盐酸吉西他滨对非小细胞肺癌患者骨髓CD34+造血细胞的毒性研究

时 洁 耿晓康

盐酸吉西他滨对非小细胞肺癌患者骨髓CD34+造血细胞的毒性研究

时 洁 耿晓康

目的探讨非小细胞肺癌患者骨髓CD34+前体造血细胞在细胞毒药物盐酸吉西他滨诱导下，发生细胞凋亡情况及DNA损伤修复信号通路上相关基因表达的变化。方法采用免疫磁珠法分选出80例非小细胞肺癌患者骨髓单个核细胞中的CD34+细胞，并应用流式细胞术检测其纯度。用盐酸吉西他滨(终末浓度为10 μg/ml)诱导CD34+细胞凋亡，检测诱导不同时间点的细胞凋亡率的差异。提取细胞RNA，利用基因芯片技术，将药物诱导前后的CD34+细胞在DNA损伤修复信号通路的相关基因表达情况进行检测，并分析比较。结果80份骨髓样本CD34阳性率为(6.06±1.61)%；TNM分期不同的患者样本间CD34的表达无统计学差异，P>0.05。免疫磁珠法分选后，流式细胞术检测CD34+细胞的纯度为(88.63±7.29)%； CD34+细胞在经过盐酸吉西他滨诱导0 h、4 h、8 h、12 h后，凋亡率分别为(5±1.37)%、(18±4.76)%、(39±8.15)%、(56±9.64)%，各时间点细胞的凋亡率之间有统计学差异，P<0.05。基因芯片结果显示，骨髓CD34+细胞在盐酸吉西他滨诱导凋亡0 h与诱导12 h后相比，表达差异2倍以上的基因有13种，其中9种基因表达是升高的，4种基因表达降低。结论盐酸吉西他滨可以诱导非小细胞肺癌患者骨髓前体CD34+细胞发生凋亡，随着药物作用时间延长，细胞凋亡率上升；DNA损伤修复系统中，部分基因表达水平出现变化。

非小细胞肺癌；CD34；细胞凋亡；DNA 损伤

盐酸吉西他滨广泛用于局限晚期及晚期非小细胞肺癌的化疗，是一种抗代谢类药物，其作用机制有细胞周期特异性,主要作用于S期的细胞,在一定条件下也可以发挥阻止G1期向S期进展的作用。该药物有明显的抗肿瘤效果，但同时也经常出现骨髓抑制的不良反应，白细胞、红细胞及血小板减少。而化疗后骨髓抑制这种不良反应的产生，主要与造血前体细胞对化疗药物的高度敏感性有关。本研究以非小细胞肺癌患者CD34+骨髓造血前体细胞为研究对象，体外试验中，分析其在盐酸吉西他滨作用下细胞凋亡情况以及DNA损伤修复相关基因表达水平的变化。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2015 年1月至2015年12 月经胸外科手术治疗的的非小细胞肺癌患者80例，其中鳞癌40例,腺癌40例；男性58例,女性22例；年龄32～65岁,中位年龄49岁；Ⅰ期9例,Ⅱ期37例,Ⅲ期34例；术前均未行化疗。因手术方式需要，患者术中均切除了部分肋骨，征得患者同意，切除的肋骨用于采集骨髓细胞。

1.2 骨髓CD34+细胞分离

将手术中切除的肋骨标本，在无菌条件下，用生理盐水冲洗及抽吸出骨髓细胞，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液。用含有10%FBS的分离缓冲液稀释,用200目的滤网过滤，将过滤后的细胞悬液收集，清洗后重悬于适量体积生理盐水中，缓慢加在Ficoll-Paque淋巴细胞分离液(相对密度1.077)液面上，用2 500 r/min转速离心20 min，吸取中间的单个核细胞层，PBS洗2遍。接下来用免疫磁珠法(美天旎公司)分选出CD34+细胞。然后用含0.5%FBS、2 mmol/L EDTA的PBS重悬单个核细胞，使得终体积为300 μL。按照试剂盒的操作说明，分别加入100 μL FcR Blocking Reagent，100 μL CD34+microbeads混合均匀，然后置于4～8 ℃中，反应30 min，终止后将细胞离心洗涤，洗涤后的细胞重新悬浮于500 μL的缓冲液中，将细胞悬液加入到预处理过的MACS-LS柱中(置于磁力架上)，使液体自然流出，然后再用缓冲液清洗3遍，之后将LS柱从磁场中移出，用5 mL缓冲液加压冲洗LS柱，收集冲洗液，得到CD34+细胞。将CD34+细胞使用CD34-FITC抗体(德国美天旎)标记，用流式细胞仪(Becton Dickson)分别检测每一例标本分离前后CD34+细胞的纯度。

