诱导型神经干细胞对颅脑创伤后免疫细胞的影响

高谋 徐如祥 王海峰 许民辉 董勤 姚慧 张岩杨阳 党圆圆 张洪钿 杨志军

·基础研究·

诱导型神经干细胞对颅脑创伤后免疫细胞的影响

高谋1徐如祥1王海峰2许民辉1董勤1姚慧1张岩1杨阳1党圆圆1张洪钿1杨志军1

目的研究诱导型神经干细胞（iNSCs）移植对颅脑创伤（TBI）后小胶质细胞活化状态和反应性星形胶质细胞增生的影响。方法采用自由落体脑打击装置制备C57BL/6小鼠TBI模型，将1×106个iNSCs移植到TBI小鼠脑内，于移植后7 d处死动物，取材进行形态学研究。用双重免疫荧光染色，分别观察iNSCs移植对TBI小鼠脑内ED1和Iba1抗体双阳性的小胶质细胞、GFAP抗体阳性星形胶质细胞以及NeuN抗体阳性神经元的影响。结果TBI后小鼠脑内可见大量ED1和Iba1抗体双阳性的小胶质细胞和GFAP抗体阳性的星形胶质细胞，而iNSCs移植物明显减少了ED1和Iba1抗体双阳性的小胶质细胞和GFAP抗体阳性的星形胶质细胞的数量，并且明显减轻了NeuN抗体阳性的神经元的凋亡。结论iNSCs移植物在TBI小鼠脑内，可调控小胶质细胞活化状态，抑制反应性星形胶质细胞增生，有利于神经元存活。

诱导型神经干细胞； 小胶质细胞； 星形胶质细胞； 颅脑创伤； 移植

近年来，越来越多的研究报道了干细胞移植在中枢神经系统疾病治疗中所发挥的作用和机制[1]。既往研究已经证实由个体体细胞经过体外重编程操作而获得的诱导型神经干细胞（induced neural stem cells，iNSCs）可在同源宿主脑内长期存活，并能分化为神经细胞，且不形成肿瘤也不引起免疫排斥反应[2-4]。此外，笔者发现颅内移植的iNSCs能够促进大脑中动脉栓塞动物的神经功能恢复[2]。然而，有学者认为iNSCs移植并未起到细胞替代的作用[5]。可见，针对iNSCs移植的疗效和作用机制仍有待阐明。理论上，iNSCs的生物学特性类似于NSCs，现已知NSCs可与多种免疫细胞相互作用，抑制颅脑创伤（traumatic brain injury，TBI）后炎症反应，为神经细胞存活创造适宜的微环境[6-8]。然而，国内外少有研究报道iNSCs移植对TBI后炎症反应的作用。为此，本研究用自由落体脑打击装置制备了C57BL/6小鼠TBI模型，并将由C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞直接重编程产生的iNSCs经立体定向注射到TBI小鼠脑内，通过观察脑组织中小胶质细胞活化状态和反应性星形胶质细胞增生，探讨iNSCs移植是否影响TBI后炎症反应及其作用机制，现报道如下。

材料与方法

一、实验动物

健康成年雄性C57BL/6小鼠40只，体质量24～30 g。所有实验动物（无特定病原体级）均购于北京维通利华公司。

二、主要实验仪器和试剂

仪器：CO2培养箱（美国Thermo公司），超净工作台（美国ESCO公司），倒置相差显微镜、CM1950冰冻切片机、TCS SP5Ⅱ激光共聚焦显微镜和DM3000荧光显微镜（德国Leica公司），小鼠数字化脑立体定向仪（美国Stoelting公司）。

