CD44、CD133耦连miR-425装载纳米脂质体对结直肠癌干细胞PDL-1表达的下调作用

贾良勇 许 娜 王兴宁 李 慧

·基础研究·

CD44、CD133耦连miR-425装载纳米脂质体对结直肠癌干细胞PDL-1表达的下调作用

贾良勇 许 娜 王兴宁 李 慧

目的探究CD44、CD133耦连miR-425装载纳米脂质体对结直肠癌干细胞PDL-1表达的下调作用。方法

选择结直肠癌细胞系HCT116分选出CD44、CD133/1+细胞，进行miR-425装载纳米脂质体转染，分为对照组(转染control载体)、实验组(转染miR-425慢病毒载体)，空白组以纳米脂质体代替，测定干细胞生长状态，检测PDL-1表达水平。结果分选的CD 133/1+细胞呈圆形，12 h后开始贴壁生长，状态良好。qRT-PCR检测显示实验组的miR-425的相对表达水平为(182.44±22.19)，对照组与空白组分别为(1.84±1.11)和(1.67±0.98)，实验组明显高于对照组与空白组(P<0.05)。MTT检测结果表明，与空白组(0.78±0.22)、对照组(0.81±0.17)比较，实验组(0.24±0.15)的HCT116细胞生长速度明显减慢(P<0.05)。空白组与对照组的细胞增殖率分别为(0.48±0.14)与(0.51±0.18)，都明显高于实验组的(0.30±0.11)。Western blot检测分析显示实验组、对照组、空白组的PDL-1相对表达量分别为(0.33±0.13)、(0.76±0.21)和(0.82±0.15)，实验组明显低于对照组与空白组(P<0.05)。结论CD44、CD133耦连miR-425装载纳米脂质体能抑制结直肠癌干细胞PDL-1的表达，从而显著抑制干细胞的生长、增殖能力。

miR-425；纳米脂质体；结直肠癌；干细胞；PDL-1

结直肠癌是世界上常见的消化道恶性肿瘤之一，当前在我国的发病人数越来越多[1]。现代研究表明结直肠癌的发生是一个由正常组织经过良性病变逐步演变为恶性肿瘤的过程，也是一个多步骤、多因素参与的过程，伴随着基因水平和表观遗传水平改变的累积[2-3]。干细胞是一类能够自我更新并具有多向分化潜能的早期未分化细胞，CD133分子是结肠癌干细胞的重要标记分子，CD44也可能是结肠癌干细胞的标记，并且部分CD133+细胞不表达CD44，因此CD44可作为CD133+细胞进一步纯化的分子标记[4-5]。miRNA 是一类长度为21～25个核苷酸组成的非编码单链小分子RNA，可抑制靶mRNA 翻译，对基因进行转录后翻译和表达的调控，进而参与调节生物体的各种生物学行为[6-7]。多数结直肠癌经历了正常肠组织、良性息肉、腺瘤、恶性肿瘤的演变过程，这一过程也伴随多种miRNA表达的异常变化[8-9]。细胞程式死亡-配体1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)也是人类体内的一种蛋白质，由CD274基因编码，可以传导抑制性的信号，减少淋巴结CD8+ T细胞的增生[10]。本文探究了CD44、CD133耦连miR-425装载纳米脂质体对结直肠癌干细胞PDL-1表达的下调作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究标本

研究时间为2016年1月至2016年12月，人结直肠癌细胞系HCT116购自中国科学院上海细胞库，培养细胞所需的DMEM培养基、胎牛血清(FBS)等购自GIBCO公司，PE标记CD44、CD133鼠抗人单克隆抗体(PE-AC133，Miltenyi Biotec)，RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司，引物由上海生工合成，cDNA合成试剂盒和Real-time PCR试剂均购自Sigma公司，miR-425慢病毒载体及其对照载体、纳米脂质体转染试剂均购自上海吉玛制药技术有限公司。所有溶液均由灭菌去离子水配制，细胞株经检测，无支原体污染。

