microRNA-26a在原发性肝癌患者中的表达及临床意义研究

杜磊 苗成龙 冯方栋

microRNA-26a在原发性肝癌患者中的表达及临床意义研究

杜磊 苗成龙 冯方栋

目的 探讨microRNA-26a在原发性肝癌（HCC）患者中的表达及临床意义。方法 选取HCC、慢性乙型肝炎（CH）患者各28例。HCC患者留取癌组织、癌旁组织、血浆标本，CH患者留取血浆标本，采用RT-PCR法检测标本microRNA-26a的表达水平。比较HCC患者与CH患者microRNA-26a表达水平；分析HCC患者癌组织、癌旁组织microRNA-26a表达水平的相关性；比较血浆microRNA-26a与血清甲胎蛋白（AFP）诊断HCC的灵敏度、特异度；以血浆microRNA-26a水平最佳临界值（2.873）为界，将HCC患者分为microRNA-26a高表达组和低表达组，比较两组患者术后1年生存率。结果 HCC患者血浆microRNA-26a表达水平低于CH患者（P＜0.05）。HCC患者癌组织microRNA-26a表达水平低于癌旁组织（P＜0.05）。HCC患者癌组织、癌旁组织microRNA-26a表达水平呈正相关（r=0.574，P＜0.038）。血浆microRNA-26a诊断HCC的灵敏度较血清AFP强（85.8%vs 57.8%，P＜0.05），但特异度较血清AFP弱（65.2%vs 80.52%，P＜0.05）。microRNA-26a高表达组患者术后1年生存率高于低表达组（60.25%vs 45.77%，P＜0.05）。结论 HCC患者microRNA-26a表达水平较低，microRNA-26a可作为早期诊断HCC的生物标志物，也可作为HCC患者预后评估指标。

原发性肝癌 microRNA-26a 甲胎蛋白 相关性 生存曲线

肝细胞癌是原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，HCC）的主要类型，占HCC的70%～85%，是常见的恶性肿瘤之一。我国每年约有40万HCC新增病例[1]，HBV感染导致肝硬化进而发展成HCC是其发病率逐年上升的主要原因[2]。HCC具有恶性程度、发病率、病死亡率高，治愈率低的特点，早期不易诊断，多数患者首诊时已发展至中晚期，失去了接受根治性手术治疗的机会[3]。甲胎蛋白（AFP）作为一种血清学生物标志物用于早期HCC的临床诊断和预测，但其灵敏度和特异度偏低。因此，寻找新型生物标志物用于早期HCC诊断迫在眉睫[4]。microRNA是一类含有19～25 bp的非编码单链小RNA分子，其在生物体的发育，细胞增殖、分化和凋亡等过程中发挥重要作用[5]。microRNA异常表达与肿瘤发生、发展密切相关，且不同疾病状态下microRNA表达存在明显差异，这提示microRNA或可作为生物标志物用于恶性肿瘤的诊断和预后评估[6-7]。研究发现，microRNA-26a在肝癌组织中的表达低于癌旁组织[8]，提示其或可作为HCC临床诊断潜在的生物标志物。本研究通过检测microRNA-26a在HCC组织和血浆中的表达水平，探讨其作为生物标志物用于HCC临床诊断和预后评估的意义，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2011年1月至2016年1月本院普外科收治的HCC患者28例。纳入标准：（1）由乙型肝炎导致肝硬化进而发展成HCC的患者；（2）NCCN临床实践指南[9]规定的可接受根治性手术治疗的HCC患者；（3）组织病理学诊断为HCC的患者；（4）术后存活1年以上的HCC患者。另同期择与HCC患者性别、年龄相近的慢性乙型肝炎（CH）患者28例作为对照，入组的CH患者均无重大疾病。

