A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因原核表达及间接ELISA方法的建立及应用

张 曼，韩 飞

(陕西省杨凌职业技术学院动物工程分院，陕西杨凌 712100)

A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因原核表达及间接ELISA方法的建立及应用

张 曼，韩 飞

(陕西省杨凌职业技术学院动物工程分院，陕西杨凌 712100)

原核表达A型副鸡嗜血杆菌(Haemophilusparagallinarumserotype A，Hpgserotype A)的血凝素蛋白HA，并以HA蛋白为包被抗原，建立血清间接ELISA检测方法。克隆HpgHA基因，将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中进行重组HA蛋白的诱导表达，对表达产物进行纯化，并进行Western blot鉴定；用纯化后的HA蛋白作为包被抗原，优化反应条件，建立血清间接ELISA检测方法，并进行特异性、灵敏度和重复性试验，最后对临床样品进行检测。原核表达获得大小约为37 ku的重组HA蛋白；Western blot结果表明重组蛋白具有良好的特异性和抗原反应性。Hpg间接ELISA优化反应条件为：抗原包被量每孔500 ng，血清以1∶200倍稀释作用1 h，酶标二抗以1∶2 500倍稀释作用1 h，TMB显色时间为10 min。在该优化条件下，OD450≥0.34为阳性，反之为阴性；特异性试验结果表明对鸡新城疫病毒、禽流感病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清检测均为阴性；对85份阳性血清进行检测，敏感性为98.8%；重复性试验结果表明，批内和批间OD450值的变异系数分别1.5%～3.7%和6.5%～8%。用本试验建立的方法对临床上215份鸡血清样品进行检测，阳性率为25.1%。说明建立的ELISA检测方法可用于Hpgserotype A抗体水平的检测。

A型副鸡嗜血杆菌；血凝素蛋白；纯化；间接ELISA

副鸡嗜血杆菌(Haemophilusparagallinarum，Hpg)是鸡传染性鼻炎的病原，该病临床症状为鸡的急性上呼吸道感染，鼻腔和鼻窦发炎，眼结膜发炎，流泪，病鸡产蛋量下降，生长缓慢[1]。本病潜伏期短，传播快，发病率高，病死率低[1-2]，在世界各地均有流行，给鸡的养殖造成很大的经济损失[2-4]。Hpg分为A、B、C 3个血清型[5]。鸡传染性鼻炎近年来在我国呈蔓延之势，A型和B型的Hpg已在我国部分地区长期流行[6-7]。感染的鸡场很难清除该病，对于该病主要以药物和疫苗进行预防。免疫水平检测可以反映鸡群感染状态或免疫状态，为本病的防治提供依据。传统的琼脂扩散试验、血凝和血凝抑制试验等虽然操作简便，但特异性、敏感性和重复性不理想，难以满足要求，PCR方法仅可检测感染情况，且对试验条件要求高，不便于用于大量样品检测，酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是检测抗体水平的可靠手段[8-10]。血凝素(HA)是Hpg抗原中重要的成分，也是Hpg分型的基础，具有较好的抗原反应性[4-5]，可与Hpg的阳性血清发生反应，对于鸡传染性鼻炎的流行病学检测以及免疫效果的监测具有广泛的应用前景[11]。本研究在分析了A型HpgHA基因序列，成功进行了A型HpgHA蛋白的原核表达，将纯化复性后的HA蛋白作为包被抗原，建立了检测Hpg血清抗体的间接ELISA方法，以期为鸡传染性鼻炎疫苗免疫效果检测和未免疫鸡群的疾病诊断提供方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、质粒、实验动物、血清 副鸡嗜血杆菌Hpg-8菌株购自中国兽药监察所；pEASY-T1 Cloning Kit、感受态细胞Trans5a为北京全式金生物技术有限公司产品；pET-28a(+)质粒为Novagen公司产品；原核表达BL21(DE3)菌株为康为世纪生物公司产品；SPF鸡(Specific pathogen free chicken)购自杨凌绿方生物科技有限公司；副鸡嗜血杆菌、鸡新城疫病毒、禽流感病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清由杨凌职业技术学院动物工程分院畜禽传染病实验室鉴定保存；215份鸡血清样品采自陕西省3个地区规模化养鸡场。