试剂：DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、B27、碱性成纤维细胞生长因子 （basic fibroblast growth factor，bFGF）、 表 皮 生 长 因 子 （epidermal growth factor，EGF）、Accutase 酶、左旋谷酰胺和磷酸盐缓冲液 （phosphate buffered solution，PBS）（美国Invitrogen公司），牛血清白蛋白 （bovine serum albumin，BSA）（美国 Sigma公司），ED1 抗体（工作浓度：5 μg/ml）和 Iba1 抗体（工作浓度：1 μg/ml）（美国Abcam 公司），GFAP 抗体 （工作浓度：0.5 μl/ml）（美国 CST 公司），NeuN 抗体（工作浓度：5 μg/ml）（美国Millipore公司），Alexa Fluor®633标记驴抗小鼠ED1 抗体（工作浓度：2 μg/ml）、Alexa Fluor® 555 标记驴抗山羊 Iba1 抗体 （工作浓度：2 μg/ml）、Alexa Fluor® 633标记山羊抗兔GFAP抗体（工作浓度：2 μg/ml）和Alexa Fluor® 555标记驴抗小鼠NeuN抗体 （工作浓度：2 μg/ml）（美国 Life Tech 公司），4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美国 SouthernBiotech 公司）。

三、C57BL/6小鼠iNSCs体外培养

由C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞经过体外重编程操作而产生的iNSCs用含 2%B27、20 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF、0.05%BSA 和 2 mmol/l左旋谷酰胺的DMEM/F12与Neurobasal等体积混合培养基培养。用Accutase酶消化法制备单细胞悬液，并用PBS漂洗3遍，调整细胞密度为2×105个/μl放置于离心管中冰浴。

四、C57BL/6小鼠TBI模型制备和iNSCs移植

用异氟烷气体麻醉剂麻醉小鼠，并将其固定于脑立体定向仪上，备皮消毒，铺无菌洞巾，切开皮肤，暴露前囟，以lambda缝向喙侧2.0 mm、中线偏右侧2.0 mm为撞击点。用自由落体脑打击装置，撞针直径3.0 mm，制备TBI模型。设置假手术（sham）组（10只），仅切开头皮，不实施撞击。于伤后1 h对30只TBI小鼠进行神经功能缺损评分（neurological severity scores，NSS），将 NSS 为 4～8 分者（20 只）纳入TBI组并随机分为2组：iNSCs移植组 （10只）和PBS处理组（10只）。于TBI后12 h，再次麻醉小鼠，并将其固定于脑立体定向仪上，消毒铺巾，暴露前囟，以lambda缝向喙侧5.0 mm、中线偏右侧1.0 mm、硬膜下2.0 mm为注射位点，用25 μl 22 s微量进样器以0.5 μl/min的速度注射5 μl细胞悬液，细胞总量为1×106个，结束后留针5 min，缝合头皮。PBS处理组以同样方式注射等体积PBS。

五、脑组织冰冻切片、病理染色和双重免疫荧光染色

细胞移植后7 d采用随机数字表法从各组中选取6只动物进行处死，灌注固定后取出大脑，并作大脑冠状面连续冰冻切片，切片厚度为10 μm。用苏木素-伊红染色观察脑组织病理形态学特征。根据病理染色结果挑选脑组织切片进行双重免疫荧光染色，用10%BSA/0.3%TritonX-100封闭1 h后，分别加入 ED1 抗体（工作浓度：5 μg/ml）、Iba1 抗体（工作浓度：1 μg/ml）、GFAP 抗体 （工作浓度：0.5 μl/ml）和NeuN 抗体（工作浓度：5 μg/ml）在 4℃孵育过夜。 用PBS漂洗后，分别加入Alexa Fluor®633标记驴抗小鼠 ED1 抗体 （工作浓度：2 μg/ml）、Alexa Fluor®555标记驴抗山羊Iba1抗体 （工作浓度：2 μg/ml）、Alexa Fluor®633标记山羊抗兔GFAP抗体（工作浓度：2 μg/ml） 和 Alexa Fluor®555 标记驴抗小鼠NeuN 抗体（工作浓度：2 μg/ml），室温避光孵育 2 h。用DAPI染细胞核，封片后，在荧光显微镜下观察，在20×镜下随机选取6个视野，计数阳性细胞数（特异性抗体标记）和总细胞数（DAPI标记），计算阳性细胞百分率（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%。

