耐药结核分枝杆菌的适应性代价与补偿性进化

皮锐，柳清云，高谦

复旦大学基础医学院医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室，上海 200032

·综述·

耐药结核分枝杆菌的适应性代价与补偿性进化

皮锐，柳清云，高谦

复旦大学基础医学院医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室，上海 200032

结核病耐药率的攀升是目前全球结核病防控面临的重大挑战。结核分枝杆菌主要通过其基因组中耐药相关基因发生点突变而获得耐药性。由于耐药相关基因通常具有重要的生理功能，其突变往往会导致结核分枝杆菌自身适应性下降，即产生“适应性代价”。然而，耐药结核分枝杆菌可通过进一步积累其他特定突变来回复其适应性，这种能使其适应性上升的突变称为“补偿性突变”。耐药结核分枝杆菌的补偿性进化被认为是耐药结核病广泛传播与流行的生物学基础。近年来，在结核病分子流行病学和基础研究领域，针对耐药结核分枝杆菌的补偿性进化开展了大量研究。本文从结核分枝杆菌的耐药分子机制、耐药突变的适应性代价与补偿性进化，以及补偿性进化如何影响耐药结核病传播等方面，综述耐药结核分枝杆菌补偿性进化的研究进展。

结核分枝杆菌；耐药突变；适应性代价；补偿性进化；异位显性

目前，结核病仍是全球致死率最高的传染性疾病之一，其主要由结核分枝杆菌感染呼吸系统引起。近几十年来，随着耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB；同时对异烟肼和利福平耐药)、广泛耐药结核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB；在MDR-TB基础上还对喹诺酮类药物和至少一种二线注射类药物耐药)和全耐药结核病(totally drug-resistant tuberculosis，TDR-TB；对可用抗结核药物均耐药)的出现与耐药率的不断攀升，耐药结核病已成为全球结核病防控工作面临的严峻挑战[1]。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)的结核病年度报告，2015年全球约有1 040万新发病例，其中48万为MDR-TB，因结核病死亡的人数达140万[2]。作为结核病第三高负担国家，中国2015年共有91.8万新发病例，其中7万为MDR-TB[2]。需强调的是，在全球范围内，结核病的初治耐多药率为3.9%，复治耐多药率为 21%；而在我国则分别为 6.6% 和30%，均高于世界平均水平[2]。

早期的数学模型预测分析认为，耐药结核分枝杆菌由于适应性下降，与敏感菌竞争存在劣势且更易被宿主清除，因而难以形成持续的感染传播链或扩张暴发[3-4]。然而，分子流行病学研究表明，耐药结核分枝杆菌造成的传播事件甚至比敏感菌株更多[1,5]。一个重要原因是耐药结核病患者治疗周期长或久治不愈，从而导致传播时间更长、传播范围更广。近期研究发现，耐药结核分枝杆菌自身的适应性进化可能在其传播中发挥重要作用，即耐药菌通过补偿性进化来回补耐药突变导致的适应性代价，从而使适应性上升并促进耐药菌在群体中的固定及传播[6-11]。本文就结核分枝杆菌的耐药分子机制、耐药突变的适应性代价与补偿性进化，以及补偿性进化对传播的影响等方面，对近年来关于耐药结核分枝杆菌补偿性进化的研究进行系统综述。

1 结核分枝杆菌的耐药分子机制

结核分枝杆菌基因组中鲜见通过质粒或可移动遗传元件从外界获得遗传物质的水平基因转移事件，因此耐药相关基因突变是其主要耐药分子机制[12-13]。结核分枝杆菌的耐药突变主要发生在药物结合靶标或药物活化酶等的编码基因上，这些基因突变导致药物分子与靶标的结合能力减弱或前体药物无法被活化，从而使结核分枝杆菌产生耐药[14]。例如，rpoB基因81 bp的利福平耐药决定区(rifampicin resistance determining region，RRDR)突变后，利福平与RNA聚合酶的结合能力减弱，从而导致对利福平耐药[15-16]；对异烟肼耐药主要是因为katG基因突变导致过氧化氢-过氧化物酶(KatG)活性降低或丧失，使异烟肼无法被活化[17]。此外，药物靶基因启动子突变也可导致结核分枝杆菌耐药。例如，inhA基因启动子突变引起药物靶标InhA蛋白过表达，从而导致对异烟肼或乙硫异烟胺耐药[18]。而结核分枝杆菌对多种药物的耐药性，需逐步积累对单种药物的耐药突变来获得。表1列出了结核分枝杆菌对常见药物的耐药机制。