1.3 盐酸吉西他滨诱导细胞凋亡及凋亡检测分析

CD34+细胞培养于含10%FBS的RPMI-1640培养液(青霉素100 IU/ml,链霉素100 μg/ml,L-谷胺酰胺2 mmol/L)(GIBCO),37 ℃,5% CO2。调整细胞密度大约为106/ml。盐酸吉西他滨(江苏豪森)用RPMI-1640培养基配成，加入CD34+细胞中，使药物最终浓度为10 μg/ml,加药培养1 h后，洗涤细胞，除去药物，将清洗后的细胞重新悬浮于RPMI-1640培养液中，置于培养箱中，37 ℃,5% CO2培养。然后于不同的时间点(0 h、4 h、8 h、12 h)收获细胞，用annexinV-FITC法(晶美生物公司)检测CD34+细胞凋亡率。

1.4 细胞基因芯片杂交和化学发光检测

将以上药物处理0 h及处理12 h的骨髓CD34+细胞样本各取105个细胞混合成为2组，混匀后从2组细胞中各取106个，2组均加入Trizol试剂(Invitrogen life technologies)提总RNA，然后使用NanoDrop®ND-1000和变性琼脂糖凝胶电泳法测定RNA浓度和纯度。继而反转录并合成cDNA，下一步分别用TrueLabeling-AMPTM线性RNA扩增试剂盒、SuperArray ArrayGrade cRNA纯化试剂盒Biotin-16-UTP(Roche)进行cRNA标记以及合成。将TrueLabeling-AMP制备所得的生物素标记的cRNA样品，置于0.75 mL预热的GEAhyb杂交液之中，用Oligo GEArray®芯片进行杂交，继而使用化学发光检测试剂盒Chemiluminescent Detection Kit(SuperArray Bioscience)继续进行化学发光检测。

1.5 图像采集和数据分析

用X胶片和扫描仪获得化学发光的芯片图。采用综合型GEArray表达分析配套软件(GEArray Expression Analysis Suite)进行全面的芯片数据分析。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 CD34+在80例骨髓标本单个核细胞中的表达，以及分选后CD34+细胞的百分率

流式细胞术分析80份骨髓样本单个核细胞，CD34分子阳性表达率为(6.06±1.61)%。进一步分析TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者样本，其CD34阳性表达率分别为(6.02±1.67)%、(6.35±1.46)%、(5.81±1.79)%，差异无统计学意义。用免疫磁珠法分选后CD34+细胞，经流式细胞术检测，获得的总体样本CD34+细胞的纯度为(88.63±7.29) %。

2.2 盐酸吉西他滨诱导骨髓CD34+细胞凋亡

因部分样本所获取的CD34+细胞数量较少，不能满足细胞凋亡检测所需细胞量，因此本步骤中选取了CD34+细胞数量较多的20例样本(其中鳞癌及腺癌各10例)进行研究。流式细胞术检测20例样本中，CD34+细胞经过盐酸吉西他滨诱导0 h、4 h、8 h、12 h后的凋亡率分别为(5±1.37)%、(18±4.76)%、(39±8.15)%、(56±9.64)%。经单向方差分析分析，各时间点凋亡率之间有统计学差异，P<0.05。

2.3 骨髓CD34+细胞在盐酸吉西他滨诱导0 h和诱导12 h后DNA损伤及修复相关基因表达变化

骨髓CD34+细胞经诱导0 h及诱导12 h后的2组细胞，RNA量分别为2 160 ng和2 108 ng。A260/A280分别为1.82和1.87，A260/A230分别为1.97和2.06。DNA损伤信号通路基因芯片中，有DNA损伤信号通路的113个基因，包括ATR/ATM通路以及DNA损伤相关的转录调控基因。本研究所检测样本显示，骨髓中分离的CD34+细胞在盐酸吉西他滨诱导凋亡前与诱导12 h后相比，表达差异在2倍以上的基因有13种，其中9种基因表达是升高的，4种基因表达降低。见表1。

