VTQ和超声微泡造影技术对大鼠肝纤维化的评估价值研究

刘芳 黄斌

VTQ和超声微泡造影技术对大鼠肝纤维化的评估价值研究

刘芳 黄斌

目的 探讨声触诊组织量化技术（VTQ）和超声微泡造影技术对大鼠肝纤维化的评估价值。方法 将84只SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠按随机数字表法分为模型组（70只）和对照组（14只）。模型组大鼠采用硫代乙酰胺（TAA）注射法造模，对照组予等量0.9%氯化钠注射液处理。采用超声VTQ检查大鼠肝脏剪切波速度（Vs），采用超声微泡造影定量检测到达时间（AT）、达峰时间（TTP）、峰值强度（PI）、平均通过时间（MTT）、AUC、肝动-静脉渡越时间（HA-HVTT)。结果 大鼠肝纤维化程度与Vs呈正相关（r=0.887，P＜0.05），与 PI、AUC、HA-HVTT均呈负相关（r=-0.615、-0.782、-0.575，均 P＜0.05），即随着肝纤维化程度的加重，出现Vs增加，PI降低，AUC减小，HA-HVTT缩短的趋势。Vs诊断大鼠肝纤维化程度的灵敏度、特异度最高，AUC次之，HA-HVTT与PI相当。结论 VTQ和超声微泡造影技术均可有效评估大鼠肝纤维化程度，其在人体的效果值得临床研究。

肝纤维化 声触诊组织量化技术 微泡 诊断 大鼠

肝纤维化是许多肝脏疾病尤其是各种慢性肝病常见和共同的病理转归。目前，临床判断肝纤维化程度的金标准是肝脏组织穿刺活检，但其存在创伤大、不能动态观察等诸多局限[1-2]。研究表明，肝实质回声的改变可作为反映肝纤维化程度的指标[3-5]，但其受患者主观因素影响较大，且不能提供详细量化信息。超声的新技术-声触诊组织量化技术（virtual touch tissue quantification，VTQ）结合超声微泡造影技术凭借其安全、无辐射、无临床禁忌，且可量化肝纤维化程度等诸多优点，为肝纤维化的无创诊断研究提供了契机。基于此，本研究旨在探讨VTQ和超声微泡造影技术对肝纤维化程度的评估价值，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 84只SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量180～220g，由杭州赫贝科技有限公司提供（合格证编号：1401016），在 20～25℃灯光昼夜调控下自由进食、饮水。

1.2 动物模型制备 将大鼠按随机数字表法分为模型组（70只）和对照组（14只）。模型组大鼠予以250mg/kg体质量的剂量经腹腔注射10%硫代乙酰胺（TAA）制备肝纤维化模型，2次/周，共10周。对照组大鼠予0.9%氯化钠注射液同法同剂量处理。于给药第 4、5、6、7、8、9、10周末，模型组大鼠每次取10只，对照组大鼠每次取2只，进行VTQ和超声微泡造影检查；后麻醉下行腹主动脉切开处死，解剖观察并取肝组织行病理学检查。

1.3 VTQ检查

1.3.1 仪器 ACUSON S2000彩色多普勒超声诊断仪（德国SIEMENS公司），探头频率8～11MHz，配有VTQ分析软件，可进行VTQ检测。

1.3.2 方法 固定大鼠，应用高频探头扫查，以肝右静脉右侧距肝包膜3mm处设定感兴趣区（感兴趣区大小固定），调取VTQ功能，激发获取剪切波速度（Vs）并记录，同一大鼠重复检查5次取平均值。

1.4 超声微泡造影检查

1.4.1 仪器 ACUSON S2000彩色多普勒超声诊断仪（德国SIEMENS公司），探头频率8～11MHz，对比剂为六氟化硫微泡（瑞士Bracco International B.V.公司）。

1.4.2 方法 25mg六氟化硫微泡予5ml 0.9%氯化钠注射液稀释后，取0.1ml经静脉团注并快速用0.9%氯化钠注射液0.1ml冲管。全程超声视频录像，脱机后用IMAGE ARENA分析软件分析获取肝脏血流灌注的时间强度曲线和数据，并记录。本研究选取的定量分析相关参数包括：到达时间（arrive time，AT），达峰时间（time to peak，TTP），峰值强度（peak intensity，PI），平均通过时间（mean transit time，MTT），AUC，肝动-静脉渡越时间（hepatic artry to hepatic vein transit time，HA-HVTT）。

