长效重组链激酶(r-SK-PEG结合物)对大鼠急性肺栓塞动脉血气、细胞因子的影响*

余 林，孟 尧，李万成，张 维，姜 轶，周夏飞，金家贵△

1.成都医学院第一附属医院 呼吸内科(成都610500)；2.成都医学院 (成都610500)

·论著·

长效重组链激酶(r-SK-PEG结合物)对大鼠急性肺栓塞动脉血气、细胞因子的影响*

余 林1，孟 尧2，李万成1，张 维1，姜 轶1，周夏飞1，金家贵2△

1.成都医学院第一附属医院 呼吸内科(成都610500)；2.成都医学院 (成都610500)

目的观察长效重组链激酶(r-SK-PEG结合物)对大鼠急性肺栓塞(PTE)动脉血气、肺动脉压和细胞因子的影响。方法将160只SD雄性大鼠随机分为4组：假手术组(Ⅰ组)、肺栓塞组(Ⅱ组)、低分子肝素组(Ⅲ组)和长效重组链激酶组(Ⅳ组)，每组各40只，采用自体血栓回输法建立PTE模型，造模成功后，Ⅰ组和Ⅱ组分别静脉滴注生理盐水，Ⅲ组皮下注射低分子肝素，Ⅳ组静脉点滴r-SK-PEG结合物，连续给药7 d，给药后1、3、6 h和1、3、5 d进行肺动脉压(mPAP)、右心室压力(RVP)、动脉血氧分压(PaO2)、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)及内皮素(ET-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、一氧化氮(NO)测定。结果Ⅳ组治疗后6 h和1、3 d的mPAP明显低于Ⅱ组(P<0.05)，PaO2明显高于Ⅲ组(P<0.05)；Ⅳ组治疗后6 h、1 d的mPAP明显低于Ⅲ组(P<0.05),RVP明显低于Ⅱ组、Ⅲ组(P<0.05)；Ⅳ组治疗后6 h和1、3、5 d的PaO2明显高于Ⅱ组(P<0.05)；Ⅳ组治疗后3、6 h的ET-1明显高于Ⅱ组、Ⅲ组(P<0.05)；Ⅳ组治疗后1、3、5 d的MMP-9明显低于Ⅱ组(P<0.05)；Ⅳ组治疗后3、6 h和1、3、5 d的NO明显高于Ⅱ组(P<0.05)；Ⅳ组治疗后3、6 h的NO明显高于Ⅲ组(P<0.05)。结论PTE采用r-SK-PEG结合物治疗,能更加迅速缓解呼吸困难、纠正低氧血症、降低肺动脉压力和改善血管内皮功能。

r-SK-PEG结合物；急性肺栓塞；血气；细胞因子

肺栓塞(PE)是由于体循环的各种栓子脱落，阻塞肺动脉及其分支，引起肺循环障碍的临床病理生理综合征。最常见的栓子为血栓，由血栓引起的PE也称肺血栓栓塞，主要表现为患者突然发生不明原因的虚脱、面色苍白、出冷汗、呼吸困难者、胸痛、咳嗽等，并有脑缺氧症状，如极度焦虑不安、倦怠、恶心、抽搐和昏迷。

溶栓酶或链球菌激酶(streptokinase,SK)是从β-溶血性链球菌培养液中提纯精制而成的一种高纯度酶，白色或类白色冻干粉，易溶于水及生理盐水，具有促进体内纤维蛋白溶解系统的活力，使纤维蛋白溶酶原转变为活性的纤维蛋白溶酶，引进血栓内部崩解和血栓表面溶解[1-3]。重组链激酶(recombinant streptokinase, r-SK)来源于含有高效表达链激酶基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后冻干制成，可用于防治急性心肌梗死、脑梗塞、深部静脉血栓和肺栓塞[4-5]，还适用于防治动脉栓塞、分流梗阻和胸膜黏连[6-7]，可以使心、肺功能保持正常，神经系统的后遗症完全消失或大部分消失等[8]。然而，与其他抗血栓药物类似，其存在的问题就是它们属于异源蛋白，在人体内多次使用后会产生一定的免疫反应、毒副作用和半衰期短等[9]。

聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是FDA认可的用于修饰蛋白药物的高分子亲水化合物，本身无毒性，且有着很好的生物相容性，与蛋白质药物结合后可获得下述有利性质：1)溶解度提高；2)免疫原性降低或消除；3)被水解酶降解的可能性减小；4)被肾脏清除的速率降低；5)药物体内分布和动力学行为改变；6)贮存稳定性提高。长效重组链激酶(r-SK-PEG结合物)是采用系列分子量(10、20、40 kDa)的单甲氧基聚乙二醇2-赖氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺[(mPEG)2-Lys-NHS]对SK进行化学修饰获得的，除本项目组外，尚未发现其他学者有r-SK-PEG结合物在动物体内的药效研究报道。本研究观察r-SK-PEG结合物对大鼠急性肺栓塞(PTE)血气、细胞因子的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

将160只SD雄性大鼠(3～4周龄，体质量230～280 g，购自四川大学实验动物中心)，按顺序编号，采用SPSS 19.0产生随机数字，按编号将大鼠随机分为4组：假手术组(Ⅰ组)、肺栓塞组(Ⅱ组)、低分子肝素组(Ⅲ组)和长效重组链激酶组(Ⅳ组)，每组各40只。

1.2 大鼠自体血栓制备

将大鼠尾巴浸泡于45～50 ℃热水中数分钟，或者使用酒精和二甲苯反复涂擦尾巴，使血管扩张，剪掉尾尖5～10 mm，置于试管内，自尾根部向尾尖按摩，使血液流入试管。静置，待其凝固后，再置于70 ℃水浴内10 min，倒入消毒平皿，将其切成1.1 mm×2.0 mm血栓栓子，使用生理盐水冲洗3遍，再置于试管内，加入2 mL生理盐水，冷藏备用。

1.3 动物模型建立

实验大鼠均采用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧固定，颈部剪毛消毒,作正中纵行切口,分离右侧颈内静脉,插入导管针至肺动脉，匀速、缓慢注入已制备的血栓20～30 个，缝合切口，建立PTE模型。

1.4 给药方法

实验大鼠均采用架式笼饲养，5只1笼，室内温度保持在(22±2)℃，湿度保持50%～60%，光照和黑暗各12 h交替下，喂养标准颗粒饲料，饮水为自来水。Ⅰ组和Ⅱ组分别静脉滴注生理盐水，Ⅲ组皮下注射低分子肝素0.01 mL/kg，Ⅳ组静脉滴注r-SK-PEG结合物150 万IU/kg，1 h内滴完，连续给药7 d。术后大鼠自由进食水。

1.5 数据采集

1)给药后1、3、6 h和1、3、5 d，采用右心导管法测定肺动脉压(mPAP)及右心室压力(RVP)。2)给药后1、3、6 h和1、3、5 d行大鼠颈总动脉插管，取动脉血1 mL测定血气指标[动脉血氧分压(PaO2)、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)]。3)给药后1、3、6 h和1、3、5 d行大鼠颈总动脉插管，取动脉血1 mL，采用放射免疫法测定内皮素(ET-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和一氧化氮(NO)。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 PTE大鼠模型制作情况

Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组大鼠采用自体血栓回输法建立PTE模型，术后1～2 h共死亡5只，其中，Ⅱ组2只、Ⅲ组2只、Ⅳ组1只，制成PTE模型共115只，成功率为95.83%(115/120)。

2.2 不同组别不同时间点mPAP比较

Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组造模后mPAP均明显升高(P<0.05)，Ⅳ组治疗后6 h和1、3 d的mPAP明显低于Ⅱ组(P<0.05)，而Ⅲ组治疗3 d后mPAP才明显低于Ⅱ组(P<0.05)；Ⅳ组治疗后6 h、1 d的mPAP明显低于Ⅲ组(P<0.05)(表1)。

