He-Ne激光结合丹参对类风湿性关节炎大鼠免疫指标的影响

郝金奇，陈 霞，陆改玲，计晶晶，余艳琴，周 澐

(内蒙古包头医学院，内蒙古包头 014060)

He-Ne激光结合丹参对类风湿性关节炎大鼠免疫指标的影响

郝金奇，陈 霞*，陆改玲，计晶晶，余艳琴，周 澐

(内蒙古包头医学院，内蒙古包头 014060)

旨在研究激光结合丹参对Ⅱ型胶原诱导类风湿性关节炎大鼠模型的类风湿性因子、免疫指标、脏器系数及炎症因子的变化情况，为治疗类风湿性关节炎提供参考依据。用鸡Ⅱ型胶原诱导健康雄性Wistar大鼠为类风湿性关节炎大鼠，造模成功后，随机分为5组，于第35天处死大鼠，取大鼠各脏器，称取其湿重并计算脏器系数，检测并比较各处理组大鼠血清中类风湿性因子(RF)、IL-6、IL-1水平及免疫球蛋白水平等。处理组大鼠血清中的免疫指标IgA水平丹参结合激光组高于模型组及其他治疗组(P<0.05)，免疫指标IgG和IgM水平丹参结合激光组低于模型组及其他治疗组(P<0.05)。与模型组、空白对照组比较，各处理组大鼠脏器系数含量降低(P<0.05)。各处理组大鼠血清中IL-1、IL-6及RF含量均低于模型组且高于对照组(P<0.05)。可见激光结合丹参对Ⅱ型胶原诱导类风湿性关节炎大鼠模型具有一定程度的治疗效果。

He-Ne激光穴位照射；丹参；类风湿关节炎；免疫学指标

类风湿关节炎(Rhenmatoid arthritis,RA)是一种慢性、以关节滑膜慢性炎症病变为主的系统性、异质性疾病。在风湿病中危害最大且最难治愈[1-3]。认为RA的发病可能与遗传、感染以及免疫紊乱等因素有关，尤其是与白细胞介素-l(IL-l)、白细胞介素-6(IL-6)等炎症因子有关。目前治疗风湿病的常用西药有免疫抑制剂、非甾抗炎药、激素等[4]，对胃、肝肾损伤很大，且不能治本。而常用中药如雷公藤，青风藤也有副作用[5-7]。因此，寻找安全、高效的创新疗法成为该领域研究的热点。风湿病属中医“痹症”，正如清代王清任的《医林改错》中所说“痹证有瘀血”。明·李中梓《医宗必读卷十·痹》书中提到“治风先治血，血行风自灭”。丹参具有凉血消痈、活血祛瘀、通经止痛等功效，研究表明丹参可参与机体的免疫调节以及减轻炎症反应，尤其是对IgA具有活化作用并且可以减少IL-6的分泌[8]。激光对组织有生物效应，能增强新陈代谢、消除肿胀和炎症、以及镇痛、改善血液流变学和微循环，调节机体免疫功能[9-13]，在治疗风湿病方面也有报道[14-18]。通过He-Ne激光血管内照射可以提高T淋巴细胞数目和淋巴细胞的转化率，能使免疫球蛋白、补体正常化，循环免疫复合物的水平下降，对RA有较好治疗效果[19]。本文通过对健康大鼠注射鸡Ⅱ型胶原诱导建立大鼠类风湿性关节炎模型，并观察丹参及激光照射对类风湿性因子、免疫指标、脏器系数及炎症因子的影响，以便为临床治疗风湿病提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 由内蒙古大学动物中心提供清洁级健康雄性Wistar大鼠40只，编号为Scxk(蒙)2016-0001，8周龄～10周龄，体重180 g～200 g。所有大鼠饲养环境条件均一，温度是25℃，自然光线，环境清洁，标准颗粒鼠粮喂养，水分充足，随机分笼，自由活动，适应性喂养1周，所有Wistar大鼠试验的方法、检测均得到伦理委员会的认可。随机分为: A空白对照组， B模型组，C激光治疗组，D丹参治疗组，E丹参结合激光治疗组。