1.2 方法

1.2.1 资料采集 使用Epidata 3.0软件建立病历数据库，项目包括患者人口统计学特征、肿瘤生物学行为、实验室及影像学检查结果、肿瘤临床分期及手术情况。

1.2.2 标本留取 HCC患者留取癌组织、癌旁组织、血浆标本，CH患者留取血浆标本，均保存于本院中心实验室-80°C环境中。

1.2.3 HCC患者与CH患者microRNA-26a表达检测应用RT-PCR法，检测工作由武汉康圣达医学检验所统一于2016年8至10月完成。按照miRNeasy Mini试剂盒（德国QIAGEN公司）说明书提取HCC患者癌组织、癌旁组织总RNA；按照BLOODmisi试剂盒（中国Aidlab公司）说明书提取HCC患者、CH患者血浆标本总RNA；按照RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，反应条件为 37°C，1h，合成的cDNA置于-80°C保存。取2ng cDNA进行RT-PCR反应，反应条件：95°C预变性5min；95°C，30s；60°C，30s；72°C，35s，40 个循环；72°C，10min。采用SYBR GreenⅡ荧光染料法和IQ5TM RTPCR Detection System（美国Bio-rad公司）进行数据分析，结果经U6RNA内参校正，microRNA-26a相对表达水平用2-ΔΔCt表示，进行3次独立重复实验。

1.2.4 血浆microRNA-26a和血清AFP的诊断效能分析 运用ROC曲线及AUC评价血浆microRNA-26a和血清AFP诊断HCC的能力，得出microRNA-26a作为诊断HCC生物标志物的最佳临界值。

1.2.5 HCC患者短期生存分析 以最佳临界值为界，根据HCC患者血浆microRNA-26a水平分为microRNA-26a高表达组和低表达组，比较两组患者术后1年生存率。

1.3 观察指标 比较HCC患者与CH患者的临床资料；比较HCC患者与CH患者microRNA-26a表达水平；分析HCC患者癌组织、癌旁组织microRNA-26a表达水平的相关性；比较血浆microRNA-26a与血清AFP诊断HCC的灵敏度、特异度；比较microRNA-26a高表达组和低表达组患者术后1年生存率。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件；计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以频数和构成比表示，两组比较采用χ2检验；采用直线相关分析HCC患者癌组织、癌旁组织microRNA-26a表达水平的关系；采用Kaplan-Meier法估计两组患者的生存率并绘制生存曲线，两组患者生存率的比较采用log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC患者与CH患者临床资料比较 见表1。

表1 HCC患者与CH患者临床资料比较

由表1可见，HCC患者与CH患者性别、年龄、RBC、WBC、PLT、Hb、ALT、AST、谷氨酰转肽酶、碱性磷酸酶、TBil及肝功能 Child-Pugh分级等比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；HCC患者AFP水平高于HC患者（P＜0.05）。

2.2 HCC患者与CH患者microRNA-26a表达水平比较 HCC患者癌组织、癌旁组织的microRNA-26a表达水平分别为 0.420±0.02、1.325±0.03，癌组织低于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。 HCC患者、CH患者血浆microRNA-26a表达水平分别为0.893±0.01、4.125±0.14，HCC患者低于CH患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 HCC患者癌组织、癌旁组织microRNA-26a表达水平的相关性分析 见图1。

图1 28例HCC患者癌组织、癌旁组织microRNA-26a表达水平的相关性

由图1可见，HCC患者癌组织、癌旁组织microRNA-26a表达水平呈正相关（r=0.574，P＜0.038）。

2.4 血浆microRNA-26a与血清AFP诊断HCC效能比较 见图2。

图2 血浆microRNA-26a和血清AFP诊断HCC的ROC曲线

由图2可见，当血浆microRNA-26a临界值为2.873 时，AUC 最大值为 0.725（95%CI：0.608～0.912，P＜0.05），此时microRNA-26a诊断HCC的灵敏度和特异度分别为85.8%、65.2%。当血清AFP临界值为20.42ng/ml时，AUC 最大值为 0.610（95%CI：0.615～0.833，P＜0.05），此时AFP诊断HCC的灵敏度和特异度分别为57.8%、80.52%。这提示血浆microRNA-26a诊断HCC的灵敏度较血清AFP强，但特异度较血清AFP弱。

