青蒿琥酯调节Claudin-5基因表达影响胶质瘤细胞力学特性的研究

连世忠 冯靖苗旺 郭庚 王宏勤 胡晓玲 宋彬 徐勇明 徐茗黄训 师如意

青蒿琥酯调节Claudin-5基因表达影响胶质瘤细胞力学特性的研究

连世忠1冯靖1苗旺1郭庚1王宏勤1胡晓玲2宋彬3徐勇明1徐茗4黄训5师如意2

目的检测青蒿琥酯(Art)对胶质瘤SHG44细胞中Claudin-5基因表达及细胞力学特性的影响。方法利用多聚酶链式反应法、原子力显微镜检测法、trans-well法分别检测Art对Claudin-5基因表达、SHG44细胞力学特性及细胞迁移能力等方面的影响。结果Art可显著上调细胞间紧密连接蛋白Claudin-5基因表达；同时可以明显改变SHG44细胞力学特性：30 mg/l Art处理后的细胞粘附力显著升高（2600±400） pN vs （3800±300） pN，细胞弹力显著下降（26±6） MPa vs（4.7±1.6)MPa，细胞表面粗糙度大幅上升（0.150±0.013） μm vs（0.330±0.022） μm，可有效抑制SHG44细胞的迁移。结论实验结果表明Art可以通过影响Claudin-5基因表达，从而改变SHG44细胞力学特性进而发挥其抗癌作用，是潜在的胶质瘤治疗新药。

青蒿琥酯； 胶质瘤； Claudin-5基因； 细胞力学特性

胶质瘤是人类神经系统常见的恶性肿瘤之一。随着人们生活方式的大幅改变，尤其是家电和通讯业的蓬勃发展，人们越来越多地受到来自各种通讯器材和电器的辐射，胶质瘤发病率及死亡率亦随之升高，如何降低发病率、提高患者治疗效果成为目前的研究重点[1]。因此，本文以人胶质瘤细胞SHG44为研究对象，通过对比青蒿琥酯（Artesunate，Art）处理前后SHG44细胞中Claudin-5基因表达变化情况、细胞力学变化情况以及细胞迁移能力变化情况，观察Art对细胞力学特性及迁移能力的影响，以期为Art作为潜在的抗胶质瘤新药提供有效的科学依据。

材料与方法

一、主要试剂和仪器

人胶质瘤SHG44细胞株（中科院上海生化与细胞生物所）；青蒿琥酯注射用灭菌粉末（广西桂林制药厂）；DMEM培养基及0.25%胰蛋白酶 （Gibco公司，美国）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，中国）；CO2培养箱（Thermo 公司，美国）；倒置显微镜（Olympus公司，日本）；PCR 仪（BD 公司，美国）；Agilent 5500 型原子力显微镜（Agilent公司，美国）。

二、细胞培养及药物处理

将人胶质瘤SHG44细胞株常规培养于37℃的CO2培养箱中至细胞贴壁。培养条件：细胞接种于DMEM培养基中 (含10%胎牛血清)；5%CO2+95%空气，100%湿度。每24 h换液1次，当细胞生长汇合时，用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)进行消化，按1∶2传代，细胞扩增后备用。

课题组前期细胞增殖实验结果提示，30 mg/l Art可以作为较为合适的用药浓度有效抑制SHG44的增殖[1]。因此，后续其他实验将30 mg/l Art作为有效药物浓度进行使用。

将6孔细胞培养板中放入灭菌的盖玻片，之后取对数生长期SHG44细胞，调整细胞浓度为4×105个/孔，接种于6孔培养板中培养24 h，待细胞贴壁之后，培养结束为对照组细胞，实验组细胞则需在培养基中加入30 mg/l Art继续对细胞进行处理24 h。