表1 不同组别不同时间点mPAP比较

注：与Ⅰ组比较，*P<0.05；与Ⅱ组比较，△P<0.05；与Ⅲ组比较，&P<0.05

2.3 不同组别不同时间点RVP比较

Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组造模后RVP均明显升高(P<0.05)，Ⅳ组治疗后6 h、1 d的RVP明显低于Ⅱ组、Ⅲ组(P<0.05)(表2)。

表2 不同组别不同时间点RVP比较

注：与Ⅰ组比较，*P<0.05；与Ⅱ组比较，△P<0.05；与Ⅲ组比较，&P<0.05

2.4 不同组别不同时间点血气指标比较

Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组造模后PaO2明显下降(P<0.05)，Ⅳ组治疗后6 h和1、3、5 d的PaO2明显高于Ⅱ组(P<0.05)，Ⅲ组治疗后3、5 d的PaO2明显高于Ⅱ组(P<0.05)，Ⅳ组治疗后6 h和1、3 d的PaO2明显高于Ⅲ组(P<0.05)(表3～4)。

表3 不同组别不同时间点PaO2比较

注：与Ⅰ组比较，*P<0.05；与Ⅱ组比较，△P<0.05；与Ⅲ组比较，&P<0.05

表4 不同组别不同时间点PaCO2比较

2.5 不同组别不同时间点ET-1比较

Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组造模后ET-1明显升高(P<0.05)，Ⅳ组治疗后3、6 h的ET-1明显高于Ⅱ组、Ⅲ组(P<0.05)(表5)。

表5 不同组别不同时间点ET-1比较

注：与Ⅰ组比较，*P<0.05；与Ⅱ组比较，△P<0.05；与Ⅲ组比较，&P<0.05

2.6 不同组别不同时间点MMP-9比较

Ⅳ组治疗后1、3、5 d的MMP-9明显低于Ⅱ组(P<0.05)，而Ⅲ组治疗后3、5 d的MMP-9才明显低于Ⅱ组(P<0.05)(表6)。

表6 不同组别不同时间点MMP-9比较

注：与Ⅰ组比较，*P<0.05；与Ⅱ组比较，△P<0.05

2.7 不同组别不同时间点NO比较

Ⅳ组治疗后3、6 h和1、3、5 d的NO明显高于Ⅱ组(P<0.05)，而Ⅲ组治疗后6 h和1、3、5 d的NO明显高于Ⅱ组(P<0.05)，Ⅳ组治疗后3、6 h的NO明显高于Ⅲ组(P<0.05)(表7)。

表7 不同组别不同时间点NO比较

注：与Ⅰ组比较，*P<0.05；与Ⅱ组比较，△P<0.05；与Ⅲ组比较，&P<0.05

3 讨论

肺血栓栓塞症是内源性或外源性血栓栓子栓塞肺动脉或其分支所致，以气体交换障碍为最主要的病理生理改变，是由于血流阻塞引起肺泡死腔量增大，出现低氧血症，表现为PaO2明显下降和PaCO2明显升高，肺部气体交换异常与栓子的大小、性质、阻塞程度等因素有关。PTE是一种高发病率、病死率和致残率的疾病，早期发现并予以积极治疗，能有效改善临床预后，血气分析的变化对PTE早期诊断有较大的临床价值。