1.1.2 主要试剂和仪器 注射用青霉素钠、丹参注射液、生理盐水和戊巴比妥钠粉剂，哈药集团制药总厂生产；冰醋酸，台山市新宁制药有限公司生产；100 mL/L多聚甲醛，天津市天大化工实验厂生产；完全弗氏佐剂(CFA)、鸡Ⅱ型胶原(CⅡ)、大鼠类风湿因子(RF)ELISA检测试剂盒，大鼠IL-1ELISA，IL-6ELISA试剂盒，美国Sigma公司产品； FSH-2型高速匀浆机，江苏省环宇科学仪器厂产品；HJ-1B型氦氖激光照射仪，南京激光仪器厂产品；酶标分析仪，荷兰PHILIPS公司产品。

1.2 方法

所有大鼠都通过腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液进行麻醉按照40 mg/kg体重。将冰醋酸0.05 mL加入到100 mL去离子水中，形成混合溶液a；取一定体积的a溶液加入一定质量的鸡Ⅱ型胶原得到2 mg/mL的混合溶液b；取一定体积的b溶液再加入相同体积的完全弗氏佐剂在冰浴条件下用高速匀浆机充分混合，制成混合乳剂c，于4℃冰箱中保存备用。于每只大鼠皮肤、脚掌、尾部，分点皮内注射混合乳剂c(0.3 mL)进行类风湿性关节炎造模，并用双氧水、无菌生理盐水冲洗注射针口处，再用碘伏消毒，空白对照组腹腔注射生理盐水。每只大鼠腹腔每日注射1次青霉素钠(每只每次30万单位)预防感染，连续注射3 d。在试验第7天进行第2次类风湿性关节炎造模，操作同上。

1.2.1 试验分组及药物治疗方案 把40只雄性Wistar大鼠随机分为5组(各8只)。A空白对照组：腹腔注射生理盐水来代替造模的诱导乳剂，不给予治疗。B模型组：造模成功后，不给予治疗；C激光治疗组：造模成功后，采用He-Ne激光隔日足三里穴位照射1次，照射时间为30 min；D丹参治疗组：造模成功后，给予0.8 mg/kg丹参腹腔注射治疗，隔天1次；E丹参结合激光治疗组：造模成功后，给予0.8 mg/kg丹参腹腔注射治疗，隔天1次，并且采用He-Ne激光隔日足三里穴位照射1次，照射时间为30 min。

1.2.2 He-Ne激光穴位照射 采用He-Ne激光(波长是632.8 nm)隔日进行穴位照射，光斑直径约4 mm，输出功率为1.2 mw～1.5 mw，用大鼠固定器固定大鼠，每次照射足三里30 min。足三里在膝关节后外侧，在腓骨小头下约5 mm处[20-21]。

1.2.3 检测指标

1.2.3.1 大鼠血清中免疫指标的测定 于试验第35天处死大鼠，通过腹主动脉取血5 mL/只，离心、吸取上层血清，分装，标本随即封冻于-80℃冰柜中待检，检测得各组大鼠血清中IgG、IgA、IgM的含量。

1.2.3.2 脏器系数测定 处死大鼠后，取出脾、肝脏、肾脏、心脏和肺脏，以滤纸吸干表面血污，分别于电子天平上称取湿重，并计算脏器系数(脏器系数=本只大鼠器官湿重/本只大鼠体重)。

1.2.3.3 大鼠血清中炎症因子及类风湿性因子的测量 处死大鼠腹主动脉取血5 mL/只，离心、吸取上层血清，分装，标本随即封冻于-80℃冰柜中待检。用ELISA法检测不同处理组大鼠血清中炎症因子(IL-1、IL-6)及类风湿性因子(AF)含量比较，严格按照说明书操作。