2 耐药结核分枝杆菌的适应性代价

由于耐药突变主要发生于结核分枝杆菌的必需基因，如rpoB基因(编码RNA聚合酶)、gyrA基因(编码DNA促旋酶)等，这些基因突变会使相应蛋白的酶活降低或丧失，从而导致结核分枝杆菌对原生境的适应性下降，即产生“适应性代价”(fitness cost)[19-20]。适应性下降的具体表现：在没有抗生素选择压力的环境中，耐药株相比于野生株生长能力减弱[21]。因此，耐药突变的积累是把双刃剑，在使细菌获得耐药性的同时也可能导致其适应性降低。适应性代价在细菌中普遍存在，多项研究发现结核分枝杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌及鼠伤寒沙门菌等病原菌在积累耐药突变后均会产生适应性降低[22-29]。

近年来，不少研究通过生长速率、体外竞争实验、动物感染模型等评估耐药结核分枝杆菌的适应性代价。结果发现，大部分携带katG突变的耐异烟肼结核分枝杆菌在小鼠/豚鼠感染模型中致病能力减弱，原因是katG突变使其编码的KatG活性丧失或降低，从而导致结核分枝杆菌在胞内受到的氧化损伤增加[30-32]。此外，不同katG突变类型所导致的适应性代价存在差异。例如，尽管绝大多数katG突变导致KatG酶活降低，但临床最常见的katGS315T突变能在获得高水平耐药的同时保留较高的KatG活性(酶活仅下降12%～17%)。因此，携带该突变的耐药菌株在小鼠体内的增殖速率与野生株相近，并显著高于其他katG突变类型[33-34]。类似现象在耐利福平结核分枝杆菌中也存在：对利福平的耐药突变使结核分枝杆菌的适应性下降4%～71%，其中临床最常见的rpoBS450L突变导致的适应性下降仅为16%[35-36]。此外，相较于L4亚型，rpoBH526D突变在L2亚型耐利福平结核分枝杆菌中导致的适应性代价较低，表明遗传背景可影响耐药结核分枝杆菌的适应性[37]。不同耐药结核分枝杆菌之间的适应性代价的异质性受多方面因素影响，包括菌株的遗传背景、特定的耐药突变、多个耐药突变之间的异位显性(epistasis)效应及耐药结核分枝杆菌的补偿性进化等[12]。值得强调的是，临床最常见的耐药突变类型其适应性代价通常较低，表明耐药突变在产生与固定过程中经历了竞争和筛选，适应性高的耐药突变更易固定下来。

表1常用的抗结核药物、结核分枝杆菌耐药相关基因及其主要耐药机制

Tab.1ListofthemostcommondrugresistancemechanismsinM.tuberculosis

药物耐药基因 基因功能 耐药机制利福平rpoBRNA聚合酶β亚基药物分子与靶标的结合能力减弱异烟肼katG过氧化氢/过氧化物酶前体药物无法激活inhA烯酰⁃ACP还原酶药物分子与靶标的结合能力减弱inhA启动子药物靶标过表达乙胺丁醇embB阿拉伯糖基转移酶药物分子与靶标的结合能力减弱吡嗪酰胺pncA吡嗪酰胺酶前体药物无法激活乙硫异烟胺inhA烯酰⁃ACP还原酶药物分子与靶标的结合能力减弱inhA启动子药物靶标过表达ethA单加氧酶前体药物无法激活喹诺酮类gyrA/BDNA促旋酶药物分子与靶标的结合能力减弱链霉素rrs16SrRNA药物分子与靶标的结合能力减弱rpsL12S核糖体蛋白药物分子与靶标的结合能力减弱阿米卡星rrs16SrRNA药物分子与靶标的结合能力减弱卡那霉素rrs16SrRNA药物分子与靶标的结合能力减弱eis启动子氨基糖苷类乙酰基转移酶药物失活酶过表达卷曲霉素rrs16SrRNA药物分子与靶标的结合能力减弱tylArRNA甲基转移酶药物靶标无法被甲基化对氨基水杨酸thyA胸苷酸合成酶通路旁路阻断降低药效folC二氢叶酸合成酶前体药物无法激活ribD二氢叶酸还原酶前体药物无法激活环丝氨酸aldL⁃丙氨酸脱氢酶药物靶标底物过表达alr丙氨酸消旋酶药物分子与靶标的结合能力减弱alr启动子药物靶标过表达贝达喹啉atpEATP合成酶药物分子与靶标的结合能力减弱rv0678/mmpL5转录抑制因子外排泵MmpL5过表达利奈唑胺rplC50S核糖体蛋白L3药物分子与靶标的结合能力减弱rrl23SrRNA药物分子与靶标的结合能力减弱