2.5 microRNA-26a高表达组和低表达组患者术后生存率比较 见图3。

图3 microRNA-26a高表达组和低表达组患者术后生存曲线

由图3可见，microRNA-26a高表达组和低表达组患者术后1年生存率分别为60.25%、45.77%，高表达组患者生存率高于低表达组（P＜0.05）。

3 讨论

HCC是最常见的恶性肿瘤之一，好发于40～50岁人群，男性发病率高于女性。目前临床尚无有效治疗HCC的靶向药物以及优等的早期诊断HCC生物标志物，AFP是临床上用于诊断HCC的常用生物标志物，但其灵敏度和特异度偏低（分别为40%～65%、76%～90%），易导致假阳性或假阴性结果[4,10]。早期诊断是影响HCC预后和生存的关键因素，因此寻找新型的高效肿瘤标志物用于HCC的早期诊断和预后判断已成为迫切需要解决的问题。

microRNA在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用，其表达谱与肿瘤类型相关，不同种类的肿瘤具有不同的表达模式[5]，提示microRNA可作为肿瘤疾病的生物标志物用于肿瘤诊断、预后判断[11]。本研究对28例HCC患者的癌组织、癌旁组织，HCC患者和CH患者血浆样本进行microRNA-26a检测，发现HCC患者癌组织中microRNA-26a表达水平低于癌旁组织，HCC患者血浆中的microRNA-26a表达水平低于CH患者，这提示microRNA-26可作为早期诊断HCC潜在的标志物。本研究结果显示，HCC患者血清 AFP水平明显高于CH患者，同时发现microRNA-26a诊断HCC的灵敏度较血清AFP强，但特异度较血清AFP弱。

研究发现，microRNA-26a可作为大肠癌[12]和乳腺癌[13]患者预后评估指标；在HCC中的研究以现，microRNA-26a可通过HGF-cMet抑制肿瘤血管重建，是一种潜在的治疗靶标[8，14]。生存曲线结果显示microRNA-26a高表达组患者术后1年生存率高于低表达组患者，这提示microRNA-26a作为一种抑癌基因在HCC发生、发展中发挥重要作用。

综上所述，本研究结果显示HCC患者microRNA-26a表达水平较低，microRNA-26a可作为早期诊断HCC的生物标志物，也可作为HCC患者预后评估指标，但其生物学功能尚待进一步深入研究。

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Expression of microRNA-26a in primary liver cancer and its clinical significance

DU Lei,MIAO Chenglong,FENG Fangdong.
Department of General Surgery,Pizhou People's Hospital of Jiangsu Province,Pizhou 221300,China

Objective To investigate the expression of microRNA-26a (mRNA-26a)in primary hepatocellular carcinoma(HCC)and its clinical significance. Methods The expression of mRNA-26a were detected with RT-PCR in plasma,cancer tissue and pericancerous liver tissue samples from 28 patients with HCC and plasma samples from 28 patients with chronic hepatitis B(CHB).The clinical significance of mRNA-26a expression in HCC was analyzed. Results The expression level of plasma microRNA-26a in HCC patients was lower than that in CHB patients(P＜0.05).The expression level of microRNA-26a in cancer tissues of HCC patients was lower than that of pericancerous liver tissues(P＜0.05).There was a positive correlation between the expression of microRNA-26a in cancer tissues and pericancerous liver tissues(r=0.574,P＜0.05).The sensitivity of plasma microRNA-26a in diagnosis of HCC was higher than that in serum AFP(85.8%vs 57.8%,P＜0.05),but the specificity was lower than that of serum AFP(65.2%vs 80.52%,P＜0.05).The 1-year survival rate of patients with high expression of mRNA-26a was higher than that of low expression group(60.25%vs 45.77%,P＜0.05). Conclusion The expression level of mRNA-26a in HCC tissues is down-regulated,it may be used as a molecular marker for early diagnosis of HCC.

Primary hepatocellular carcinoma MicroRNA-26a Alpha-fetoprotein Correlation Survival curve

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.24.2017-542

221300 江苏省邳州市人民医院普外科

冯方栋，E-mail：ffd2013hb@163.com

2017-03-13）

李媚）