瘢痕灸肝俞穴、足三里穴对原发性肝癌大鼠Wnt10b、Wnt3a表达的影响❋

王 颖，赵万爽，张晓露，李 迪，胡晓龙，李梦迪，陈 金，王琪格

(1. 辽宁中医药大学针灸推拿学院， 沈阳 110847； 2. 辽宁中医药大学第一临床学院， 沈阳 110847)

【针灸研究】

瘢痕灸肝俞穴、足三里穴对原发性肝癌大鼠Wnt10b、Wnt3a表达的影响❋

王 颖1，赵万爽1，张晓露1，李 迪1，胡晓龙1，李梦迪1，陈 金1，王琪格2

(1. 辽宁中医药大学针灸推拿学院， 沈阳 110847； 2. 辽宁中医药大学第一临床学院， 沈阳 110847)

目的：探讨瘢痕灸肝俞穴、足三里穴对原发性肝癌大鼠Wnt/β-catenin信号传导通路中Wnt3a、Wnt10b表达的影响。方法：健康雄性Wistar大鼠随机分成对照组、模型组、阿霉素组、肝俞组、足三里组，通过注射二乙基亚硝胺制备肝癌模型，用RT-PCR检测各组Wnt3a、Wnt10b表达量，观察肝细胞结构和形态变化。结果：与对照组比较，模型组、阿霉素组、肝俞组和足三里组Wnt3a、Wnt10b表达量均显著升高；与模型组比较，阿霉素组、肝俞组和足三里组表达量降低；与阿霉素组比较，肝俞组、足三里组表达幅度下降；与肝俞组比较，足三里组表达量升高。镜下观察可见，对照组为正常肝细胞，模型组细胞有假小叶形成，阿霉素组有明显增生灶，肝俞组细胞核多形、核浆部分消失，足三里组纤维样变。结论：瘢痕灸肝俞穴、足三里穴对原发性肝癌大鼠有治疗效果，其机制可能是通过调节Wnt/β-catenin信号传导通路中Wnt3a、Wnt10b的表达量来实现的。

瘢痕灸；肝俞；足三里；原发性肝癌；Wnt3a；Wnt10b

肝癌是临床常见疾病，在我国有很高的发病率，每年约有15万人死于本病，占全世界肝癌死亡人数的45%[1]。且肝癌发病时不易被察觉，多数人确诊时已经处于晚期[2]。手术是目前治疗肝癌最有用的方法，但对于多数中晚期肝癌患者来说并不适用[3]。

相关研究表明，33%～67%的肿瘤中可发现Wnt/β-catenin信号通路，其中原发性肝癌(Hepatic Carcinoma，HCC)中约占30%～70%，且通路中Wnt3a、Wnt10b的表达与肝癌关系密切[4]。而瘢痕灸通过对穴位所在区域造成一定的灼伤，引起机体炎症反应，进而刺激相关脏腑产生免疫调节，能在一定程度上抑制肿瘤生长[5]。因此本实验采用注射二乙基亚硝胺复制大鼠肝癌模型，通过PT-PCR技术，对Wnt/β-catenin信号传导通路中Wnt3a、Wnt10b基因进行分析，深入研究瘢痕灸肝俞穴、足三里穴对HCC的治疗作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Wistar大鼠60只，体质量(180±20)g，购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号SCXH(辽)2010-0001，使用许可证号SYXH(辽)2013-0009。大鼠6只每笼，在室温(24±1)℃、相对湿度(50±5)%条件下自由摄取食物和水源，2 d更换1次垫料。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 DEN(sigma公司，批号049k1613v)；阿霉素(索莱宝公司，批号313A028)；PCR扩增试剂盒(海灵生物公司，批号AK2601)；反转录试剂盒(海灵生物公司，批号AK5705)；艾绒(河南南阳市水木荣春生物技术有限公司)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，批号20110509)；伊红染色液、苏木素染色液(Leagene公司，批号1030A15)。

1.2.2 主要仪器 生物安全柜(上海力申科技有限公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)；紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；PCR反转仪(Applied biosystems公司)；扩增仪(Applied biosystems公司)；凝胶成像分析仪(北京市六一仪器厂)；组织破碎仪(IKA公司)；脱水机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；包埋机、摊片机、烘片机(Leica公司)。

1.3 模型制备、分组及干预方法

随机抽取12只大鼠作为对照组，其余大鼠均给予腹腔注射二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, DEN)(50 mg/kg)，1～4周，每周2次；5～14周，每周1次[6]。将造模成功的48只大鼠随机分成模型组、阿霉素组、肝俞组和足三里组各12只。阿霉素组给予阿霉素腹腔注射(2 mg/kg)，每周2次共2周；肝俞组和足三里组分别在其相应穴位进行瘢痕灸，其穴位定位参考《实验针灸学》[7]。瘢痕灸方法：将艾绒做成麦粒型艾炷(5 mg/壮)，双侧穴位同时施灸，每壮艾柱使其燃尽为止,每穴12壮。