1.1.2 主要试剂 2×EsTaqMaster Mix、DNA Marker DL 2 000 plus、蛋白Marker为北京康为世纪生物科技有限公司产品；细菌基因组提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品；内切酶为Fermentas公司产品；T4 DNA连接酶为宝生物工程(大连)有限公司产品；预染蛋白Marker Blue PlusⅡ Protein Marker、ProteinIso Ni-NTA Resin为北京全式金生物技术有限公司产品；辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG(Rabbit Anti-chicken IgG/HRP antibody)为北京博奥森生物技术有限公司产品；酶标板为BEAVER公司产品；TMB储存液(2 mg/mL)由本实验室配制，使用液现配现用；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 HA基因的扩增和表达载体的构建 根据HpgHA基因序列(GenBank登录号AY457174)，利用Primer 5.0软件，设计用于扩增Hpg的HA基因引物，上游引物HAF-BamHⅠ:5′-CGCGGATCCATGAAAAAAACTGCAATCG-3′(下划线为BamHⅠ酶切点)，HAR-XhoⅠ:5′-CCGCTCGAGCTCGTTACCTTTAACTGAGAT-3′(下划线为XhoⅠ酶切位点)，去除了终止密码子，扩增长度为1 032 bp，引物由Invitrogen公司合成。

以提取Hpg的DNA为模板，进行PCR。胶回收目的条带，连接pEASY-T1 Cloning载体，获得T1-HA阳性质粒，送华大基因(北京)测序。双酶切T1-HA和pET-28a(+)质粒，回收酶切产物，将目的基因HA连接到pET-28a(+)载体中，PCR选取阳性克隆，然后双酶切鉴定，并将质粒测序，将序列正确的质粒命名为pET-HA。

1.2.2 HA蛋白的原核表达 pET-HA转化BL21(DE3)感受态细胞，对诱导剂浓度(IPTG终浓度0.1～1.0 mmol/L)和诱导时间进行优化，收集并处理样品，然后进行SDS-PAGE分析。

1.2.3 HA蛋白的纯化、复性 诱导培养1 L重组菌，收集菌体，裂解收集包涵体蛋白，按ProteinIso Ni-NTA Resin说明书操作纯化目的蛋白HA。

配制透析液进行蛋白复性，透析液A、B、C均含有20 mmol/L Tris-HCl，其他组分为透析液A(分别加入6，4，2和1 mol/L的尿素，调pH为8.0)、透析液B(0.6 mmol/L L-精氨酸，100 mL/L甘油，2 mmol/L EDTA，0.5 mol/L，调pH为8.0)和透析液C(25 mmol/L NaCl，0.2 mol/L尿素)。将纯化后HA重组蛋白转入透析袋中，依照尿素浓度从高到低的顺序放入透析液A中，然后依次放入透析液B、透析液C中，在4℃环境中磁力搅拌透析复性，每个透析液中放置12 h。测定复性后的HA重组蛋白浓度，分装保存于-20℃。

1.2.4 重组蛋白的Western blot分析 对纯化后的HA蛋白进行SDS-PAGE，转膜封闭后，用1∶500倍稀释的一抗(鸡A型Hpg阳性血清)，置于4℃孵育过夜后，用1∶5 000倍稀释的二抗(HRP标记的兔抗鸡IgG抗体)孵育2 h后，ECL反应液孵育，暗室中压片曝光。

