免疫组织化学检测CD3d、CD4、LCK、IL-7R在泪腺良性淋巴上皮病变组织的表达及临床意义

·临床研究·

免疫组织化学检测CD3d、CD4、LCK、IL-7R在泪腺良性淋巴上皮病变组织的表达及临床意义

刘骁王蕾马建民葛心李静王霄娜

目的检测LGBLEL患者病变泪腺标本组织中CD3d、CD4、LCK、IL-7R的表达情况，探讨病变组织中CD3d、CD4、LCK、IL-7R的表达与LGBLEL发病之间的关系。方法采用免疫组织化学方法检测LGBLEL患者病变泪腺组织中CD3d、CD4、LCK、IL-7R等蛋白的表达情况，并以单纯眼眶海绵状血管瘤患者瘤体组织标本做对照。采用半定量积分法(semi-quantitative immunoreactivity scores，IRS)计算实验组及对照组标本组织中的阳性表达积分值。结果免疫组织化学检测结果显示LGBLEL组CD3d、CD4、LCK、IL-7R蛋白表达均呈阳性；CD3d在淋巴滤泡周围阳性表达率高达85.5%，在淋巴滤泡间区阳性表达率高达51.8%，总体积分值为强阳性(++++)；CD4在淋巴滤泡周围阳性表达率高平均约54.6%，在淋巴滤泡间区阳性表达率高达22.5%，总体积分值为阳性(+++)；LCK在淋巴滤泡周围阳性表达率高平均约28.9%，在淋巴滤泡间区阳性表达率高达9.8%，总体积分值为阳性(++)；IL-7R在淋巴滤泡周围阳性表达率高平均约9.7%，在淋巴滤泡间区阳性表达率平均约4.6%，总体积分值为阳性(+)；CD3d、CD4、LCK、IL-7R在腺上皮腺泡的表达呈现明显差异，其中CD3d阳性表达率最高，表达约13.5%，并可见CD3d阳性细胞侵入腺泡现象，CD4阳性表达率次之，表达约4.5%，偶见侵入腺泡现象。LCK、IL-7R在腺泡的表达均呈阴性，未见侵入腺泡现象。眼眶海绵状血管瘤组CD3d、CD4、LCK、IL-7R表达均呈阴性。结论CD3d、CD4、LCK、IL-7R因子在LGBLEL病变组织中的表达异常，CD3d、CD4、LCK、IL-7R因子参与了LGBLEL的发病过程。

良性淋巴上皮病变；泪腺；发病机制

泪腺良性淋巴上皮病变(lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion, LGBLEL)是一种以泪腺肿大和眼睑肿胀为主要临床表现的较为常见的眼眶疾病[1，2]。该病可以发生于任何年龄、种族、性别的人群，以中年女性多见[3]。该病可以反复发作、经久不愈[4]，并有恶变的可能[5，6], 是一种严重危害人类健康的眼眶疾病。目前，有关LGBLEL的病因及发病机制尚不清楚，主要的假说包括上皮-肌上皮岛假说、病毒诱导假说、自身免疫假说、激素紊乱假说、蛋白紊乱假说、IgG4浸润假说等[7]。这些假说虽然可以从不同侧面对该病发病进行解释，但都各存争议，有待更深入的研究。近年来，随着组织胚胎学的深入研究，发现了多种淋巴管内皮标志物，这些标志物为观测淋巴管生成开辟了新的途径。本研究采用免疫组织化学技术检测CD3d、CD4、LCK、IL-7R分子在病变组织中的表达情况，以探讨淋巴组织增生及淋巴管生成的发病机理。

资料与方法

一、标本来源

选取2010年8月至2016年10月在首都医科大学附属北京同仁医院眼肿瘤专科进行手术切除泪腺组织并经病理组织学确诊的20例LGBLEL患者病变泪腺标本组织和10例单纯眼眶海绵状血管瘤患者瘤体组织。本实验方案已通过首都医科大学附属北京同仁医院伦理委员会审查，并与患者签署知情同意书。

二、取材

将手术切除的LGBLEL患者病变泪腺标本组织和眼眶海绵状血管瘤患者瘤体组织先用PBS缓冲液冲洗干净，去除血污，将标本分为两部分，其中一部分放入冻存管中，置于-80 ℃冰箱低温保存；另一部分用10%福尔马林固定，并交由上海生工生物工程有限公司对标本进行石蜡包埋后切片，制作成石蜡切片。