表1 骨髓CD34+细胞在盐酸吉西他滨诱导0 h和诱导12 h后表达变化在2倍以上的DNA损伤及修复相关基因

3 讨论

肺癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，是近年来我们国家的城市人口恶性肿瘤死亡的首要原因[1]。许多肺癌患者就诊时已处于疾病晚期，临床上治疗晚期非小细胞肺癌主要通过化学治疗。盐酸吉西他滨是晚期肺癌患者常用的化疗药物之一[2-4]。化疗后骨髓抑制是该药物常见的不良反应[5-7]，化疗后骨髓抑制现象的发生，常与造血系统中的前体细胞对化疗药物的敏感性有关。来自动物实验的结果证实，细胞毒性药物诱导下，造血前体细胞可以发生DNA的损伤，然后可以继发造血细胞的一系列复杂的修复事件，如DNA损伤的修复未能成功，细胞就会出现凋亡[8-10]。

本研究选取非小细胞肺癌患者的骨髓造血细胞为研究对象，用抗代谢药物盐酸吉西他滨进行干预，我们观察到，CD34+的造血祖细胞在药物作用下，可以发生细胞凋亡，在本研究观察的几个不同的时间点中，发现凋亡率存在显著性差异。

我们利用基因芯片技术，分别检测CD34+骨髓细胞在盐酸吉西他滨作用前后，DNA损伤通路的113个基因的变化。其结果表明，诱导凋亡前与诱导12 h后相比，表达差异在2倍以上的基因有13种，其中9种基因表达是升高的，4种基因表达降低。这些基因表达的变化提示细胞发生了一系列事件，促使细胞修复损伤，而严重的损伤无法修复，使部分细胞发生了凋亡。虽然我们无法辨别这些基因表达变化中，哪些是凋亡的启动因素，哪些是继发于细胞凋亡事件。有相关研究表明，其他细胞毒药物也可诱导骨髓CD34+细胞发生凋亡，且凋亡率高于CD34-的细胞，也同样可以引起CD34+骨髓细胞相关基因表达的变化，但和本研究所观察到的具体基因存在一定差异，这与不同药物的作用机理差异有关[11-12]。

综上所述，盐酸吉西他滨可以引起部分骨髓造血前体细胞发生DNA损伤修复，而未能完全修复的部分细胞会发生凋亡，这可以部分解释化疗引起的骨髓抑制，但详细机制需进一步深入研究。

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CytotoxicResponseofHumanMarrowHematopoieticCD34+ProgenitorCellsInducedbyGemcitabineHydrochlorideinPatientswithNon-smallCellLungCancer

SHIJie,GENGXiaokang.

EnshiCentralHospital,Enshi,445000

ObjectiveTo investigate human bone marrow hematopoietic CD34+ progenitor cells induced by gemcitabine hydrochloride in patients with non-small cell lung cancer,the apoptotic response and gene expression change of DNA damage signaling pathway.MethodsCD34+ hematopoietic cells were isolated and purified by MiniMACS immunomagnetic beads from mononuclear cells of bone marrow samples in 80 patients with non-small cell lung cancer.The purity of CD34 fractions was detected by flow cytometry.The CD34+ cells were treated by gemcitabine,after 0 h，4 h，8 h，12 h,the apoptosis rates were detected by flow cytometry,total RNA were extracted from the cells,and gene expression of DNA repair signaling pathway were analyzed by Oligo DNA damage signaling pathway microarray.ResultsThe percentage of CD34+ cells from 80 samples were(6.06±1.61)%；There was no significant difference in CD34 expression between patients with different TNM stages,P>0.05.After immunomagnetic isolation,purity of CD34+cells were (88.63±7.29) %.when treated by gemcitabine for 0 hour,4hours,8hours and 12 hours,the apoptosis rates of CD34+ cells were(5±1.37)%,(18±4.76)%,(39±8.15)%，(56±9.64)%,there were significant differences between them,P<0.05.In the detection of genes related to DNA repair signaling pathway,over two-fold differences of 13 genes between bone marrow CD34+cells treated for 0 hour and 12 hours,including 9 kinds of genes expression were higher in the latter than the former,4 kinds of genes expression were lower in the latter than the former.Conclusion

Human bone marrow hematopoietic CD34+ progenitor cells,in patients with non-small cell lung cancer,can be induced to apoptosis when treated by gemcitabine hydrochloride,the apoptosis rate can rise with time extended,accompanied by changes of gene expression levels of damage signaling pathway.

Non-small cell lung cancer;CD34;Apoptosis;DNA damage

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1797～1800)

445000 湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.11.017

R734.2

A

1001-5930(2017)11-1797-04

2016-11-09

2017-04-20)

(编辑：甘艳)