1.2.5 间接ELISA检测方法的建立与初步应用

1.2.5.1 间接ELISA方法步骤 用0.1 mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)将纯化后的抗原稀释至所需浓度，以每孔100 μL的包被量加入96孔ELISA板中，用保鲜膜封孔顶，置4 ℃过夜；次日，用PBST洗液(pH7.4)洗涤3次(5 min/次)、拍干；加入50 g/L脱脂奶粉PBST，200 μL/每孔，37 ℃ 1 h，弃去封闭液；加用50 g/L脱脂奶粉PBST稀释的血清样品，100 μL/每孔，37 ℃ 1 h，同样方法洗板、拍干；加用50 g/L脱脂奶粉PBST稀释的酶标二抗，100 μL/每孔，37 ℃ 1 h后，同样方法洗板、拍干；加入100 μL/孔的TMB，避光孵育15 min；加入3 mol/L的浓硫酸50 μL/孔终止反应后，用酶标仪测定每孔的OD450值。

1.2.5.2 抗原、血清和酶标二抗最佳稀释浓度的确定 用纯化后的HA蛋白、血清以及酶标二抗进行正交试验，将抗原(HA蛋白)分别稀释至250、500和750 ng包被至ELISA板中；阴阳性血清样品以1∶50、1∶100、1∶200和1∶400倍稀释；酶标二抗以1∶2 500、1∶5 000和1∶10 000倍稀释；每孔设置两个重复取平均值，同时设立阴阳性和空白对照。进行ELISA检测，测定各孔OD450值，进行数据分析。取阳性样品OD450值(P值)约为1.0，阴性样品OD450值(N值)在0.1左右，并且P/N值最大时，为最佳抗原包被量及血清和二抗稀释度。

1.2.5.3 作用时间的优化 以抗原、血清和酶标二抗最佳作用浓度为基础，优化抗原的最佳封闭时间(37℃ 1 h、1.5 h、2 h)、血清反应时间(37℃ 0.5 h、1 h、1.5 h)、酶标二抗最佳孵育时间(37℃ 0.5 h、1 h、1.5 h)以及最佳显色时间(37℃，10 min、20 min、30 min)等条件，取阳性样品OD450值(P值)约为1.0，阴性样品OD450值(N值)在0.1左右，并且P/N值最大时，为最佳的作用时间。

1.2.5.5 特异性试验 取鸡新城疫病毒、禽流感病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清样品进行检测，统计分析结果。

1.2.5.6 敏感性试验 在最优条件下，用该检测方法检测85份Hpg阳性血清，统计分析阳性血清的检出率。

1.2.5.7 重复性试验 取Hpg阳性血清和阴性血清各3份，在同一条件下，用已建立的最佳间接ELISA检测方法进行检测，每份血清设置4个重复，根据每孔的OD450值，分析其批内的可重复性。用3批次纯化复性的HA蛋白包被酶标板，检测同一份阳性血清，根据每孔的OD450值，分析其批次间的可重复性。

1.2.5.8 临床样品检测 用已建立的检测方法检测陕西省3个地区规模化养鸡场的215份鸡血清样品，评价该ELISA检测方法的检测效果。

2 结果

2.1 PCR扩增和重组质粒双酶切鉴定结果

PCR扩增得到1 032 bp的HA基因。将HA基因连接至pET-28a(+)，重组质粒pET-HA进行双酶切，获得预期的片段(图1)。

M.DNA标准DL 2 000；1.pET-HA双酶切分析；2.HA基因扩增产物

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Restriction enzyme digestion analysis of recombanant r plasmid pET-HA; 2.Production ofHAgene

图1重组质粒酶切鉴定结果

Fig.1 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid

2.2 重组蛋白原核表达和纯化

原核表达诱导剂IPTG浓度优化结果显示当IPTG终浓度为0.6 mmol/L～1.0 mmol/L时，重组蛋白HA表达量大；全部采用0.8 mmol/L终浓度的IPTG为诱导4 h～6 h重组蛋白HA可大量表达，而pET-HA未诱导对照没有重组蛋白的表达(图2)。在最佳诱导条件下，分别取菌液上清、菌体超声裂解沉淀进行SDS-PAGE，结果显示HA重组蛋白主要以包涵体的形式存在(图略)。包涵体蛋白经ProteinIso Ni-NTA Resin纯化并复性后均获得了37 ku大小的HA重组蛋白(图2)。