三、主要耗材与试剂

兔抗人CD3d抗体和兔抗人CD4抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，鼠抗人LCK抗体和鼠抗人IL-7R抗体(美国 Abcam公司)，通用二步法试剂盒和DAB显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司) 山羊血清(美国Gibco公司)等。

四、实验方法

1.将石蜡切片烤片后经脱蜡、水化；抗原修复；阻断内源性过氧化物酶；封闭；加一抗；加二抗；加DAB液、复染，脱水，封片等步骤行免疫组化染色后放倒置相差显微镜观察切片的染色结果并照相。

2.免疫组化结果判读：以CD3d、CD4、IL-7R细胞膜呈现棕黄色颗粒为阳性，LCK细胞浆呈现棕黄色颗粒为阳性。分别计数整体病变泪腺组织、增生淋巴滤泡、淋巴滤泡间区、腺泡4个部位的阳性表达率，在腺泡的表达只要一圈腺上皮中出现1个阳性细胞即算为阳性。采用半定量积分法(semi-quantitative immunoreactivity scores，IRS)计算整体病变泪腺组织阳性表达积分值。显微镜下低倍镜下随机观察3个染色视野，转换高倍镜，对每个视野的阳性率(视野内阳性所占面积的百分比)及视野内染色程度分别进行分级计分，取3个视野的平均值。阳性细胞面积≤5%：0分、5%～25%：1分、25%～50%：2分、50%～75%：3分、≥75%：4分。着色强度依据深浅记分，无着色：0分、浅着色：1分、深着色：2分。根据两项相乘的分数为最后的积分值：≤1.0为阴性(-)，1.1～2.0为弱阳性(+)，2.1～3.0为阳性(++)，3.1～4.0为阳性(+++)，≥4.0为强阳性(++++)。

结 果

免疫组织化学染色结果显示：对照组单纯眼眶海绵状血管瘤CD3d、CD4、LCK、IL-7R均为阴性表达。实验组病变泪腺组织CD3d、CD4、LCK、IL-7R表达结果(见图1～4)。实验组腺泡CD3d、CD4、LCK、IL-7R表达结果(见图5～8)。

免疫组织化学染色结果显示:CD3d在淋巴滤泡周围阳性表达率高达85.5%，在淋巴滤泡间区阳性表达率高达51.8%，均呈深着色，总体最后的积分值，≥4.0为强阳性(++++)；CD4在淋巴滤泡周围阳性表达率高平均约54.6%，在淋巴滤泡间区阳性表达率高达22.5%，均呈深着色，总体最后的积分值，3.1～4.0为阳性(+++)；LCK在淋巴滤泡周围阳性表达率高平均约28.9%，在淋巴滤泡间区阳性表达率高达9.8%，均呈深着色，总体最后的积分值，2.1～3.0为阳性(++)；IL-7R在淋巴滤泡周围阳性表达率高平均约9.7%，在淋巴滤泡间区阳性表达率平均约4.6%，均呈深着色，总体最后的积分值，1.1～2.0为阳性(+)；CD3d、CD4、LCK、IL-7R在腺上皮腺泡的表达呈现明显差异，其中CD3d阳性表达率最高，表达约13.5%，并可见CD3d阳性细胞侵入腺泡现象，CD4阳性表达率次之，表达约4.5%，偶见侵入腺泡现象。LCK、IL-7R在腺泡的表达均呈阴性，未见侵入腺泡现象。对照组单纯眼眶海绵状血管瘤患者病变泪腺组织CD3d、CD4、LCK、IL-7R均表达阴性。见表1～2。

图1 LGBLEL组织CD3d+10×10倍图2 LGBLEL组织CD4+10×10倍图3 LGBLEL组织LCK+10×10倍图4 LGBLEL组织IL-7R+10×10倍图5 LGBLEL腺泡CD3d+10×20倍图6 LGBLEL腺泡CD4+10×20倍图7 LGBLEL腺泡LCK-10×20倍图8 LGBLEL腺泡IL-7R-10×20倍