1.5 病理学检查 剪取大鼠肝左叶相同部位约10mm×10mm×10mm组织标本，采用4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋连续切片，HE、Masson及网状纤维染色。肝纤维化病理诊断标准采用2015年全国《病毒性肝炎防治方案》中的慢性肝纤维化分期标准[6]。肝纤维化S0期为无肝纤维化；S1期为镜下见肝细胞间质纤维增生较多，肝细胞片状坏死；S2期见肝细胞间质明显桥接纤维化，纤维间隔形成，尚不影响小叶结构；S3期见肝组织间隙大量纤维间隔，肝小叶结构紊乱甚至破坏；S4期肝组织大量纤维增生，纤维间隔包绕形成假小叶，肝组织细胞广泛坏死。

1.6 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，采用Spearman相关分析肝纤维化程度与VTQ和超声微泡造影定量参数的关系。以肝组织病理学检查结果为金标准，应用ROC曲线分析VTQ和超声微泡造影定量参数对大鼠肝纤维化程度的诊断效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠一般情况及病理学表现比较 模型组大鼠死亡14只，成模率为80.0%（56/70），对照组大鼠死亡1只。随着给药时间延长，模型组大鼠肝纤维化程度逐渐加重，其中S0期1只，S1期16只，S2期17只，S3期13只，S4期9只，病理学表现见图1，而对照组大鼠均为S0期。

图1 模型组大鼠肝组织病理学表现（a：第4周末，肝组织呈S0期纤维化表现；b：第5周末，肝组织呈S1期纤维化表现；c：第6周末，肝组织呈S2期纤维化表现；d：第8周末，肝组织呈S3期纤维化表现；e：第10周末，肝组织呈S4期纤维化表现；Masson染色，×40）

2.2大鼠肝纤维化程度与VTQ和超声微泡造影定量参数的相关性分析 不同肝纤维化程度大鼠Vs、PI、AUC、HA-HVTT比较见表1。

由表1可见，大鼠肝纤维化程度与Vs呈正相关（r=0.887，P＜0.05），与 PI、AUC、HA-HVTT 均呈负相关（r=-0.615、-0.782、-0.575，均 P＜0.05），即随着肝纤维化程度的加重，出现Vs增加，PI降低，AUC减小，HAHVTT缩短的趋势。

表1 不同肝纤维化程度大鼠Vs、PI、AUC、HA-HVTT比较

2.3 Vs、PI、AUC、HA-HVTT诊断大鼠肝纤维化程度的 效能比较 见图2、表2。

图2 Vs、PI、AUC、HA-HVTT诊断大鼠肝纤维化程度的ROC曲线（a：肝纤维化S≥2期；b：肝纤维化S≥3期；c：肝纤维化S4期）

表2 Vs、PI、AUC、HA-HVTT诊断大鼠肝纤维化程度的效能比较

由图2、表2可见，Vs诊断大鼠肝纤维化程度的灵敏度、特异度最高，AUC次之，HA-HVTT与PI相当。

3 讨论

肝纤维化的形成和发展是一个动态的病理学过程[7]。有效的病因治疗可以逆转肝纤维化。因此，早期和量化诊断肝纤维化程度对于及时干预治疗并逆转肝纤维化的发展具有十分重要的临床价值[8]。超声评价肝纤维化是目前临床无创诊断肝纤维化研究的热点之一[9]。常规的超声检查对已有形态学改变的病态肝有一定的诊断价值，但其诊断早期肝纤维化或肝硬化的灵敏度不高。超声检查受操作者主观判断和经验的影响，且更多的依赖设备。这些都是传统超声检查的局限性。