1.4 实验取材

瘢痕灸2周后用水合氯醛对大鼠进行麻醉，取各组大鼠相同部位的肝中叶下缘肝脏组织(1 cm×1cm×0.3 cm)进行石蜡包埋切片，伊红染色液、苏木素染色液染色后镜下观察肝细胞形态学变化。

1.5 RT-PCR检测

1.5.1 肝脏组织中总RNA用Trizol法裂解提取，-80 ℃下进行保存。

1.5.2 反转录 Wnt10b正向引物：5′-GTAATCACGACATGGACTTTGGAG-3′；Wnt10b反向引物：3′-GCACTTCCGCTTCAGGGTTTT-5′。Wnt3a正向引物：5′-GGACCTATTCCATTCCCAGA-3′；Wnt3a反向引物：3′- GCACTTCCGCTTCAGGGTTTT-5′。取DEPC处理过的200 μL PCR管，分别加入总RNA 2 μL,随机引物1 μL，无RNA 酶水混合均匀，放置PCR仪器上70 ℃进行5 min，然后取出放置冰上进行冷却，依次加入试剂5×RT Buffer 4 μL、10 mM dNTP 2 μL、M-MuLV逆转录酶200 u,然后加入DEPC处理水使总体积为20 μL。条件37 ℃，时间为15 min循环6次，85 ℃ 进行5 s，4℃ 进行7 s。

1.5.3 PCR反应 取PCR管分别加入RNase Free dH2O 10 μL，Wnt10b引物上游20 pmol，Wnt10b引物下游20 pmol，Wnt3a引物上游20 pmol，Wnt3a引物下游20 pmol，2×PCR Master Mix12.5 μL于PCR仪器中进行扩增反应。反应条件如下：95 ℃ 预变性2 min；95 ℃ 变性30 s；60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环；72 ℃最终延伸1 min。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠肝脏组织形态变化

图1显示，镜下观察可见对照组肝细胞形态正常，肝窦和肝小梁有序排列；模型组大鼠肝细胞为空泡样变，细胞核多形，肝细胞形态多样化，形成肿瘤灶，有典型的假小叶形成；阿霉素组的肝细胞形成明显的增生灶，有空泡样改变，细胞排列无序，肝细胞纤维样变化，部分卵圆形细胞变成方形，细胞形态发生变化，且部分细胞出现核异质变；足三里组的大鼠肝细胞呈纤维样的变化，细胞核多形；肝俞组出现大鼠肝细胞部分空泡样变，细胞核多形，核浆部分消失，出现部分纤维化，但较足三里组程度较轻。

2.2 各组大鼠肝细胞中Wnt10b、Wnt3a表达量的变化

表1显示，与对照组比较，模型组、阿霉素组、肝俞组和足三里组Wnt3a、Wnt10b表达量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，阿霉素组、肝俞组、足三里组2指标的表达量相对降低(P<0.01)；与阿霉素组比较，肝俞组、足三里组表达量明显降低(P<0.05)；与肝俞组比较，足三里组Wnt3a、Wnt10b表达上调(P<0.05)。

表1 各组大鼠肝细胞中Wnt10b、Wnt3a表达量变化

注：与对照组比较:##P<0.01；与模型组比较:△△P<0.01；与肝俞组比较:○P<0.05

3 讨论

Wnt信号通路有非经典Wnt通路和经典Wnt通路2种。目前较受关注的是经典Wnt通路，即Wnt/β-catenin信号通路。该通路有Wnt分泌蛋白、低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low density lipopro-tein receptor related protein 5 /6,LRP5 /6)、轴蛋白(Axin)、结直肠腺瘤性息肉(adenomatous polyposis coli,APC)、卷曲蛋白(Frizzleds,Frz)、糖原合酶激酶-3β(glycogen syntase kinase-3β，GSK-3β)、 细胞核内转录因子T细胞因子(T cell factor,TCF) /淋巴样增强因子(lymphoid enhancing factor,LEF)、β-连环蛋白(β-catenin)等[8]。Wnt/β-catenin信号通路在正常细胞的传导途径中是不被激活的，表现为β-catenin定位于核内并保持稳定的状态[9]。但是Wnt分泌蛋白高表达时会与LRP5 /6 受体及Frz受体结合，Wnt通路的稳定状态被打破进而引起癌症的发生发展[10]。Wnt分泌蛋白包括Wnt1、Wnt3a、Wnt8a、Wnt10b等[11]。张锡峰等发现，Wnt3a使肝干细胞抗凋亡，导致肝干细胞发生恶性转化，引起HCC的发生[12]。而且有研究显示，Wnt3a在HCC中的表达明显上调[13]；Yuzugullu H等发现，在HCC组织中Wnt10b表达上调且高于对应的癌旁组织，认为HCC的发生可能与Wnt10b的异常活跃有很大关系[14-15]，因此调节Wnt3a、Wnt10b的异常表达可以作为治疗HCC的新策略。