表1 GBLEL患者整体病变泪腺组织、增生淋巴滤泡、淋巴滤泡间区、腺泡CD3d、CD4、LCK、IL-7R阳性表达率情况比较(%)

组别CD3dCD4LCKIL-7R整体病变泪腺组织68.738.619.47.2DW增生淋巴滤泡85.554.628.99.7增生淋巴滤泡间区51.822.59.84.6腺泡13.54.500

表2 GBLEL患者与单纯眼眶海绵状血管瘤患者病变泪腺组织CD3d、CD4、LCK、IL-7R整体表达情况比较

组别例数CD3dCD4LCKIL-7RGBLEL组20++++++++++单纯眼眶海绵状血管瘤组10----

讨 论

LGBLEL是一种危害人类健康的眼科疾病，患者以中老年女性双眼发病较为多见，临床表现主要为双眼或单眼无痛性眼睑肿胀，眼眶MRI扫描显示双侧或单侧眼睑肿胀伴泪腺弥漫性肿大、脱垂，病情迁延反复，存在一定的恶变倾向。病理改变表现为腺小叶结构仍存在，小叶内腺泡间有淋巴细胞浸润，继而腺泡破坏消失，为密集的淋巴细胞和组织细胞所代替，小叶内导管增生扩张，患者因导管上皮增生形成实性上皮团块，表现为良性淋巴组织病变。

淋巴结为人体重要的免疫器官和防御屏障，广泛分布于人体的皮肤、黏膜及血管周围，常受到各种因子的刺激，如各类病原微生物感染、化学药物、外来的毒物、异物、机体自身的代谢产物、变性坏死的组织成分等多种因素的都可作为抗原或致敏原刺激淋巴结内细胞成分，主要是淋巴细胞、组织细胞和树突状细胞的增生，导致淋巴结肿大。近来，越来越多的研究发现，在炎性病变条件下，淋巴管生成显著增强。组织及血管间质有大量炎性细胞侵润，他们能分泌多种促炎性细胞因子，参与了淋巴管的生成过程。这些促炎性细胞因子主要包括白细胞介素1α，IL-1β，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、IL-4、IL-7、IL-8等[8]。 因此，在成人某些病理情况下，激活一套特殊的转录因子，可以通过转变从毛细血管内皮细胞表型转为淋巴管内皮细胞表型所需要的分子程序，来调节内皮细胞的分化[9]。

本实验选用单纯眼眶海绵状血管瘤患者术后标本作为对照组，原因主要有以下3个[10]：(1)单纯眼眶海绵状血管瘤是一种已经被证明的先天性血管发育畸形，与炎症反应和免疫作用无明显相关，而LGBLEL目前认为是一种与炎症和免疫反应相关的疾病。选用单纯眼眶海绵状血管瘤作为对照组不会对实验组的研究目的有所干扰。(2)单纯眼眶海绵状血管瘤发病率较高，标本易收集。北京同仁医院眼肿瘤科每年收治的单纯眼眶海绵状血管瘤手术标本近80例，故有较多的标本量供采用。(3)正常的泪腺组织难以获取。

CD3分子主要存在于T细胞表面，由6条肽链组成，与T细胞受体结合参与TCR信号转导，其主要功能是转导T细胞受体识别抗原所产生的活化信号。CD3分子处于外周血中并是其中成熟的T 淋巴细胞中最好标志物(marker) 之一，测定CD3+T淋巴细胞对评价免疫缺陷症、白血病、淋巴瘤的分型诊断具有重要意义。CD4分子是人类免疫系统中一类重要的免疫分子，主要表达在Th细胞，是Th细胞识别抗原的受体，参与Th细胞识别抗原的信号转导。CD4分子是T淋巴细胞的重要标志物，可检测机体免疫功能、对白血病和淋巴瘤的免疫分型诊断及免疫抑制疗法的评价具有重要意义。LCK又称T淋巴细胞酪氨酸激酶，是效应T细胞形成的必要因子，在T细胞介导的免疫应答中具有重要作用，对LCK中的编码基因在细菌诱导下的表达模式进行研究，可有助于揭示抗菌免疫的分子机制。白介素7受体(interleukin-7 receptor,IL-7R)是T淋巴细胞生长发育所必需的细胞因子，它可激活T细胞、B细胞、巨噬细胞 以及树突状细胞。IL-7R与自身免疫密切相关。起重症联合免疫缺陷病是由IL-7R在细胞表面的缺失所导致的。