肺部血栓形成导致肺血管内皮受损，剌激血管内皮细胞释放多种缩血管物质，引起血管收缩，导致肺循环阻力增加，使肺动脉压力升高。其中，ET-1具有强烈的血管收缩作用，NO具有引起血管扩张的作用，二者均为血管内皮细胞分泌的重要血管活性物质，在PTE发病过程中起十分重要的作用，并可能是影响PTE预后的重要因素之一[10],可引起患者血流动力学改变和气体交换异常。另外，ET-1能够促进肺血管平滑肌细胞增殖，参与肺动脉高压的肺血管重构过程。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类以Zn2+为辅助因子的蛋白酶家族，其中，MMP-9是MMPs中分子量最大的酶，其产生与FGF、VEGF等细胞因子及IL-1、TNF-a等炎性因子有关，缺血缺氧条件下的产生也会大量增加[11]。MMPs/基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)系统失衡在肺动脉高压形成过程中起重要作用，且对PTE后肺动脉内膜增生也发挥重要作用[12]。

目前，溶栓、抗凝治疗是治疗PTE的有效方法。溶栓治疗可迅速溶解部分或全部血栓，解除肺动脉栓塞，降低肺动脉阻力，减轻肺动脉高压，而溶栓治疗后一段时间，存在着继发血栓形成而重新堵塞血管的危险，因此，需再配合抗凝治疗，防止血栓的延伸，并依靠机体自身的纤维蛋白溶解系统溶解已形成的血栓[13-14]。链激酶是临床常用的溶栓药物，r-SK是利用重组技术制成的新型非纤维蛋白特异性溶栓药物，但因其异源蛋白，在人体内多次使用后会产生一定的免疫反应、毒副作用和半衰期短等，采用系列分子量(10、20、40 kDa)的(mPEG)2-Lys-NHS对SK进行化学修饰，能有效降低或消除免疫原性。本研究首创观察r-SK-PEG结合物在治疗大鼠PTE中的应用效果。

本研究结果显示，Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组造模后PaO2明显下降，Ⅳ组治疗后6 h和1、3、5 d的PaO2明显高于Ⅱ组，Ⅲ组治疗后3、5 d的PaO2明显高于Ⅱ组，Ⅳ组治疗后6 h和1、3 d的PaO2明显高于Ⅲ组，表明血气分析的变化对PTE的早期诊断有较大的临床价值[15]。采用低分子肝素或r-SK-PEG结合物均能有效改善血气指标，但r-SK-PEG结合物改善速度更快，且效果优于低分子肝素，这是由于低分子肝素能够阻止继发血栓形成，从而改善血管内皮功能，降低肺循环阻力及肺动脉压力，进而改善动脉血气，而r-SK-PEG结合物能使栓子溶解或部分溶解后，更好地改善肺脏血液循环，对氧和改善效果更好。Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组造模后mPAP均明显升高，Ⅳ组治疗后6 h和1、3 d的mPAP明显低于Ⅱ组，而Ⅲ组治疗3 d后mPAP才明显低于Ⅱ组，Ⅳ组治疗后6 h、1 d的mPAP明显低于Ⅲ组；Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组造模后RVP均明显升高，Ⅳ组治疗后6 h、1 d的RVP明显低于Ⅱ组、Ⅲ组。由此表明，低分子肝素或r-SK-PEG结合物均能有效地减轻肺动脉压力升高，但是r-SK-PEG结合物能更迅速地部分解除肺动脉机械性阻塞，降低肺动脉压力的速度更快，对于PTE尤其是生命垂危的患者具有更好的临床获益。Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组造模后ET-1明显升高，NO明显降低，提示PTE存在血管内皮功能障碍[16]。血栓形成可引起血管内皮损伤，内皮细胞释放的ET-1增加，NO产生减少，内皮功能障碍又可使堵塞部位的血管痉挛，导致肺动脉内压力上升。Ⅳ组治疗后3、6 h的ET-1明显高于Ⅱ组、Ⅲ组，这可能是由于血管再通导致ET-1升高所致[17]，r-SK-PEG结合物溶栓后栓子脱落，造成血管壁损伤，刺激血管内皮细胞合成释放ET-1增加，另外，血管再通引起的再灌注损伤可加重内皮细胞损伤，积蓄的ET-1迅速代谢并大量释放入血。Ⅳ组治疗后3、6 h和1、3、5 d的NO明显高于Ⅱ组，而Ⅲ组治疗后6 h和1、3、5 d的NO明显高于Ⅱ组，Ⅳ组治疗后3、6 h的NO明显高于Ⅲ组,表明r-SK-PEG结合物能增加内源性NO的合成，有效保护血管内皮功能。Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组造模后MMP-9明显升高，Ⅳ组治疗后1、3、5 d的MMP-9明显低于Ⅱ组，而Ⅲ组治疗后3、5 d的MMP-9才明显低于Ⅱ组。这是由于栓塞局部血流由层流变为湍流，局部血管壁所受剪切力明显升高，导致局部的MMP-9明显增加[18]，r-SK-PEG结合物溶栓治疗能使血管内栓子快速溶解，肺泡渗出及间质炎性细胞浸润明显减轻，从而减少MMP-9的表达。