三、Claudin-5基因在Art处理前后表达情况

按照TAKARA PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]使用说明进行操作，分别提取对照组和30 mg/l Art实验组的RNA，并反转录为cDNA，之后进行25 μl体系的PCR 反应（buffer 5 μl，dNTP 2 μl，GaPDH 与Claudin-5两对上下游引物各 0.4 μl，酶 0.5 μl，其余由灭菌双蒸水补足 25 μl）；GaPDH 反应程序如下：98℃，3 min预变性，98℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 2 min，33 次 循环，72℃，8 min总延伸；Claudin-5反应程序如下：98℃，3 min 预变性，98℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 2 min，35次循环，72℃，8 min总延伸。内参基因GaPDH与Claudin-5基因引物序列见表1。

表1 GaPDH与Claudin-5基因引物序列表

四、原子力显微镜样品制备

将铺有对照组和30 mg/l Art实验组细胞的盖玻片分别用三蒸水缓慢冲洗，用1%戊二醛溶液固定15 min，再用蒸馏水小心冲洗3次，室温自然干燥后上机观察。

五、样品成像和粘弹性探测

将制备好的样品置于Agilent5500原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）载物台上，利用光学显微镜观察细胞的分散情况，在大气中应用AFM对样品进行扫描成像，在液相中应用AFM力谱对样品进行粘弹性探测。成像时，在操作软件中选择tapping模式，氮化硅型探针，微悬臂弹性系数为0.68 N/m，力谱探测时选用弹性系数为0.10 N/m的探针。AFM图像经过软件（Picoimage1.6和Gywddion2.26）平滑处理，以消除扫描方向上的低频背景噪音。对照组与30 mg/l Art实验组分别重复5次。

六、细胞迁移实验

取对照组和30 mg/l Art实验组细胞，在transwell上室中加入无血清DMEM培养基，每个transwell上室中接种 1×104个 SHG44细胞。Trans-well下室中，加入含10%FBS的DMEM培养基。24 h后，结晶紫染色浸润细胞，显微镜下选取不同视野计数。实验重复5次。

七、统计学分析

采用SPSS19.0软件进行统计学分析，2组结果之间比较采用t检验，实验结果以均数±标准差（x±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、Art对胶质瘤SHG44细胞中Claudin-5基因表达及细胞力学特性的影响

PCR检测结果表明，Art处理过的SHG44细胞其细胞间的紧密连接蛋白Claudin-5的表达量显著高于对照组（图1）；相较于对照组，实验组细胞间连接程度明显加大，细胞的粘附力显著升高 [（2600±400） pNvs （3800±300） pN；t=6.7×10-4，P＜0.05]，细胞弹力显著下降[（26±6） MPavs（4.7±1.6） MPa；t=6.41×10-6，P＜0.05]， 细胞表面粗糙度大幅上升 [（0.15±0.013） μmvs（0.33±0.022）μm；t=2.87×10-7，P＜0.05]，差异具有统计学意义，详见图2～3。

图1 青蒿琥酯处理前后SHG44细胞中Claudin-5表达情况

二、Art对胶质瘤SHG44细胞迁移能力的影响

Trans-well实验结果提示，Art处理过的SHG44细胞其细胞迁移能力受到了抑制，显著低于对照组细胞[（26±2.45） vs （59±5.92）；t=2.92×10-6，P＜0.05]，差异具有统计学意义（图4）。

讨 论

胶质瘤是人类神经系统常见的恶性肿瘤之一，给社会和患者家庭均造成了沉重的负担，开发高效、低毒、廉价的抗胶质瘤新药成为目前研究热点。中药Art是青蒿素的一种衍生物，是一个包含过氧化物基（-C-O-O-C-）的倍半萜框架复合物[3]。起初，Art主要被用作治疗疟疾，之后有研究表明Art可通过阻滞细胞周期、抑制肿瘤新生血管形成、调节肿瘤相关基因的表达等作用机制而实现抑癌作用[4-6]。因此，本研究以胶质瘤细胞系SHG44为研究对象，观察Art对胶质瘤细胞力学特性及细胞迁移能力的影响。