M.广谱蛋白Marker；1.未诱导pET-HA；2～4.分别诱导4、5、6 h的pET-HA；5.纯化的HA重组蛋白

M.Protein Marker; 1.Uninduced cells containing pET-HA; 2-4.Cells containing pET-HAinduced for 4,5,6 h,respectively; 5.Purifiea of HA fusion protein

图2 HA重组蛋白SDS-PAGE分析

Fig.2 SDS-PAGE analysis of of HA fusion protein

2.4 重组蛋白的Western blot分析

Western blot结果表明，HA重组蛋白能与获得的A型副鸡嗜血杆菌阳性血清发生特异性反应出现大小为37 ku的条带，而与SPF鸡血清无特异性条带出现，不存在特异性反应(图4)。

M.预染标准蛋白；1.A型副鸡嗜血杆菌阳性血清；2.SPF鸡血清

M.Blue Plus II Protein Marker；1.Hpgpositive chicken serum; 2.SPF chicken serum

图3 HA重组蛋白的Western blot分析

Fig.3 Western blot analysis of HA fusion protein

2.5 间接ELISA检测方法的建立

2.5.1 抗原包被量及血清和酶标二抗最佳稀释度的确定 经多次正交试验结果显示，当HA重组蛋白的包被量为500 ng/孔，血清稀释度为1∶200，酶标二抗稀释度为1∶2 500时为最佳稀释浓度(表1)。

2.5.2 作用时间的优化 当抗原包被量每孔500 ng，用50 g/L脱脂奶粉PBST作为封闭液，37℃封闭1 h；血清以1∶200倍稀释37℃作用1 h，酶标二抗以1∶2 500倍稀释37℃作用1 h，100μL/孔的TMB 37℃孵育10 min时效果最佳。

2.5.4 特异性试验 用建立的间接ELISA检测鸡新城疫病毒、禽流感病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清样品进行检测，结果OD450值均小于0.3，为阴性，表明检测方法特异性良好。

表1 抗原包被量、血清和酶标二抗工作浓度的确定

2.5.5 敏感性试验 用建立的间接ELISA对85份Hpg阳性血清样品进行检测，检出阳性率为98.8%，表明所建立的检测方法敏感性良好。

2.5.6 重复性试验 在摸索的最优条件下，检测3份阳性血清和3份阴性血清的OD450值，结果表明，OD450值批内变异系数为1.5%～3.7%；分别用3批次纯化复性的HA蛋白检测同1份阳性血清和1份阴性血清，结果表明，OD450值批间变异系数在6.5%～8%。批内变异系数和批间变异系数都较小，表明本试验建立的检测方法具有良好的重复性。

2.5.7 临床样品检测 对采自不同地区规模化养鸡场的215份鸡血清样品进行HA蛋白抗体水平的检测。检测结果54份血清为阳性，阳性率为25.1%(表2)。

表2 陕西省不同地区鸡血清HA抗体水平检测情况

3 讨论

鸡传染性鼻炎频发于世界的各个地区，呈地方流行性，虽然该病致死率相对较低，但副鸡嗜血杆菌可在鸡群长期存在，降低鸡的生产性能，导致产蛋率降低，育成鸡生长迟缓，并且降低了病鸡抵御其他疾病的能力，在抵抗力较弱的情况下极易继发其他传染病而死亡，给养殖户造成巨大的经济损失，严重阻碍了养殖业的发展，需要引起重视严重。目前关于副鸡嗜血杆菌分子病原学的研究资料还很少，相关报道集中于诊治[9]。对于鸡传染性鼻炎的诊断方法和疫苗免疫效果的评价方法如临床诊断、血凝试验等不适合大范围的样品检测，对于鸡传染性鼻炎疫情监测以及疫苗的有效评估均需要建立更为灵敏、快捷的检测方法。