六、统计学分析

用SPSS17.0软件进行统计学处理分析。小鼠脑内ED1和Iba1抗体双阳性的小胶质细胞、GFAP抗体阳性星形胶质细胞和NeuN抗体阳性神经元的数量以均数±标准差（x±s）表示，资料先进行正态性检验和方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用LSD-t检验，计算F值和P值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、INSCs移植物减少TBI小鼠脑内 ED1和Iba1抗体双阳性的小胶质细胞数量

在TBI后7 d，sham组小鼠脑组织中少见Iba1抗体阳性的小胶质细胞表达ED1（图1）。与之相比，PBS处理组小鼠脑组织中可见大量ED1和Iba1抗体双阳性的小胶质细胞 （图1）。此外，研究发现iNSCs移植组小鼠脑组织中虽然可见大量Iba1抗体阳性的小胶质细胞，但是仅有少数Iba1抗体阳性的小胶质细胞表达ED1（图1）。经统计分析进一步发现：与sham组相比，PBS处理组和iNSCs移植组小鼠脑组织中ED1和Iba1抗体双阳性的小胶质细胞数量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。然而，与PBS处理组相比，iNSCs移植组小鼠脑组织中ED1和Iba1抗体双阳性的小胶质细胞数量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。

二、iNSCs移植物减少TBI小鼠脑内GFAP抗体阳性星形胶质细胞数量

在TBI后7 d，sham组小鼠脑组织中少见GFAP抗体阳性的星形胶质细胞，而可见大量排列规则的NeuN抗体阳性的神经元（图2）。与之相比，PBS处理组小鼠脑组织中可见大量GFAP抗体阳性的星形胶质细胞而少见NeuN抗体阳性的神经元 （图2）。经统计分析发现：与sham组相比，PBS处理组和iNSCs移植组小鼠脑组织中GFAP抗体阳性的星形胶质细胞数量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。 然而，与 PBS 处理组相比，iNSCs移植组小鼠脑组织中GFAP抗体阳性的星形胶质细胞数量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。 此外，与sham组相比，PBS处理组和iNSCs移植组小鼠脑组织中NeuN抗体阳性的神经元数量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。 而与 PBS 处理组相比，iNSCs移植组小鼠脑组织中NeuN抗体阳性的神经元数量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。

图1 诱导型神经干细胞移植物减少颅脑损伤小鼠脑内ED1和Iba1抗体双阳性的小胶质细胞数量（×400）

讨 论

小胶质细胞和星形胶质细胞是TBI后炎症反应的重要参与者，二者可接受多种类型的刺激，通过调整自身活化状态，做出应答，从而在介导神经损伤与修复等病理生理过程中发挥出关键性作用[9-11]。与既往文献报道相符，笔者观察到TBI后小胶质细胞数量明显增加，并以ED1抗体阳性的小胶质细胞活化为主[12,13]。ED1抗体阳性的小胶质细胞可促进炎症反应，因而ED1抗体阳性的小胶质细胞数量与TBI后炎症反应程度呈正相关[14]。本研究中发现iNSCs移植物可有效减少TBI小鼠脑内ED1抗体阳性的小胶质细胞数量，这不仅再次证明了iNSCs移植物在同源宿主脑内不会引起免疫排斥反应，也表明了iNSCs移植物可通过调控小胶质细胞的活化状态从而减轻TBI后炎症反应。