2 结果

2.1 不同处理对免疫指标的影响

处理组大鼠血清中的免疫指标 IgA水平丹参结合激光组高于模型组及其他治疗组(P<0.05)，免疫指标 IgG和 IgM水平丹参结合激光组低于模型组及其他治疗组(P<0.05)，样本间多重比较LSD结果显示IgA模型组低于其他治疗组,与模型组大鼠比较，各治疗组大鼠血清中IgM、IgG水平均降低(P<0.05)，而激光结合丹参治疗组降低比较明显，IgA仅丹参结合激光治疗组升高(P<0.05)(表1)。

表1 不同处理组免疫指标比较

注：※与空白组比较，*与模型组比较，#与激光组比较(P<0.05)。

Note:※Compared with the blank control group；*compared with the model group；#compared with the laser group(P<0.05).

2.2 不同处理对脏器系数的影响

方差分析结果证实各处理组大鼠脏器系数均有统计学差异(P<0.05)，而LSD比较结果显示，与空白对照组比较，各处理组大鼠脏器系数含量降低且有统计学意义(P<0.05)，与模型组大鼠比较，各处理组脏器系数均显著降低(P<0.05)，而丹参结合激光治疗组降低比较明显(表2)。

表2 不同处理组脏器系数比较

注：※与空白组比较，*与模型组比较，#与激光组比较(P<0.05)。

Note:※compared with the blank control group,*compared with the model group,#compared with the laser group(P<0.05).

2.3 不同处理对大鼠血清中炎症因子及类风湿性因子含量的影响

方差分析结果显示，各处理组大鼠血清中IL-1、IL-6及RF含量均有统计学差异(P<0.05)，LSD比较结果显示与空白对照组大鼠比较，各处理组血清中IL-1、IL-6及RF含量显著升高(P<0.05)，与模型组大鼠比较，丹参治疗组、激光治疗组以及激光结合丹参治疗组大鼠血清中IL-1、IL-6及RF含量均显著降低(P<0.05)，而激光结合丹参治疗组降低比较明显(表3)。

表3 不同处理组(IL-1、IL-6)及类风湿性因子(RF)水平比较

注：※与空白组比较，*与模型组比较，#激光组比较(P<0.05)。

Note:※compared with the blank control group,*compared with the model group,#compared with the laser group(P<0.05).

3 讨论

3.1 不同处理对免疫指标的影响的分析

IgG是细细胞外液和血液中再次免疫应答的主要抗体，也是机体再次免疫应答的主要抗体。IgA是参与黏膜局部免疫的主要抗体。IgM是抗原刺激诱导的体液免疫应答中最早出现的抗体[22]。本试验显示，处理组大鼠血清中的免疫指标IgA水平丹参结合激光组高于模型组及其他治疗组(P<0.05)，免疫指标 IgG和 IgM水平丹参结合激光组低于模型组及其他治疗组(P<0.05)与研究报道一致，说明体液免疫参与类风湿关节炎的发病过程[22]。而丹参可以通过降低ox-LDL、IgG、IgA、IgM的水平恢复免疫功能[23]。各处理组比较中IgM、IgG水平降低空白对照组(P<0.05)，丹参治疗组、激光治疗组以及丹参结合激光治疗组大鼠血清中IgM、IgG水平均低于模型组(P<0.05)，而丹参结合激光治疗组降低比较明显，而IgA无统计学差异，说明类风湿性关节炎可以导致模型组大鼠出现炎症反应而出现特异的临床症状与体症，而丹参在类风湿性关节炎大鼠模型中具有很好的治疗效果，并且He-Ne激光血管内照射可以降低血清免疫球蛋白水平[24]。这说明激光结合丹参可以有效的恢复类风湿关节炎大鼠的各项免疫指标。在本研究中IgA模型组低于丹参结合激光治疗组(P<0.05)，可能与类风湿性关节炎可以导致模型组大鼠出现比较严重的局部反应，经过激光穴位照射治疗、丹参治疗以及丹参结合激光治疗恢复到一定程度，其中丹参结合激光恢复程度最快。

