优化微波和甘油联合预处理稻草粉酶解工艺

(徐州生物工程职业技术学院，江苏徐州，221006)

优化微波和甘油联合预处理稻草粉酶解工艺

丁梁斌

(徐州生物工程职业技术学院，江苏徐州，221006)

目的：探讨微波和甘油联合预处理对稻草粉酶解效果的影响。方法：采用响应面法，以固液比、微波加热时间、还原糖浓度为因素，考察对还原糖浓度的影响。结果：液固比为19.08∶1、微波处理时间为6.58min、微波功率为278.16W，此时还原糖浓度将为509.95μg/mL。结论：微波和甘油联合预处理对稻草粉酶解效果较微波预处理和甘油预处理更为显著。

联合预处理 还原糖浓度 稻草粉 酶解

甘油与微波联合预处理时在提供蒸汽压力造成原材料中间结构爆破方面与蒸汽爆破法预处理相似，都是可产生蒸汽爆破。但甘油与水互溶后，则其沸点比纯水更低，更容易产生蒸汽形成爆破，且处理条件温和，对环境污染小。目前研究较少，这种方法为水稻秸秆预处理提出了一个新的方向，本文在微波预处理和甘油预处理的基础上，对微波和甘油联合预处理进行了研究，为稻草粉酶解工艺提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验原料

水稻秸秆：水稻秸秆，取自徐州附近农田，经烘干后备用。纤维素酶：采用国药集团化学试剂有限公司提供的1.5万U/g绿色木霉产的高活性纤维素酶。

1.1.2 实验试剂

(1) DNS溶液的制备

称取6.3g DNS和263mL的2mol/L的NaOH溶液，加入500mL去离子水(含有182g酒石酸钾钠)溶液中，搅拌均匀，之后加入5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌使其溶解，冷却后加水定容至1000mL，低温保存于棕色瓶中。

(2) pH值4.8缓冲溶液的制备

分别配制0.1mol/L的柠檬酸和柠檬酸钠溶液，混合两种溶液，以pH计校准，使其pH值为4.8。

(3)纤维素酶溶液的制备

精密称取0.1g纤维素酶，以pH值4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液定容至50mL，于4℃条件下暂存。酶溶液现配现用，一般不超过2h。

(4)葡萄糖标准溶液的制备

精密称取干燥恒重的葡萄糖0.5g，经少量水溶解后加3mL 12mol/L的浓硫酸，以去离子水定容至1000mL即为500μg/mL葡萄糖标准溶液。

1.1.3 实验器材

万用电炉(兴化市腾厂电气设备有限公司)，电子天平购(上海方瑞仪器厂)，分光光度计(厦门森态仪器仪表有限公司)，电热恒温鼓风干燥器(上海笃特DHG-9023A数显电热恒温鼓风干燥箱)，微波炉(美的M1-L202B微波炉)，恒温水浴摇床(星罗棋布公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 还原糖浓度的测定

1.2.1.1 葡萄糖标准曲线的绘制

取6支试管，按表1的顺序加入各种试剂。加入纯净水振荡后，在540nm下检测，以1号管为空白管，记录吸光度A为540nm。横坐标为吸光度，纵坐标为葡萄糖浓度，所拟合的曲线R值为0.9948，拟合度良好。

表1 葡萄糖标准曲线的测定方法

1.2.1.2 还原糖浓度的测定步骤

从处理过的水稻秸秆粉样品中，分别精密称取(0.05±0.001)g，加入对应编号试管中，用移液管移取配制好的纤维素酶溶液2.5mL，再加入pH值4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液2.5mL，混合均匀。50℃下，将上述混合溶液150rpm振荡进行催化反应1个小时后，置于沸水浴2min终止酶解反应，并过滤迅速进行还原糖浓度的测定[1]。用DNS法测定还原糖浓度(CRed)，并以此代表酶解效果。

1.2.1.3 还原糖浓度的测定方法

先将试管放入沸水浴中2min，目的是使酶失活，接着吸取0.5mL待测液加入试管中，加入DNS溶液0.5mL，于沸水中水浴5min后冷却，再加入4mL蒸馏水，测定其吸光度，通过对照葡萄糖标准曲线，查出还原糖含量(μg)。

1.2.2 微波与甘油联合预处理水稻秸秆的响应面分析实验考察

1.2.2.1 液固比对微波与甘油联合预处理效果的影响

向每个玻璃瓶中加入水稻秸秆粉1.0g，接着按照液固比和甘油质量分数的要求，向各玻璃瓶中加入一定量蒸馏水和甘油，使液固比为10:1、20:1、30:1、40:1和50:1，甘油质量分数为70%。用玻璃棒搅拌均匀后，封口静置4d。在保鲜膜封口上打一个小眼，接着用微波炉在微波功率为320W时，加热6min[2]。洗涤，过滤后，于65℃烘箱内烘干至恒重。从5组不同液固比的甘油预处理的水稻秸秆粉中，分别精密称取(0.05±0.001)g，测其对应的CRed。根据测得的数据绘制液固比对微波与甘油联合预处理后还原糖浓度的影响曲线(见图1)，横坐标为液固比，纵坐标为还原糖浓度(μg/mL)。