在TBI后，小胶质细胞激活的同时会伴有反应性星形胶质细胞增生[15,16]。与ED1抗体阳性的小胶质细胞相似，反应性星形胶质细胞增生的程度也可反映TBI后炎症反应的程度[17,18]。现已知，TBI后炎症反应中，反应性星形胶质细胞增生对神经修复和神经再生而言是一柄双刃剑，可发挥神经保护作用，也可因为过度增生而引起继发性神经损伤[19]。在TBI小鼠脑内，笔者观察到反应性星形胶质细胞增生形成的胶质瘢痕，这些胶质瘢痕能够形成一种屏障，阻碍轴突生长而不利于神经发生。通过移植iNSCs，本研究发现TBI小鼠脑内胶质瘢痕明显减少了，这说明iNSCs移植物能够抑制反应性星形胶质细胞增生，起到减轻炎症反应的作用。此外，在接受iNSCs移植物的TBI小鼠脑内，可发现神经元数量明显增加了，由此可知，移植iNSCs发挥了神经保护的作用。

表1 颅脑损伤后7 d，各组小鼠脑内特异性抗体标记细胞的百分率（x±s，%）

图2 诱导型神经干细胞移植物减少颅脑损伤小鼠脑内GFAP抗体阳性星形胶质细胞数量（×400）

综上所述，iNSCs移植物可影响TBI后炎症反应中小胶质细胞活化状态和反应性星形胶质细胞增生。在TBI后早期移植iNSCs能通过调控小胶质细胞活化状态，抑制反应性星形胶质细胞增生，减轻炎症反应，起到神经保护作用，从而有利于神经元存活。虽然本研究也已明确iNSCs能抑制TBI后炎症反应发挥神经保护作用，并基本阐明其作用机制是iNSCs与中枢神经系统内免疫效应细胞间的相互作用，但在后续研究中，笔者仍将重点关注iNSCs是如何影响小胶质细胞和星形胶质细胞活化状态的。

[1] Goldman SA.Stem and progenitor cell-based therapy of the central nervous system:hopes,hype,and wishful thinking[J].Cell Stem Cell,2016,18(2):174-188.

[2] Yao H,Gao M,Ma J,et al.Transdifferentiation-induced neural stem cells promote recovery of middle cerebral artery stroke rats[J].PloS One,2015,10(9):e0137211.

[3] Gao M,Yao H,Dong Q,etal.Tumourigenicity and immunogenicity of induced neural stem cell grafts versus induced pluripotent stem cell grafts in syngeneic mouse brain[J].Sci Rep,2016,6:29955.

[4] 高谋,徐如祥,许民辉,等.诱导神经干细胞与诱导多能干细胞在同源宿主脑内的致瘤性及免疫原性研究[J].中华神经创伤外科电子杂志,2016,2(6):350-354.

[5] Kim HS,Kim J,Jo Y,et al.Direct lineage reprogramming of mouse fibroblasts to functional midbrain dopaminergic neuronal progenitors[J].Stem Cell Res,2014,12(1):60-68.

[6] Kokaia Z,Martino G,Schwartz M,et al.Cross-talk between neural stem cells and immune cells:the key to better brain repair[J].Nat Neurosci,2012,15(8):1078-1087.

[7] Gao M, Yao H, Dong Q, et al. Neurotrophy and immunomodulation of induced neural stem cell grafts in a mouse model of closed head injury[J].Stem Cell Res,2017,23:132-142.

[8] 高谋,徐如祥,杨志军,等.两种干细胞对颅脑创伤炎症反应调控作用的对比研究[J].第三军医大学学报,2015,37(17):1697-1703.

[9] Cartier N,Lewis CA,Zhang R,et al.The role of microglia in human disease:therapeutic tool or target[J].ActaNeuropathol,2014,128(3):363-380.

[10] Amor S,Woodroofe MN.Innate and adaptive immune responses in neurodegeneration and repair[J].Immunology,2014,141(3):287-291.

[11] Sofroniew MV.Astrocyte barriers to neurotoxic inflammation[J].Nat Rev Neurosci,2015,16(5):249-263.

[12]Corps KN,Roth TL,McGavern DB.Inflammation and neuroprotection in traumatic brain injury[J].JAMA Neurol,2015,72(3):355-362.