综上所述，PTE采用r-SK-PEG结合物治疗，能更加迅速地缓解呼吸困难、纠正低氧血症、降低肺动脉压力和改善血管内皮功能。

[1]Assiri A S, El-Gamal B A, Hafez E E,etal. Production of recombinant streptokinase from Streptococcus pyogenes isolate and its potential for thrombolytic therapy[J]. Saudi Med J, 2014, 35(12): 1482-1488.

[2]Beiroti A, Kavianpour A, Sepahi M,etal. Effect of post-solubilization conditions on the yield and efficiency of recombinant streptokinase purification at large-scale[J]. Protein Expr Purif, 2014, 101: 127-132.

[3]Suthakaran P, Balasubramanian J, Ravichandran M,etal. Studies on lipidification of streptokinase: a novel strategy to enhance the stability and activity[J]. Am J Ther, 2014, 21(5): 343-351.

[4]Olgun H, Buyukavci M, Ceviz N,etal. Clinical experience with recombinant tissue plasminogen activator in the management of intracardiac and arterial thrombosis in children[J]. Blood Coagul Fibrinolysis, 2014, 25(7): 726-730.

[5]Buniya H K, Murugan V, Thangadurai C. Cloning and expression of hybrid streptokinase towards clot-specific activity[J]. J Microbiol Methods, 2014, 98: 84-88.

[6]Laha M, Panizzi P, Nahrendorf M,etal. Engineering streptokinase for generation of active site-labeled plasminogen analogs[J]. Anal Biochem, 2011, 415(2): 105-115.

[7]Xu H, Chen X, Qin Z,etal. Effect of recombinant streptokinase on the development of chronic cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in a swine model[J]. Acta Neurochir (Wien), 2011, 153(6): 1333-1338.

[8]Mahmoudi S, Abtahi H, Bahador A,etal. Production of recombinant streptokinase in E. coli and reactivity with immunized mice[J]. Pak J Biol Sci, 2010, 13(8): 380-384.

[9]武欣, 谷涌泉, 齐立行, 等. 国产重组链激酶与尿激酶在急性下肢深静脉血栓溶栓中的疗效观察[J]. 河北医科大学学报, 2006, 27(3): 174-177.

[10] Sofia M, Maniscalco M. Endothelin-1 in acute pulmonary embolism[J]. Thromb Res, 2010, 126(1): e63-e64.

[11] 李丛锋, 朱光发. 基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9与急性肺损伤关系的研究进展[J]. 国际呼吸杂志, 2011, 31(14): 1097-1101.

[12] 邢佳. 兔急性肺动脉栓塞MMP-9及TIMP-1的变化及意义[D]. 石家庄：河北医科大学, 2009:1-60.

[13] 陆卫华, 唐忠志, 马教, 等. 溶栓加抗凝疗法与单纯抗凝疗法对次大面积肺栓塞的疗效及远期预后的影响[J]. 临床军医杂志, 2008, 36(3): 340-342.

[14] 刘丽华, 陆思静, 刘忠. 溶栓与抗凝疗法对次大面积肺栓塞患者的疗效观察[J]. 重庆医学, 2013, 42(11): 1288-1290.