近年来，超声弹性成像成为肝纤维化无创诊断研究的热点[10]，VTQ技术是弹性成像的一种，可定量描述“触诊”效果[11]。其原理是声脉冲辐射力成像和剪切波传播，将感兴趣区组织的Vs精确快速地计算出来，在诊断过程中不需要检查者手动施压，不受外部压力影响，而是由探头发射恒定压力的脉冲波引起，避免了因主观因素产生的干扰。对传统超声成像结果有一定价值的补充作用。VTQ在评估肝纤维化程度方面的研究在西方国家是以慢性丙型肝炎为主要研究对象，并取得了一些成果[12]。本研究以肝纤维化大鼠为研究对象，发现随着肝纤维化程度的加重，Vs呈增加趋势。应用ROC曲线评估Vs诊断效能，发现Vs诊断大鼠肝纤维化程度的灵敏度、特异度很高。

超声微泡造影是一种典型的血池示踪成像技术。对比剂微泡直径约为2～4 μm，血流动力学与红细胞几乎完全一致，经静脉注射微泡后，可顺利通过肺循环到达全身血管系统，并持续足够长的时间，不但能够提高低速血流的检出能力，而且能够作为良好的血池示踪剂反映肝脏的血流灌注状态。有研究表明，肝脏血流动力学改变的发生远早于肝脏形态学改变，随着肝纤维化程度加重，会出现肝内血流动脉化、肝脏血管分支存在异常吻合、肝动静脉瘘等[13]。应用超声造影时间强度曲线分析系统可以获得肝内动脉、门脉和微循环的血流灌注量化信息，对肝纤维化程度进行有效评估[14-16]。本研究发现随着大鼠肝纤维化的加重，由于纤维组织增生，肝毛细血管阻力增高，致使PI降低、AUC减小、HA-HVTT缩短，这种趋势也越来越明显。应用ROC曲线评估各指标诊断效能，发现AUC对不同分级的肝纤维化鉴别能力较好，而HA-HVTT与PI的诊断价值相当。

本研究的不足之处在于，作为动物实验，大鼠肝脏的解剖结构和生理病理状态下的功能改变与人体存在一定的差别，其检测结果与人体也可能存在不同。本研究采用的是高频线阵探头，而临床患者检查一般采用低频凸阵探头，是否会造成检测结果的差异尚需进一步研究证实；再者，有研究显示肝细胞炎症程度、肝功能异常、胆汁淤积等都会增加Vs[17]，尚需深入探讨它们对弹性检测值的影响；本研究所及参数对肝纤维化程度的诊断效能还需在有病理学检查对照的人群中进一步验证。

综上所述，本研究结果显示，Vs、AUC、HA-HVTT、PI均可以有效地评估肝纤维化程度。VTQ和超声微泡造影技术作为超声无创诊断肝纤维化程度的方法，值得临床进一步研究。

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本刊编辑部

Assessement of hepatic fibrosis by virtual tough tissues quantification and ultrasound microbubbles in rats

LIU Fang,HUANG Bin.
Department of Ultrasonography,Hangzhou Xixi Hospital,Hangzhou 310023,China

Objective To apply virtual tough tissues quantification(VTQ)and ultrasound microbubbles techniques in evaluation of hepatic fibrosis in rats. Methods Eighty four SPF male Sprague-Dawley rats were randomly divided into model group(n=70)and control group(n=14).Liver fibrosis was induced by injection of thioacetamide(TAA)in model group,while equal volume of normal saline was injected in control group.The liver shear wave velocity(Vs)was examined with VTQ,the time to peak(TTP),peak intensity(PI),mean transit time(MTT),AUC and hepatic artery to hepatic vein transit time(HA-HVTT)were determined with ultrasonic microbubbles. Results The degree of liver fibrosis in rats was positively correlated with Vs(r=0.887,P＜0.05),negatively correlated with PI,AUC and HA-HVTT(r=-0.615,-0.782 and-0.575,all P＜0.05).With the increase of hepatic fibrosis degree,Vs increased and Pi,AUC,HA-HVTT decreased.The sensitivity and specificity of Vs in diagnosis of liver fibrosis degree in rats were the highest,followed by AUC time,while those of HA-HVTTis and PI were similar. Conclusion VTQ and ultrasound microbubbles might be used in evaluating stages of liver fibrosis clinically and further studies should be conducted.

Liver fibrosis Virtual tough tissues quantification Microbubble Diagnosis Rats

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.24.2017-1908

浙江省自然科学基金资助项目（LY13H180015）作者单位：310023 杭州市西溪医院特检科

黄斌，E-mail：HB2K@163.com

2017-08-09）

李媚）