析。结果显示，术后4周X线显示两组钢板、螺钉未见松动。HE染色显示，观察组形成有效的诱导膜组织；对照组形成的膜结构中仅见少量血管，观察组则形成更为丰富的血管网，符合文献报道的典型诱导膜结构[20]。由此可见该诱导膜实验模型的建立方案是可行的。但在整个造模过程需要注意的事项较多；此外，大鼠股骨直径较小，术中操作空间有限，钢板螺钉固定时往往只有一次机会，所以要非常谨慎。术中需注意以下细节：①钢板放置时近端要稍偏向内侧，因外侧大转子非常薄，可供螺钉固定的长度非常短。②螺钉长度要合适，尤其是最近端及最远端螺钉要足够长，一般不少于7 mm。因近端可能会打中小转子，且远端靠近股骨髁为松质骨。③于远端1/3分离肌肉间隙时注意保护血管。据文献报道，大鼠此处有一恒定血管经过，损伤此血管可导致大量出血[10]。本研究观察组有1只大鼠伤及此血管，术后出现大腿血肿、膝关节伸直受限。④麻醉药物浓度不宜太高。本课题组早期预实验采用10%水合氯醛麻醉，大鼠术后出现肠麻痹，改用5%水合氯醛麻醉未出现此并发症，且麻醉效果满意，亦未发生呼吸停止、死亡等。⑤术后前4天大鼠需分笼饲养，1只/笼，以防止互相撕咬引起伤口感染，待伤口稳定后合笼，建议4只/笼。经过不断的完善实验流程和总结经验，本课题组已建立了一种相对成熟的大鼠股骨诱导膜造模方法，该方法具有以下优点：①因截骨导板的距离固定为4 mm，故截骨长度非常精确；②操作简单，学习曲线短，手术时间短，对动物的损伤小；③材料价格低廉；④实验动物术后麻醉清醒后即可完全负重活动。

综上所述，本研究成功建立了用于研究Masquelet诱导膜的SD大鼠股骨实验模型，该模型具有操作简单、可重复性高、创伤小、易掌握、成本低等优点，可用于研发大段骨缺损治疗药物及生物材料。

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EstablishmentofratfemurexperimentalmodelforstudyingMasqueletinducedmembrane

ZENGZhikui1,HUANGFeng,HUANGPeizhen,LIYue,CAIQunbin,ZHOUQishi,JIANGZiwei,LIDing,ZHENGShengpeng

(1GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China)

ObjectiveTo establish an SD rat femur experimental model for studying the Masquelet induced membrane.MethodsA total of 24 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the observation group and control group, with 12 rats in each. A 4 mm bone block from the femur was removed in each of the two groups, and we used the steel plate to fix. The space was filled with PMMA cement spacers in the observation group, while in the control group, we did not do. The postoperative eating, defecation, walking, incision healing and complications were recorded. At 4 weeks after operation, the induced membrane tissues in the area around PMMA cement blocks of the observation group and in the osteotomy area of the control group were collected; HE staining was used to observe the histopathological changes; X-ray films were taken on the limbs of the two groups to observe the alignment of the osteotomy ends and the looseness of the steel plates and screws.ResultsIn both of the two groups, no rats had postsurgery symptoms of dysporia and eating disorder; rats walked normally on the second day after the surgery; no wound problem and infection were found. In the observation group, one rat's surgery limb had sustained swelling and knee movement restriction. In the observation group, the induced membrane was richly cellular, and the formation of large vascular network as well as bres oriented parallel to the PMMA could easily be identified. Histology analysis showed significantly decreased blood vessels in the control group. In the two groups, the steel plates and screws were in place with no loose.ConclusionsA SD rat femur experimental model for studying the induced membrane is successfully established.

bone defect; induced membrane; Masquelet technique; rats

国家自然科学基金资助项目(81603640)；广东省中医药管理局项目(20161135)。

曾志奎(1984-)，男，博士研究生在读，研究方向为中药防治骨与关节损伤。E-mail： zengzhekui185@163.com

黄培镇(1984-)，男，主治医师，研究方向为骨与关节损伤。E-mail： 174635247qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.001

R683

A

1002-266X(2017)48-0001-04

2017-07-25)