1.2 细胞培养与处理

HCT116细胞置于37 ℃、5%CO2饱和湿度条件的细胞培养箱内进行培养，培养基为高糖型DMEM，含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素。以0.02%EDTA-2Na和0.25%胰蛋白酶1∶1混合液消化传代，每3天传动带1次，每天更换培养液1次。以同型对照PE荧光强度为本底荧光，将此区域设定为CD44、CD133/1+细胞的门，计算百分比，从而分选出CD44、CD133/1+细胞与CD44、CD133/1-细胞。

1.3 miR-425转染

将miR-425和control离心用RNase-free H2O溶解到20 μM浓度。将6×104的CD44、CD133/1+接种到12孔板中，培养24 h后，细胞生长密度达到60%时进行转染。分为对照组(转染control载体)、实验组(转染miR-425慢病毒载体)，空白组以纳米脂质体代替。

1.4 细胞活力测定

转染后的HCT116细胞生长至70%～80%时消化细胞，接种至96孔细胞培养板中，按20 μL/孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液，放回培养箱继续孵育4 h，终止培养，吸去上清液，每孔加150 μL DMSO，振荡10 min后490 nm测定吸光度值，测定细胞活力，实验重复3次。

1.5 细胞增殖能力测定

将转染后的HCT116细胞以700个/孔接种于直径3.5 cm的细胞培养皿中，每2～4 d换液1次。培养10 d后终止培养。PBS清洗1次后加入4%的多聚甲醛固定15 min，然后弃去固定液，加适量0.1%的结晶紫染色10 min，肉眼进行计数。

1.6 PDL-1表达检测

转染后的HCT116细胞生长密度在90%左右时，收获细胞，裂解液分离总蛋白，采用Western blot法检测PDL-1蛋白表达水平。

1.7 统计方法

2 结果

2.1 CD133/1+细胞检测

流式细胞仪可检测HCT116细胞CD133/1+细胞的存在，比例占0.3%。分选的CD 133/1+细胞呈圆形，12 h后开始贴壁生长，状态良好。

2.2 miR-425表达水平对比

转染后进行qRT-PCR检测，实验组的miR-425 的相对表达水平为(182.44±22.19)，对照组与空白组分别为(1.84±1.11)和(1.67±0.98)，实验组明显高于对照组与空白组(F=78.104，P<0.05)。

2.3 生长能力对比

MTT检测结果表明，与空白组(0.78±0.22)及对照组(0.81±0.17)比较，实验组(0.24±0.15)的HCT116细胞生长能力明显减弱(P<0.05)。

2.4 增殖能力对比

结晶紫染色结果显示，空白组与对照组的细胞增殖率分别为(0.48±0.14)与(0.51±0.18)，都明显高于实验组的(0.30±0.11)。见图1。

图1 CD133/1+细胞增殖能力的结晶紫染色检测(×200)

2.5 PDL-1表达水平检测

Western blot检测分析显示实验组、对照组、空白组的PDL-1相对表达量分别为(0.33±0.13)、(0.76±0.21)和(0.82±0.15)，实验组明显低于对照组与空白组(P<0.05)。

3 讨论

当前由于各种因素的影响，我国结直肠癌患者越来越多，对其的研究也逐渐深入。干细胞是器官发生过程中早期分子活动的研究工具，已成为近年来医学和生物学领域研究的热点[11]。CD44、CD133分子是结直肠癌干细胞的重要标记分子，CD44、CD133分子的表达是判断结直肠癌患者生存期的独立因素[12]。有研究表明，分离纯化的CD133+细胞移植小鼠后，能在小鼠体内有效形成新的肿瘤，而CD133-细胞则不能在小鼠体内形成新的肿瘤[13]。CD44、CD133分子的表达有复杂的调控机制，也存在具有转录后调控机制[14]。

miRNA 作为一个广泛存在的可对基因表达进行调控的分子，长度大约为22 bp，在维持干细胞特性方面发挥了重要作用[15]。miRNAs是保持造血干细胞内干细胞数目和特征不变的关键分子之一，miR-200c在乳腺干细胞的表达下调，恢复miR-200c 的表达，可明显抑制乳腺干细胞的增殖能力。miR-21 在 CD133/1+细胞中的表达明显下调，其可能通过调节某些致癌基因而发挥肿瘤生成的作用[16]。