本实验瘢痕灸足三里穴、肝俞穴治疗HCC，通过观察对Wnt/β-catenin通路相关基因表达量的影响和肝细胞结构与形态变化判断瘢痕灸对HCC的治疗效果及比较两穴治疗的效果差异。足三里穴是足阳明胃经的经穴、下合穴，具有扶正祛邪、防病保健的作用，为补后天之脾土、滋先天之肾水、益气血生化之源的要穴[16]。“若要安，三里常不干”，即是指瘢痕灸足三里穴具有强身健体、增强机体正气以达到抵抗邪气的功效。《素问·咳论》云：“治脏者治其俞。”《难经·六十七难》曰：“阴病行阳，阳病行阴，故令募在阴，俞在阳。”因此，肝俞穴作为背俞穴之一，可以快速、直接、有效地激发肝脏经气，达到扶助正气、破除邪气的效果。已有研究证实，直接灸肝俞穴可以抑制肝癌细胞的生长，加速其凋亡，对延缓HCC癌前病变有重要作用[17]。《素问·长刺节论》记载：“迫脏刺背俞也”，说明背俞穴对其相对应脏腑疾病有特异的治疗效果。本实验观察到，瘢痕灸肝俞穴后，Wnt3a、Wnt10b基因的表达量较足三里穴下调幅度更大，肝俞组肝细胞的组织结构和形态好于足三里组，说明瘢痕灸肝俞穴的疗效优于足三里穴，认为瘢痕灸肝俞穴较足三里穴对HCC的治疗效果更加明显。

《医学入门》中记载了“凡病药之不及，针之不到，必须灸之”的论述，瘢痕灸最早见于《针灸甲乙经》，相比较其他灸法有刺激性较强、作用更显著的特点。有研究显示，瘢痕灸可以提高荷瘤小鼠T淋巴细胞的应答能力，使其对肿瘤坏死因子有更强的杀伤作用[18]。中医学认为“正气存内，邪不可干”，说的正气就是现在人们普遍认为的免疫功能。癌症的发生和转移与免疫系统功能下降密切相关，而瘢痕灸可以增强机体的免疫功能，因此其有明显抑制肿瘤细胞的生长和增殖的效果，可以延长患者生存时间[19-20]。实验结果显示，肝俞组、足三里组和阿霉素组的大鼠肝细胞结构和形态好于模型组，且Wnt3a和Wnt10b表达量明显下调，说明3组均有治疗HCC的效果，进一步说明瘢痕灸对肿瘤有抑制作用；相比较阿霉素组，瘢痕灸肝俞组和足三里组Wnt3a和Wnt10b均表达下调，表明瘢痕灸肝俞组和足三里组的效果优于阿霉素组，其机制可能是通过调节Wnt/β-catenin信号传导通路中Wnt3a和Wnt10b的表达量引起的。

[1] 杜经丽,韦立新.原发性肝细胞癌的诊断及相关基因研究进展[J].武警医学院学报，2011，20(12):1004-1008.

[2] JI EUN LEE, SI HYUN BAE, JONG YOUNG CHOI, et al. Epirubicin, Cisplatin, 5-FU combination chemotherapy in sorafenib-refractory metastatic hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(1): 235.

[3] 陆再英,钟南山.内科学[M].7版.北京:人民卫生出版社,2008:457-462.

[4] KIM M,LEE HC,TSEDENSODNOM O,et al.Functional interaction between Wnt3 and Frizzled-7 leads to activation of the Wnt/beta-catenin signaling pathway in hepatocellular carcinoma cells[J]. J Hepatol, 2008,48(5): 780-791.

[5] 杨一玲，关玲.麦粒灸辅助治疗进展期胃癌回顾性分析[J].针灸临床杂志，2014，30(6)：1-4.

[6] 宋艺君，刘晓婷，冯丽莉，等.二乙基亚硝胺诱发肝癌前病变大鼠模型的建立[J].世界华人消化杂志，2012，20(27):2562-2569.

[7] 李忠仁，方剑乔.实验针灸学[M].北京:中国中医药出版社，2007:244.

[8] 周威，熊奇如.Wnt/β-catenin 信号通路重要分子及靶基因在原发性肝癌中的作用机制[J].肝胆外科杂志，2013，21(2)：150-155.

[9] 郑勤，徐瀚峰.Wnt/β-catenin 信号通路在肝癌中的研究进展[J].国际消化病杂志，2010，30(2)：76-78.