实验结果提示，经过Art处理的胶质瘤细胞其细胞间紧密连接蛋白Claudin-5表达大幅上调。Claudin家族是细胞间形成紧密连接过程中必不可少的蛋白组成成分。有研究表明，在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌等不同癌症中，Claudin家族成员无法正常表达，其功能受到抑制，最终导致恶性肿瘤的产生[7-11]。Claudin-5是Claudin家族中重要的成员之一，也是血脑屏障的主要组成成分，当其表达下调时，与脑胶质瘤的产生、患者血脑屏障功能减退有很大关系[12-14]。

图2 原子力显微镜检测青蒿琥酯处理前后SHG44细胞力学特性及细胞微观结构变化情况

图3 原子力显微镜检测青蒿琥酯处理前后SHG44细胞力学特性变化情况

图4 青蒿琥酯处理前后SHG44细胞迁移情况

当Art处理SHG44细胞后，Claudin-5表达显著上调，表明胶质瘤细胞之间的紧密连接程度升高，其潜在的迁移能力受到抑制，这与trans-well实验结果相互印证。通过AFM检测发现Art处理之后的单个SHG44细胞粘附力亦升高，导致其迁移能力大大降低，这与trans-well实验结果同样可以相互印证；实验组胶质瘤细胞的弹力经AFM检测发现呈显著性下降。细胞弹力是反映细胞变形能力的一个重要指标，其本质上所反映的是细胞膜的力学特性及细胞骨架的状态，弹力越大变形能力越高[15]。肿瘤细胞需要进行细胞变形才能完成侵袭、迁移等一系列生物学行为，弹力下降表明Art对SHG44的变形潜力起到了抑制作用[16]。

综上所述，笔者推测Art可能通过上调Claudin-5的表达，使得胶质瘤细胞间连接变紧密，并且影响胶质瘤细胞表面的生物大分子的结构，使得细胞表面粘附性增强，粗糙度大幅上升；同时，Art诱使SHG44细胞骨架变形，降低其细胞弹力，最终导致胶质瘤细胞变形能力下降，迁移受阻。本研究结果可从细胞力学新的方面为研究Art可能作为潜在的有效抑制胶质瘤的药物提供科学依据与理论基础。

[1] Lian S,Shi R,Huang X,et al.Artesunate attenuates glioma proliferation,migration and invasion by affecting cellular mechanical properties[J].Oncol Rep,2016,36(2):984-990.

[2] Karnati HK,Panigrahi M,Shaik NA,et al.Down regulated expression of claudin-1 and claudin-5 and up regulation of βcatenin:Association with human glioma progression[J].CNS Neurol Disord Drug Targets,2014,13(8):1413-1426.

[3] Liu WM,Gravett AM,Dalgleish AG.The antimalarial agent artesunate possesses anticancer properties that can be enhanced by combination strategies[J].Int J Cancer,2011,128(6):1471-1480.

[4] Krishna S,Bustamante L,Haynes RK,et al.Artemisinins:their growing importance in medicine[J].Trends Pharmacol Sci,2008,29(10):520-527.

[5] Meshnick SR.Artemisinin:mechanisms of action,resistance and toxicity[J].Int J Parasitol,2002,32(13):1655-1660.

[6] Efferth T,Sauerbrey A,Olbrich A,et al.Molecular modes of action of artesunate in tumor cell lines[J].Mol Pharmacol,2003,64(2):382-394.

[7] Shang X,Lin X,Alvarez E,et al.Tight junction proteins claudin-3 and claudin-4 controltumorgrowth and metastases[J].Neoplasia,2012,14(10):974-985.

[8] Iacobuzio-Donahue CA,Maitra A,Shen-Ong GL,et al.Discovery of novel tumor markers of pancreatic cancer using global gene expression technology.Discovery of novel tumor markers of pancreatic canceusing global gene expression technology[J].Am J Pathol,2002,160(4):1239-1249.