[13] Kumar A,Barrett JP,Alvarez-Croda DM,et al.NOX2 drives M1-like microglial/macrophage activation and neurodegeneration following experimental traumatic brain injury[J].Brain BehavImmun,2016,58:291-309.

[14] Hernandez-Ontiveros DG,Tajiri N,Acosta S,et al.Microglia activation as a biomarker for traumatic brain injury[J].Front Neurol,2013,4:30.

[15] Mouzon BC, Bachmeier C, Ferro A, et al. Chronic neuropathological and neurobehavioral changes in a repetitive mild traumatic brain injury model[J].Ann Neurol,2014,75(2):241-254.

[16] Glushakova OY,Johnson D,Hayes RL.Delayed increases in microvascular pathology after experimental traumatic brain injury are associated with prolonged inflammation,blood-brain barrier disruption,and progressive white matter damage[J].J Neurotrauma,2014,31(13):1180-1193.

[17] Mayo L,Trauger SA,Blain M,et al.Regulation of astrocyte activation by glycolipids drives chronic CNS inflammation[J].Nat Med,2014,20(10):1147-1156.

[18] RothhammerV,MascanfroniID,BunseL,etal.TypeI interferons and microbial metabolites of tryptophan modulate astrocyte activity and central nervous system inflammation via the aryl hydrocarbon receptor[J].Nat Med,2016,22(6):586-597.

[19] XanthosDN,SandkuhlerJ.Neurogenic neuroinflammation:inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity[J].Nat Rev Neurosci,2014,15(1):43-53.

Effects of induced neural stem cells on immune cells following traumatic brain injury

Gao Mou1, Xu Ruxiang1,Wang Haifeng2,Xu Minhui1,Dong Qin1,Yao Hui1,Zhang Yan1,Yang Yang1,Dang Yuanyuan1,Zhang Hongtian1,Yang Zhijun1.1Affiliated Bayi Brain Hospital,General Hospital of PLA Army,Beijing 100700,China;2Department of Neurotrauma,First Hospital of Jilin University,Changchun 130021,China

Xu Ruxiang,Email:zjxuruxiang@163.com

Objective To study the effects of grafted induced neural stem cells (iNSCs)on microglia activation states and reactive astrogliosis following traumatic brain injury(TBI). Methods TBI models were established using a standardized weight-drop device.At 12 h after TBI,a total of 1×106iNSCs were transplanted into the brains of TBI mice.On day 7 after TBI,animals were sacrificed for morphological analysis.Double-labeling experiments were utilized to determine the effects of iNSC grafts on ED1-and Iba1-positive microglia,GFAP-positive astrocytes and NeuN-positive neurons in the brains of TBI mice. Results Following TBI,we observed dramatic increases in the numbers of ED1-and Iba1-positive microglia and GFAP-positive astrocytes in the brains of TBI mice.However,grafted iNSCs significantly suppressed the numbers of ED1-and Iba1-positive microglia and GFAP-positive astrocytes in the brains of TBI mice.Additionally,iNSC grafts substantially reduced the levels of apoptotic NeuN-positive neurons in the brains of TBI mice. Conclusion INSC grafts can modulate microglia activation states and inhibit reactive astrogliosis to promote neuronal survival post-TBI.

Induced neural stem cell; Microglia; Astrocyte; Traumatic brain injury;Transplantation

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.06.008

国家自然科学基金面上项目（81671189；全军“十三五”军事医学创新工程项目（16CXZ001）

100700 北京，陆军总医院附属八一脑科医院1；130021长春，吉林大学第一医院神经创伤外科2

徐如祥，Email：zjxuruxiang@163.com

2017-10-26）

马帅）

高谋,徐如祥,王海峰,等.诱导型神经干细胞对颅脑创伤后免疫细胞的影响[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志,2017,3(6):355-359.