图1 不同液固比对应的还原糖浓度(微波与甘油联合预处理)

从图1可以看出液固比对微波与甘油联合预处理后还原糖浓度的影响：在一定范围内，随着液固比的增加，水稻秸秆粉酶解效果增加；当超过这个范围后，随着液固比的增加，水稻秸秆粉酶解效果降低，在本设计的实验中液固比为20:1的效果较好。

1.2.2.2 微波功率对微波与甘油联合预处理效果的影响

向每个玻璃瓶中加入水稻秸秆粉1.0g，接着按照液固比20:1和甘油质量分数70%的要求，向各玻璃瓶中加入一定量蒸馏水和甘油。用玻璃棒搅拌均匀后，封口静置4d。在保鲜膜封口上打一个小眼，分别在微波功率为160W、320W、480W、640W和800W的条件下，加热6min。洗涤，过滤后，于65℃烘箱内烘干至恒重。从5组不同微波功率的微波与甘油联合预处理的水稻秸秆粉中，分别精密称取(0.05±0.001)g，测其对应的CRed。根据测得的数据绘制微波功率对微波与甘油联合预处理后还原糖浓度的影响曲线(见图2)。

图2 不同微波功率对应的还原糖浓度(微波与甘油联合预处理)

从图2可以看出不同微波功率对微波与甘油联合预处理后还原糖浓度的影响：在一定范围内，随着微波功率的增加，水稻秸秆粉酶解效果增加；当超过这个范围后，随着微波功率的增加，水稻秸秆粉酶解效果降低。在本设计的实验中，微波加热时间为6min，其最佳微波功率为320W。

1.2.2.3 微波加热时间对微波与甘油联合预处理效果的影响

向每个玻璃瓶中加入水稻秸秆粉1.0g，接着按照液固比20:1和甘油质量分数70%的要求，向各玻璃瓶中加入一定量蒸馏水和甘油。用玻璃棒搅拌均匀后，封口静置4d。在保鲜膜封口上打一个小眼，在微波功率为320W的条件下，分别加热2min、4min、6min、8min、10min。洗涤，过滤后，于65℃烘箱内烘干至恒重。从5组不同微波加热时间的微波与甘油联合预处理的水稻秸秆粉中，分别精密称取(0.05±0.001)g，测其对应的CRed。根据测得的数据绘制微波加热时间对微波与甘油联合预处理后还原糖浓度的影响曲线(见图3)。

图3 微波加热时间对应的还原糖浓度(微波与甘油联合预处理)

从图3可以看出不同微波加热时间对微波与甘油联合预处理后还原糖浓度的影响：在一定范围内，随着微波加热时间的增加，水稻秸秆粉酶解效果增加；当超过这个范围后，随着微波加热时间的增加，水稻秸秆粉酶解效果呈下降趋势。在本设计的实验中，微波功率为320W，其微波最佳加热时间为6min。

1.2.2.4 甘油质量分数对微波与甘油联合预处理效果的影响

向每个玻璃瓶中加入水稻秸秆粉1.0g，接着按照液固比20:1和甘油质量分数的要求，向各玻璃瓶中加入一定量蒸馏水和甘油，使甘油质量分数为50%、60%、70%、80%、90%。用玻璃棒搅拌均匀后，封口静置4d。在保鲜膜封口上打一个小眼，在微波功率为320W的条件下加热6min。洗涤，过滤后，于65℃烘箱内烘干至恒重。从5组不同甘油质量分数的微波与甘油联合预处理的水稻秸秆粉中，分别精密称取(0.05±0.001)g，测其对应的CRed。根据测得的数据绘制甘油质量分数对微波与甘油联合预处理后还原糖浓度的影响曲线(见图4)。

图4 甘油质量分数对应的还原糖浓度(微波与甘油联合预处理)

从图4可以看出不同甘油质量分数对微波与甘油联合预处理后还原糖浓度的影响：在一定范围内，随着甘油质量分数的增加，还原糖浓度迅速增大；当超过这个范围后，随着甘油质量分数的增加，水稻秸秆粉酶解效果增加不明显。这说明了甘油质量分数对甘油预处理后还原糖浓度有一定的影响，其有一个较为合适的甘油质量分数，在本设计的实验中甘油质量分数为70%的效果就已经较好。

2 微波与甘油联合预处理水稻秸秆的响应面分析实验

2.1 响应面试验设计和实验结果

在确定甘油质量分数和甘油预处理时间的条件下采用响应曲面法对液固比、微波功率、微波加热时间三个因素进行优化。按照表2列出了各自变量的实验水平及其编码，设计3因素3水平的响应面试验[3](表3)。

表2 响应曲面法实验设计中变量的水平和编码

表3 微波与有机溶剂甘油联合预处理水稻秸秆中部分因素响应面分析实验

2.2 二次多元回归模型分析

以Design—Expert8.0.5软件处理，对上述数据(表3)进行二次多元回归拟合，最后得到二次多次多元回归方程如下：

Y(还原糖浓度(μg/ml))=506.99-9.57A+9.10B-9.55C+1.61AB-0.35AC-44.85BC-49.10A2-37.13B2-41.97C2