3 耐药结核分枝杆菌的补偿性进化

在积累耐药突变之后，耐药结核分枝杆菌可通过进一步积累其他特定的突变来回补耐药突变导致的适应性代价，这一过程称为“补偿性进化”。目前已知的耐药结核分枝杆菌补偿性进化主要包括以下3种形式：耐药相关基因的二次突变、耐药突变之间的异位显性效应及同工酶的过表达。

3.1 耐药相关基因的二次突变

耐药相关基因的二次突变是指结核分枝杆菌在积累某个基因的耐药突变后，在该基因或其他功能相关基因上积累另外的突变，通过调整蛋白或蛋白复合物的空间结构来回补耐药突变导致的功能损伤。

Gagneux等最早于2006年发现，实验室筛选的耐利福平结核分枝杆菌通常具有较高的适应性代价，而临床分离的一些耐利福平结核分枝杆菌表现出与野生株相当的适应性，提示可能发生了补偿性进化[37]。此后，Comas等对实验室筛选及临床分离的耐利福平菌株与相应野生株进行全基因组测序，鉴定出耐利福平的相关补偿性突变。这些突变分布在rpoA和rpoC基因上，主要位于RNA聚合酶α亚基与β’亚基的交界面，通过影响亚基之间的相互作用发挥补偿效应[9]。近期研究发现rpoB基因上也存在补偿性位点，携带rpoBS450L突变的耐利福平菌株进一步积累rpoBV615M突变后，在耐药水平增加的同时其生长速率提高到与野生株相近的水平[38]。而对于氨基糖苷类耐药突变的研究发现，单个16S rRNA 1491 G>U突变会导致耐药菌的适应性下降约11.7%，而进一步积累16S rRNA 1409 C>A突变后，在保持高水平耐药的同时其适应性也回复到野生株的水平[8]。此外，在耐利福平沙门菌中鉴定到的18种补偿性突变与结核分枝杆菌中的补偿性突变部分重叠[39]，进一步表明细菌通过积累耐药相关基因的二次突变来回补适应性这一补偿进化机制广泛存在。

3.2 耐药突变之间的异位显性效应

突变之间的异位显性效应是指一种突变最终导致的表型效应依赖于其他突变[40-41]。而在耐药结核分枝杆菌中，不同突变间的相互作用既可产生正向异位显性效应(减少或消除适应性代价)，也可以产生负向异位显性效应(扩大适应性代价)。

研究发现，在MDR和XDR菌株中，多种耐药突变之间的异位显性效应也发挥重要的补偿作用。Borrel等以耻垢分枝杆菌为模式菌株，通过体外竞争实验揭示了耐利福平突变(rpoB基因)和耐喹诺酮类药物突变(gyrA基因)之间的异位显性效应，发现不同的耐药基因突变组合产生的适应性代价差异显著[42]。在17种双耐药突变组合中，有6种突变组合的适应性显著高于单耐药突变菌株的适应性，如rpoBH526P +gyrAD94N、rpoBH526R +gyrAD94N等[42]。其中，个别耐药突变组合(如rpoBH526P +gyrAD94N)甚至可使MDR菌株的适应性高于野生型菌株，而这些特定的耐药突变组合在临床结核分枝杆菌中也最常见[42]。这表明不同耐药突变之间正向异位显性效应可补偿单突变导致的适应性代价。

3.3 同工酶的过表达

耐药结核分枝杆菌还可通过药物作用靶蛋白的同工酶过表达来补偿耐药突变引起的适应性下降。在耐异烟肼结核分枝杆菌中，katG突变导致KatG的活性降低甚至失活，从而使其抵御过氧化物氧化损伤的能力降低。然而，结核分枝杆菌ahpC基因可编码另一种烷基过氧化氢还原酶(AhpC)，该酶在正常情况下表达量很低[43]。在耐异烟肼菌株中，经常检测到ahpC基因的启动子突变，如-54 C>T、-48 G>A等。研究这些突变的功能时发现，突变后AhpC表达分别上调9倍和2.7倍，而大量AhpC可通过解除活性氧的氧化损伤作用来部分回补由katG突变导致的适应性下降，从而使耐异烟肼结核分枝杆菌发生补偿性进化[6-7]。

4 补偿性进化在耐药结核分枝杆菌传播中的影响

早期数学模型预测认为，未来的结核病耐药形势主要取决于耐药结核分枝杆菌的适应性，而耐药突变会导致细菌适应性下降，因此耐多药结核病只是地方性的公共卫生问题，不会造成显著的传播流行[3-4]。Cohen等基于数学模型的研究指出，即使MDR菌株的平均适应性较低，但长远来看，总有一部分相对适应的MDR菌株能竞争成功，造成广泛流行[44]。然而，近期多项研究表明，耐药结核分枝杆菌造成的近期传播甚至比敏感菌更严重[5,45-47]。究其原因，除耐药结核病患者久治不愈导致更多的传播事件外，耐药结核分枝杆菌本身的适应性进化也可能发挥重要作用。