[9] Kramer F,White K,Kubbies M,et al.Genomic organization of claudin-1 and its assessment in hereditary and sporadic breast cancer[J].Hum Genet,2000,107(3):249-256.

[10] Szász AM1,Nyirády P,Majoros A,et al.Beta-catenin expression and claudin expression pattern as prognostic factors of prostatic cancer progression[J].BJU Int,2010,105(5):716-722.

[11] Ding L,Lu Z,Lu Q,et al.The claudin family of proteins in human malignancy:a clinical perspective[J].Cancer Manag Res,2013,5:367-375.

[12] Furuse M,Fujita K,Hiiragi T,et al.Claudin-1 and-2:novel integral membrane proteines localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin[J].J Cell Biol,1998,141(7):1539-1550.

[13] Morita K,Furuse M,Fujimoto K,et al.Claudin multigene family encoding four-transmembrane domain protein components of tight junction strands[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(2):511-516.

[14] Gu YT,Xue YX,Wang YF,et al.Minoxidil sulfate induced the increase in blood-brain tumor barrier permeability through ROS/RhoA/PI3K/PKB signaling pathway[J].Neuropharmacology,2013,75:407-415.

[15] Fletcher DA,Mullins RD.Cell mechanics and the cytoskeleton[J].Nature,2010,463(7280):485-492.

[16] Kumar S,Weaver VM.Mechanics,malignancy,and metastasis:The force journey of a tumor cell[J].Cancer Metastasis Rev,2009,28(1-2):113-127.

Effects of Artesunate on gene Claudin-5 expression which could influent cell mechanical properties in Glioma

Lian Shizhong1,Feng Jing1,Miao Wang1,Guo Geng1,Wang Hongqin1,Hu Xiaoling2,Song Bin3,Xu Yongming1,Xu Ming4,Huang Xun5,Shi Ruyi2.1Department of Neurosurgery,First Hospital of Shanxi medical University,Taiyuan 030001,China;2Basic Medical School,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;3Department of Oncology,First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;4First Clinical Medical College,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;5Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Ji’nan University,Guangzhou 510630,China

Shi Ruyi,Email:tomruyi@163.com

Objective To observe the effects of Artesunate(Art)on expression of gene Claudin-5 in Glioma and cell mechaniacal properties by different biological detecting methods. Methods After treated by Art,the expression of gene Claudin-5 in SHG44 had been detected by polymerase chain reaction method;cell migration had been detected by trans-well method.And we used atomic force microscope to observe the change of cell mechanical properties. Results The Art could upregulate the expression of gene Claudin-5,which is the intercellular tight junction protein,leading to change of the mechanical properties of SHG44 cells to inhibit SHG44 cell migration effectively.The cell adhesive force increased significantly after 30 mg/l Art treatment(2600±400)pN vs(3800±300)pN.And the cell elasticity decreased significantly after 30 mg/l Art treatment(26±6)MPa vs(4.7±1.6)MPa.The membrane surface roughness of SHG44 increased significantly(0.15±0.013)μm vs(0.33±0.022)μm after 30 mg/l Art treatment. Conclusion The Art,which could be a potential anti-tumor drug,could affect the biological characteristics of SHG44 through regulating the expression of gene Claudin-5 to resist Glioma.

Artesunate;Glioma;Gene Claudin-5;Cell mechanical properties.

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.06.009

山西省基础研究计划（2015011095）

030001 太原，山西医科大学第一医院神经外科1；030001 太原，山西医科大学基础医学院2；030001 太原，山西医科大学第一医院肿瘤科3；030001太原，山西医科大学第一临床医学院4；510630 广州，暨南大学附属第一医院骨科5

师如意，Email：tomruyi@163.com

2017-02-27）

张丽）

连世忠,冯靖,苗旺,等.青蒿琥酯调节Claudin-5基因表达影响胶质瘤细胞力学特性的研究[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志,2017,3(6):360-364.