由分析结果(表4)的数据可知，模型的值为11.28，P<0.01，表现为极显著，初步说明此模型可以进行预处理的预测和拟合[4]；失拟项为0.05378，表现为不显著，说明失真情况不大；复相关系数R=0.9855，说明该方程拟合度良好[5]。试验中的液固比、微波处理时间和微波功率大小的交互作用对还原糖浓度影响是显著的。

表4 微波与甘油联合预处理水稻秸秆的部分因素响应面分析实验的分析

注：复相关系数R=0.9855；离散系数C.V.=4.23%；P<0.05为显著，P<0.01为极显著。

利用Design—Expert8.0.5软件对表4中的相关数据进行二次多元回归拟合，最后可得到二次回归方程的响应面[6](图5、6、7)。从图5、6、7中可以看出：液固比(X∶1)、微波加热时间(min)、微波功率(W)3因素的交互作用对还原糖浓度(μg/ml)的影响非常显著，当某一因素固定时，还原糖的浓度随着另外两个因素的增大而增加迅速，达到峰值后略有所降低。对3因素交互作用影响产还原糖浓度进行分析和评价，最佳的工艺参数确定为：液固比19.08∶1、微波处理时间为6.58min、微波功率为278.16W，此时还原糖浓度将为509.95μg/mL。

F值可以判断各因素对水稻秸秆水解效果的影响程度，F值越大，表明其影响程度越大[7]。显然，各因素对水稻秸秆水解效果的影响次序为：微波功率和微波加热时间>液固比>微波功率>微波加热时间。

响应面分析法关于液固比、微波功率、微波加热时间的分析，有各因素对秸秆水解效果的影响分别是：微波功率和微波加热时间>甘油质量分数>液固比>微波功率>微波加热时间>甘油预处理时间。考虑到效果和节约两方面，认为液固比19.08∶1、微波加热时间6.58min、微波功率278.16W，甘油质量分数70%，甘油预处理时间4d时，预处理效果较好，此时还原糖浓度为509.95μg/mL。

图5 微波加热时间和液固比对还原糖浓度的影响

图6 微波功率和液固比对还原糖浓度的影响

图7 微波功率和微波加热时间对还原糖浓度的影响

3 结论

甘油中加少量的水处理水稻秸秆粉一定时间，再在微波中处理，其原理与蒸汽爆破类似，只是将水蒸汽变成了甘油溶液，这种方法其实就是结合法，它确实可以提高水稻秸秆酶解后产还原糖的浓度。它的具体原理可能是：当微波处理使水稻秸秆粉内温度超过200℃时，纤维素和木质素等各组分间连接的部分化学键如氢键、碳-碳共价键发生断裂，纤维素和木质素间空隙增大，结果使纤维素与酶的接触机会增大，所以较大地提高了水稻秸秆经纤维素酶酶解后产生的还原糖浓度。与蒸汽爆破处理不同之处在于，本预处理方法基本上是在常压下进行的，而且处理温度较低。

[1] 彦繁鹤，周金梅，吴如春.DNS法测定甘蔗渣中还原糖含量[J].食品研究与开发，2015(2)：126-128.

[2]王霞，王岚，陈思宇，等.微波辅助稻草预处理提取纤维素实验条件研究[J].广州化工，2013，41(18)：58-59.

[3] Guldiken B, Boyacioglu D, Capanoglu E. Optimization of Extraction of Bioactive Compounds from Black Carrot Using Response Surface Methodology (RSM)[J]. Food Analytical Methods, 2016，9(7)：1876-1886.

[4] Arumugam S, Sriram G, Rajmohan T. Multi-Response Optimization of Epoxidation Process Parameters of Rapeseed Oil Using Response Surface Methodology (RSM)-Based Desirability Analysis[J]. Arabian Journal for Science and Engineering, 2014，39(3)：2277-2287.

[5] 李莉，张赛，何强，等.响应面法在试验设计与优化中的应用[J].实验室研究与探索, 2015，34(8)：41-45.

[6] Shen Z, Huang Z, Wu S, et al. Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Glycopeptide from Natto by Response Surface Methodology[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science & Technology, 2014，14(7)：110-117.

StudyonPretreatmentofStrawPowderprecessbyOptimizationofMicrowaveCombinedwithGlycerol

DingLiangbin

(XuzhouVocationgalCollegeofBioengineering,Xuzhou221006,JiangSu,China)

Objective: To investigate the effect of microwave pretreatment and glycerol solution effect on straw powder enzyme. Methods: The influence of the ratio of solid to liquid, the time of microwave heating and the concentration of reducing sugar on the concentration of reducing sugar was studied by Response Surface Methodology. Results: The liquid solid ratio is 19.08:1, the microwave treatment time is 6.58min, and the microwave power is 278.16W. At this time, the concentration of reducing sugar was 509.95 g/mL. Conclusion: The effects of microwave and glycerol pretreatment on the hydrolysis of rice straw powder were more significant than those of microwave pretreatment and glycerol pretreatment.

combined pretreatment; reducing sugar concentration; straw powder; enzymolysis