3.2 不同处理对脏器系数影响的分析

动物的脏器系数是动物实验中常用的重要评价指标之一[25]。动物染毒后受损脏器脏器系数随之改变。脏器充血、水肿或增生肥大等会增大脏器系数，反之脏器萎缩及其他退行性改变减小脏器系数。本研究结果显示，各处理组大鼠脏器系数均低于空白对照组(P<0.05)，模型组大鼠脏器系数均高于丹参治疗组、激光治疗组以及丹参结合激光治疗组(P<0.05)，而丹参结合激光治疗组降低比较明显。说明类风湿关节炎对肝脏、脾、肾脏、心脏和肺脏都有不同程度的损害，与其他报道的结果一致[26]，可能与类风湿性关节炎对某些靶器官损害所导致的，而各治疗组的脏器系数又有所上升，可以证明丹参结合激光对类风湿关节炎有较好的治疗作用。

3.3 不同处理对大鼠血清中炎症因子及类风湿性因子含量的影响

类风湿性因子(RF)主要存在于患者的血清和关节液中，是类风湿关节炎临床诊断的标准。研究认为类风湿关节炎是T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病,在RA 的发病机制的研究中,T 淋巴细胞、细胞因子IL-1和IL-6在介导炎症反应及对组织损伤起着重要的作用。目前认为IL-1是参与RA 进展期关节破坏的典型前炎症细胞因子，IL-6可增强IL-1的某些生物效应。在临床上，RA患者体内促炎细胞因子IL-1水平升高。本实验大鼠造模后，IL-1和IL-6水平明显升高，说明该模型与临床表现的一致性。其他各处理组大鼠血清中IL-1、IL-6及RF含量均低于模型组(P<0.05)，各处理组血清中IL-1、IL-6及RF含量高于空白对照组(P<0.05)，丹参治疗组、激光治疗组以及激光结合丹参治疗组大鼠血清中IL-1、IL-6及RF含量均低于模型组(P<0.05)，而激光结合丹参治疗组降低比较明显。本实验结果与研究报道一致[23]，分析可能在类风湿性关节炎可以导致大鼠出现比较严重的炎症反应，而经过激光结合丹参治疗可以有效降低IL-1、IL-6及RF含量，并且可以有效抑制各炎症因子的形成，对类风湿关节炎有较好的保护和治疗作用。

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EffectsofHe-NeLaserCombinedwithSalviaMiltiorrhizaonImmuneIndicesofRheumatoidArthritisRats

HAO Jin-qi，CHEN Xia，LU Gai-ling，JI Jing-jing，YU Yan-qin，ZHOU Yun

(BaotouMedicalCollege,Baotou，InnerMongolia，014060,China)

To study the changes of organ coefficient，immune indices and inflammatory factors in the model of collagen induced rheumatoid arthritis in rats by Salvia miltiorrhiza combined with laser for providing a new therapy for the treatment of rheumatoid arthritis,the rats were injected with the chicken collagen of typeⅡ for inducing rats rheumatoid arthritis model,and then divided randomly into 5 groups.The changes of organ coefficients，immune indices，rheumatoid factor and inflammatory factors (IL-6,IL-1)were measured.IgA level in serum of rat group with Salvia miltiorrhiza plus laser was higher than that in the model group and other treatment groups (P<0.05),IgG and IgM levels of Salvia miltiorrhiza combined with laser group was lower than that of model group and other treatment groups (P<0.05).Compared with the model group and the blank control group,the organ coefficients of the rats in each treatment group decreased (P<0.05).The contents of IL-1,IL-6 and RF in serum of treatment group were lower than that in model group,and higher than that in control group (P<0.05).It can be seen that Salvia miltiorrhiza combined with laser has a certain degree of therapeutic effect on type II collagen induced rheumatoid arthritis rat model.

He-Ne laser acupoint irradiation; Salvia miltiorrhiza; Rheumatoid arthritis; immunology index

2017-04-26

包头市医药卫生科技计划项目(Wsjj2014014)

郝金奇(1980-)，男，山东菏泽人，讲师，硕士，主要从事预防医学研究。*

S852.4

A

1007-5038(2017)12-0054-05