本研究检测了LGBLEL病变组织的CD3 d、CD4、LCK、IL-7R分子表达水平，免疫组化定位检测发现CD3d在LGBLEL病变泪腺组织高表达，在增生淋巴滤泡的周边部位表达明显增高，在滤泡间区也表达增高，腺泡也可见浸润性表达，说明CD3d阳性细胞即T淋巴细胞在LGBLEL病变泪腺组织发病中起主要作用；CD4阳性细胞偶见侵入腺泡现象。LCK、IL-7R在腺泡的表达均呈阴性，未见侵入腺泡现象。CD3d、CD4、LCK、IL-7R属于原发免疫缺陷(primary immunodeficiency)通路的主要作用因子[11]，原发免疫缺陷通路是免疫反应中的较为少见的一条信号通路，它的功能及机制研究尚不明确，有研究显示原发免疫缺陷通路在原发性免疫缺陷病和艾滋病等疾病的发病过程中起到重要作用，所以就体液免疫、细胞免疫、自身免疫及原发免疫缺陷等多种免疫通路选取恰当细胞因子对LGBLEL病变组织的间质、腺泡及所形成的淋巴滤泡进行定位标记，对揭示LGBLEL的病因及发病机制会有重要意义。

总而言之，本研究结果表明泪腺良性淋巴上皮病变组织标本中CD3d、CD4、LCK、IL-7R异常表达参与了LGBLEL的发病过程，但其详细机制仍需进一步研究。

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UsingtheimmunohistochemicalexamtoanalysetheexpressionandclinicalsignificanceofCD3d,CD4,LCKandIL-7Rinlacrimalbenignlymphoepitheliallesion

LiuXiao，WangLei，MaJianmin，GeXin，LiJing，WangXiaona.

BeijingTongrenEyeCenter，BeijingKeyLaboratoryofOphthalmologyandVisualScience，BeijingTongrenHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijng100730，China

ObjectiveDetecting the expression of CD3d,CD4,LCK,IL-7R in lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion and discussing whether it is related to the pathogenesis of lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion.MethodsUsing the immunohistochemical exam to detect the expression of CD3d,CD4,LCK,IL-7R in lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion and orbital cavernous hemangioma was considered as control group. The integral value of positive expression in the experimental group and the control group was calculated by semi quantitative immunoreactivity scores.ResultsThe expression of CD3d, CD4, LCK, IL-7R were elevated in LGBLEL. The positive rate of CD3d expression in the lymphoid follicle is as high as 85.5%, in the interfollicular zones the positive expression rate is 51.8%, the overall score is strongly positive (+ + + +).The positive rate of CD4 expression in the lymphoid follicle is about 54.6%, in the interfollicular zones the positive expression rate is 22.5%, the overall score is positive (+ + +). The positive rate of LCK expression in the lymphoid follicle is about 28.9%, in the interfollicular zones the positive expression rate is 9.8%, the overall score is positive (++).The positive rate of IL-7R expression in the lymphoid follicle is about 9.7%, in the interfollicular zones the positive expression rate is 4.6%, the overall score is positive (+).The expression of CD3d, CD4, LCK, IL-7R have showed the significant differences in the expression of glandular epithelial acinus, the positive expression of CD3 d is the highest, the expression rate is about 13.5%, and you can see the CD3d positive cells invade the acinar. The positive expression of CD4 is about 4.5%, and you can see the CD4 positive cells occasionally invaded acini. The expressions of LCK and IL-7R are negative in acini, there is no invasion of acini.The expression of CD3d, CD4, LCK, IL-7R were normal in orbital cavernous hemangioma.ConclusionThe increased expression of CD3d, CD4, LCK, IL-7R in lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion may participate in the pathogenesis of lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion.

Benign lymphoepithelial lesion;Lacrimal gland;Pathogenesis

[JClinOphthalmol,2017,25:385]

10.3969/j.issn.1006-8422.2017.05.001

国家自然科学基金(编号：81371052)

100730 首都医科大学附属北京同仁医院

马建民(Email:jmma@sina.com)

[临床眼科杂志，2017，25：385]

(收稿：2017-05-22)