[15] 赵钰玲, 董娅, 李建英. 血浆 D-二聚体联合动脉血气分析对次大面积肺栓塞的诊断价值[J]. 齐齐哈尔医学院学报, 2016, 37(23): 2885-2887.

[16] 刘惠良, 崔杰, 薛华, 等. 肺血栓栓塞症患者血管内皮功能损伤的临床观察[J]. 重庆医学, 2011, 40(15): 1512-1514.

[17] 姜琴华，李国平，许雯，等.急性肺栓塞溶栓治疗中ET-1和NO的动态变化及葛根素的干预作用[J].医学研究杂志,2011,40(5):53-56.

[18] 段洋, 孙夫强, 阙生顺, 等. 低分子肝素联合肺泡表面活性物质对幼年大鼠急性肺栓塞的治疗研究[J]. 临床儿科杂志, 2016, 34(4): 297-302.

TheEffectofLong-actingRecombinantStreptokinase(r-SK-PEGConjugates)ontheArterialBloodGasandCytokinesinRatswithAcutePulmonaryEmbolism

YuLin1,MengYao2,LiWancheng1,ZhangWei1,JiangYi1,ZhouXiafei1,JinJiagui2△.

1.DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

ObjectiveTo investigate the effect of long-acting recombinant streptokinase (r-SK-PEG conjugates) on the arterial blood gas, pulmonary artery pressure, and cytokines in rats with acute pulmonary embolism (PTE).Methods160 male SD rats were divided randomly into four groups including the sham operation group (Group I), pulmonary embolism group (Group II), low molecular weight heparin group (Group III), long-acting recombinant streptokinase group (Group IV), and each group consisted of 40 rats. The model of acute pulmonary embolism was established by the autologous thrombosis method. The model rats of Group I and II were treated with the intravenous infusion of normal saline, those of Group III were given subcutaneously with low molecular weight heparin, and those of Group IV were treated with the intravenous drip of long-acting recombinant streptokinase. The treatment lasted for 7 days in all the groups. The mean pressure of pulmonary artery (mPAP), right ventricular pressure (RVP), arterial partial pressure of oxygen (PaO2), partial pressure of carbon dioxide (PaCO2), Endothelin-1 (ET-1), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), and nitric oxide (NO) were detected after being administered for 1h, 3h, 6h, 1d, 3d and 5d respectively.ResultsAfter being administered for 6h, 1d and 3d, the mPAP level of Group IV was significantly lower than that of Group II (P<0.05) and the PaO2level of Group IV was significantly higher than that of Group III (P<0.05). After being administered for 6h and 1d, the mPAP level of Group IV was significantly lower than that of Group III (P<0.05) and the RVP level was significantly lower in Group IV than in Group II and III respectively (P<0.05). After being treated for 6h, 1d, 3d and 5d, the PaO2level of Group IV was significantly higher than that of Group II (P<0.05). The ET-1 level was significantly higher in Group IV than in Group II and III respectively (P<0.05). The level of MMP-9 was significantly lower in Group IV than in Group II after being treated for 1d, 3d and 5d respectively (P<0.05). The NO level of Group IV was significantly higher than that of Group II after being treated for 3h, 6h, 1d, 3d and 5d respectively (P<0.05) and that of Group II after being treated for 3h and 6h respectively .ConclusionThe long-acting recombinant streptokinase (r-SK-PEG conjugates) can alleviate the dyspnea more quickly, correct the hypoxemia, reduce the pulmonary artery pressure and improve the vascular endothelial function in the treatment of acute pulmonary embolism.

r-SK-PEG conjugate; Acute pulmonary embolism; Blood gas; Cytokine

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20171108.0841.012.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.06.002

R563.5

A

四川省教育厅基金项目(No:17ZB0134)

△

金家贵，E-mail：jinjiagui2014@126.com