Comas等发现，全球耐药结核病负担最严重的国家中，超过30%的MDR菌株携带rpoA/rpoC基因上的补偿性突变，提示MDR菌株的补偿性进化可能促进MDR-TB的流行[9]。早期数学模型研究仅考虑了耐药突变导致的MDR菌株适应性下降，但该研究指出数学模型在预测未来MDR-TB的流行趋势时应重点考虑补偿性突变对MDR菌株传播和流行的贡献[9]。此外，de Vos等利用IS6110分型鉴定成簇菌株，发现成簇的耐利福平菌株携带rpoC突变的比例较非成簇菌株高[10]。Li等利用24位点可变数目串联重复序列(variable number of tandem repeats，VNTR)分型方法鉴定成簇菌株，同样发现MDR成簇菌株中携带的rpoC突变比例较高[11]。但值得注意的是，以上研究均只是“提示”补偿性突变可能对传播有促进作用，尚缺乏直接证据证明补偿性突变确实促进了耐药结核分枝杆菌的传播。严格来讲，研究某种因素是否对传播产生影响，应该从导致的传播簇“大小”和“频率”两个方面来评估[48]。因此，关于补偿性突变对耐药结核分枝杆菌传播的实际贡献，仍需进一步探讨。

5 结语

结核分枝杆菌主要通过其基因组中耐药相关基因发生点突变来获得耐药性，且通常伴随着适应性下降。然而，耐药结核分枝杆菌可通过积累补偿性突变来减少或消除耐药突变导致的适应性代价，并可能促进耐药菌在群体中的固定及传播。本课题组前期研究发现，除耐药相关基因，另有11个非耐药相关基因中的非同义突变在治疗过程中发生显著变化，提示可能的补偿性进化机制[49]。目前对耐药结核分枝杆菌补偿性进化机制的探索仍处于初级阶段，存在诸多问题[50-51]。主要包括：①除以上综述的补偿性进化机制外，还存在哪些可能补偿机制？②补偿性突变的积累对结核分枝杆菌进一步积累其他耐药突变有无促进作用？③体外竞争实验获得的适应性评价能否真实反映结核分枝杆菌在体内的适应性？④尽管目前研究提示补偿性突变可能促进传播，但并不确定补偿性突变在耐药结核分枝杆菌传播中究竟有多大贡献。对这些问题进行深入探索，将有助于人们深入了解结核分枝杆菌的耐药进化和补偿性进化机制，对改善耐药结核病的治疗及监控耐药结核分枝杆菌特别是高适应性耐药菌的出现与传播具有重要意义。

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. GAO Qian, E-mail: qiangao@fudan.edu.cn

Fitnesscostandcompensatoryevolutionofdrug-resistantMycobacteriumtuberculosis

PI Rui, LIU Qingyun, GAO Qian

KeyLaboratoryofMedicalMolecularVirologyofMinistriesofEducationandHealth,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China

The increasing rate of drug resistance in tuberculosis possesses a great challenge to the global tuberculosis control. The drug resistance inMycobacteriumtuberculosis(M.tuberculosis) is mainly conferred by chromosomal mutations in essential and highly conserved genes, and usually accompanied by a reduction in fitness, namely “fitness cost”. However, this fitness cost can be ameliorated by secondary compensatory mutations which help restore the fitness of drug-resistant strains. The compensatory evolution has been regarded as the biological basis of the extensive spread and high prevalence of drug-resistantM.tuberculosis. Recently, a series of scientific works in the field of molecular epidemiology of tuberculosis and the basic research on the compensatory evolution of drug-resistantM.tuberculosishave been conducted. In this review, we focus on the molecular mechanisms for fitness cost of drug resistance, the compensatory evolution and the potential impacts of these two processes on the transmission ofM.tuberculosis.

Mycobacteriumtuberculosis; Drug-resistance mutation; Fitness cost; Compensatory evolution; Epistasis

国家自然科学基金(91631301)

高谦

2017-07-11)

更正

本刊2017年12卷5期299页上《产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌血流感染的耐药性、危险因素及临床结局分析》一文(作者：林佛君，等)的作者单位“深圳市南山区人民医院感染科，深圳市内源性感染诊治研究重点实验室，深圳 518052”应为“广东医科大学附属深圳市南山区人民医院感染科，深圳市内源性感染诊治研究重点实验室，深圳 518052”。特此更正！

《微生物与感染》编辑部