在本研究中，为了解 miR-21对 CD133/1+卵巢癌干细胞增殖生物学功能的影响，我们利用脂质体 2000 介导的转染方法，将化学合成的 miR-21 寡核苷酸转染 CD133/1+卵巢癌干细胞，同时设立空白组及转染无关序列的阴性对照组，分别检测 miR-21 寡核苷酸诱导的增殖情况。本研究实验选取HCT116细胞作为研究对象，通过CD44、CD133耦连选择干细胞，通过慢病毒纳米脂质体转染表达miR-425，qRT-PCR验证了HCT116细胞在稳定转染miR-425后，miR-425表达升高。同时HCT116细胞的生长速度下降、增殖能力下降，表明miR-425能抑制HCT116细胞的生长与增殖。

实验证实miRNA对靶基因表达调控的异常，导致和(或)促进了肿瘤的发生、发展，CD44、CD133表达不仅仅局限于结肠或结肠癌干细胞表面，并且在转移性结肠癌组织中，CD44、CD133细胞都具有肿瘤干细胞特性[17-19]。PD1(programmed death-1)最初是在凋亡的T细胞杂交瘤中得到的，PD-1有2个配体，分别是PDL-1(B7-H1)和PDL-2(B7-DC)。PDL-1蛋白广泛表达于抗原提呈细胞(APCs)、活化T、B细胞、胎盘滋养层、心肌内皮、巨噬细胞，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用[20]。在肿瘤细胞中，PDL-1蛋白呈现高表达状况，有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡[21]。本研究中Western blot检测分析显示实验组、对照组、空白组的PDL-1相对表达量分别为(0.33±0.13)、(0.76±0.21)和(0.82±0.15)，实验组明显低于对照组与空白组(P<0.05)，表明miR-425能抑制结直肠癌干细胞PDL-1的表达。

总之，CD44、CD133耦连miR-425装载纳米脂质体能抑制结直肠癌干细胞PDL-1的表达，从而显著抑制干细胞的生长、增殖能力。

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CD44,CD133CoupledwithmiR-425LoadedNanoLiposomeonPDL-1DownRegulatedRoleintheColorectalCancerStemCells

JIALiangyong,XUNa,WANGXingning,etal.

AffiliatedHospitalofYan'anUniversity,Yan’an,716000

ObjectiveTo investigate the PDL-1 down regulated role of CD44,CD133 coupled with miR-425 loaded nano liposome in the colorectal cancer stem cells.MethodsThe colorectal cancer cell line HCT116 were selected for CD44,CD133/1+ cells,and were given the miR-425 loaded nano liposome transfection,the cells were divided into the control group (transfected with control vector) and the experimental group (transfected with miR-425lentivirus vector),the blank group was the nano liposome,and detected the cell growth and the expression level of PDL-1.ResultsThe CD 133/1+ cells were round and grew well after 12 h.qRT-PCR test showed that the relative expression level of miR-425 in the experimental group was (182.44±22.19),while the control group and the blank group were (1.84±1.11) and (1.67±0.98) respectively,the experimental group were higher than that of the control group and the blank group (P<0.05).The results of MTT showed that compared with the blank group (0.78±0.22) and the control group (0.81±0.17),the growth rate of HCT116 cells (0.24±0.15) were significantly slower in the experimental group (P<0.05).Compared with the experimental group,the cell proliferation rate of the blank group(0.48±0.14)and the control group(0.51±0.18)were significantly higher than that of the experimental group(0.30±0.11).Western blot analysis showed that the relative expression of PDL-1 in the experimental group,the control group and the blank group was 0.33±0.13,0.76±0.21 and 0.82±0.15 respectively,the experimental group were significantly lower than the control group and the blank group (P<0.05).ConclusionCD44 and CD133 coupled with miR-425 can inhibit the expression of PDL-1 in colorectal cancer stem cells,which can significantly inhibit the growth and proliferation of stem cells.

MiR-425;Nano liposome;Colorectal cancer;Stem cell;PDL-1

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1741～1744)

716000 延安大学附属医院

李 慧

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.11.001

R735.3+5；R735.3+7

A

1001-5930(2017)11-1741-04

2017-05-09

2017-07-10)

(编辑：甘艳)