[10] 李伟，谢肖俊，陈盛林，等.Wnt/β-catenin信号通路在肝癌发生中的分子机制研究[J].中国现代手术学杂志，2014，18(1)：3-8.

[11] 刘佳，张明娟，朱琴梅，等.Wnt/β-catenin 信号通路在肝癌发病机制中作用的研究[J].胃肠病学和肝病学杂志，2014，23(9)：994-997.

[12] 张锡峰，胡代曦，卢永良，等.Wnt3a过表达对小鼠胚胎肝干细胞凋亡的抑制作用[J].细胞与分子免疫学杂志，2013，29(12)：1277-1280.

[13] YOSHIKAWA, MATSUBARAK,ZHOUXA, et al.Wnt10b Functional dualism：beta-catenin/tcf-dependent growth promotion or independent supperssion with deregulated expression in cancer[J]. Molbiocell, 2007, 18(11)：4292-4303.

[14] YUZUGULLU H, BEN HAI K, OZTURK N, et al. Canonical wnt signaling is antagonized by noncanonical wnt5a in hepatocellular carcinoma cells [J]. Mol cancer, 2009(8): 90.

[15] 浮凤州，范晓丽，孙莉，等.Wnt10b在肝细胞肝癌中的表达[J].重庆医学，2014， 43(28): 3753-3756.

[16] 石学敏.针灸学[M].2版.北京：中国中医药出版社，2007:45.

[17] 柳杨，侯中伟，卢俊，等.麦粒灸“肝俞”对原发性肝癌癌前病变模型大鼠肝功能的影响[J].中国针灸，2015，35(7):702-706.

[18] 吴皓,水野海腾,吕诚,等.瘢痕灸对荷瘤及化疗小鼠肠道淋巴结及固有层淋巴细胞亚群的影响[J].中国中医药信息杂志，2009，16(7):31-37.

[19] 付玲，万茜，徐天舒.麦粒灸对肿瘤患者生活质量及其外周血IL-10表达的影响[J].上海针灸杂志，2015，34(4):305-309.

[20] 洪金标，彭宏，易受乡.艾灸对机体产生的多重效应及其机理探讨[J].中华中医药学刊，2010，28(2):277-281.

EffectsofScarringMoxibustionGanshu-pointandZusanli-pointonExpressionofWnt10BandWnt3AofHepaticCarcinomaRats

WANG Ying1, ZHAO Wan-shuang1, ZHANG Xiao-lu1, LI Di1, HU Xiao-long1, LI Meng-di1, CHEN Jin1, WANG Qi-ge2

(1.DepartmentofAcupunctureandMoxibustioncolleage,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847,China; 2.FirstClinicalCollegeofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847,China)

Objective: To explore the scarring moxibustion Ganshu-point(BL18), Zusanli-point(ST36) on expression of Wnt3a, Wnt10b of Wnt / β-catenin signaling pathway of hepatic carcinoma rats. Methods: Healthy male Wistar rats were randomly divided into Control group, Model group, Adriamycin group, Ganshu-point(BL18) group, Zusanli-point(ST36) group. Liver cancer models were prepared by injection of diethylnitrosamine. The expression of Wnt3a and Wnt10b was detected by RT-PCR and the structure and morphological changes of hepatocytes were observed. Results: Compared with the control group, the expression of Wnt10b and Wnt3a in Model group, Zusanli-point(ST36) group, Ganshu-point(BL18) group and Adriamycin group increased significantly; Compared with the Model group, Adriamycin group, Ganshu-point(BL18) group and Zusanli-point(ST36) group expression reduced; Compared with Adriamycin group, the expression of Zusanli-point(ST36) group and Ganshu-point(BL18) group decreased obviously; Compared with the Zusanli-point(ST36) group, Ganshu-point(BL18) group expression was significantly increased. Visible were observed: Control group of normal liver tissue; The cells in the model group had false lobular formation; Adriamycin group was significantly hyperplastic lesions; In the Ganshu-point(BL18) group, the nucleus became more pleomorphic and the nuclear plasma fraction disappeared；Fibrous changes in the Zusanli-point(ST36) group. Conclusions: Scarring moxibustion Ganshu-point(BL18), Zusanli-point(ST36) for hepatic carcinomain rats have therapeutic effects. The mechanism may be by regulating the Wnt / β-catenin signaling pathway Wnt3a, Wnt10b expression to achieve.

Scarred Moxibustion; Ganshu-point; Zusanli-point; Hepatic carcinoma; Wnt3a; Wnt10b

辽宁省科学技术基金资助项目(2014020047)-瘢痕灸治疗原发性肝癌

王 颖(1964-)，男，辽宁阜新人，副教授，医学硕士，从事针灸机理研究。

R245.81

B

1006-3250(2017)11-1611-04

2017-04-23