有研究认为血凝素对于Hpg是一种关键的保护性抗原，从A型Hpg中粗提的HA抗原具有免疫原性，针对A型HpgHA抗原的单克隆抗体具有被动免疫保护的作用，HA抗原是研制Hpg基因工程疫苗或诊断试剂的热点[5]。因此本试验选择Hpg HA基因，构建了质粒pET-HA，转化大肠埃希菌BL21(DE3)后，对其进行大量的诱导表达，经表达形式分析，该蛋白主要以包涵体的形式存在。将纯化复性后的重组HA蛋白作为包被抗原，最佳包被量为500 ng，血清最佳稀释度为1∶200，二抗最佳稀释度为1∶5 000，建立了间接ELISA检测抗体水平试验。试验结果显示，该检测方法具有较强的特异性，不能与鸡新城疫病毒、禽流感病毒、沙门菌病毒、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清发生反应；经批间和批内重复性试验结果可以看出，其变异系数小，重复性好；经敏感性试验结果显示，该实验敏感性强；并且本试验方法操作简单快速，成本低，适合大量样品检测。对采自不同地区规模化养鸡场的215份鸡血清样品进行HA蛋白抗体水平的检测，检测结果54份血清为阳性，阳性率为25.1%。

随着禽类养殖规模的不断扩大，禽病爆发呈现出复杂性，往往呈现多发性、并发性感染，非典型性，需要加强预防和诊断。在现在的养殖生产中“以防为主，防重于治”是防控疾病的基本原则，因此疫苗的免疫和对疾病的快速检测极为重要。本间接ELISA检测方法的建立为开展鸡传染性鼻炎疫苗免疫效果评估及未免疫鸡群疾病诊断提供技术支持，可促进鸡传染性鼻炎的有效防治。

[1] 苗得园,孙惠玲,陈晓峰,等.副鸡嗜血杆菌的分离鉴定及我国鸡传染性鼻炎的流行状况分析[J].中国预防兽医学报,2006,28(4):392-395.

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[3] Fernandez R P,Garcia-Delgado G A,Ochoa P,et al.Characterization ofHaemophilusparagallinarumisolates from Mexico.[J].Avian Pathol,2000,29(5):473-6.

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[5] 王宏俊,张培君,龚玉梅,等.A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因的克隆表达及其产物的生物学活性鉴定[J].中国兽医科学,2006,36(10):60-60..

[6] 李 峰,苗立中,沈志强.一株A型副鸡嗜血杆菌的分离鉴定[J].家禽科学,2014(10):46-48.

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[8] 苗得园,张培君.副鸡嗜血杆菌免疫鸡阻断ELlSA抗体曲线的观察[J].中国兽医杂志,2000,26(1):18-19.

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[11] 王雪敏,梁玉荣,吕学泽,等.副鸡嗜血杆菌基因文库的构建与筛选[J].中国兽医科学,2012(4):368-372.

ProkaryoticExpressionofHAProteinofHaemophilusparagallinarumSerotypeAandEstablishmentandPreliminaryApplicationofIndirectELISADetectionMethod

ZHANG Man,HAN Fei

(CollegeofAnimalEngineering,YanglingVocationalTechnicalCollege,Yangling,Shaanxi,712100,China)

After prokaryotic expression ofHaemophilusparagallinarumserotype A HA protein,and using the HA protein as the antigen,the indirect ELISA detection method was established.Hpgserotype A HA protein gene was cloned intoE.coliexpression vector pET-28a(+) in this study to induce the expression of recombinant HA protein.HA protein was purified and tested by Western blot.Using the recombinant HA protein as the antigen,the indirect ELISA detection method was established to detect the level ofHpgantibody in serum.Specificity,sensitivity and reproducibility tests were carried out,and the clinical samples were tested.The recombinant protein with the size of 37 ku was obtained.Western blot showed that the purified HA protein had good specificity and antigen reactivity.The optimal reaction conditions were established as follows:the coating amount of antigen was 500 ng per hole,closed 1 h; the serum dilution was 1∶200，reacting 1 h; the second antibody dilution was 1∶2 500,reacting 1h ; the TMB reacting time was 10 min.Criteria for determining the negative and positive results of serum samples were OD450≥0.34 and OD450<0.34,respectively.Specificity tests showed that the results of Newcastle disease virus,avian influenza virus,Salmonellaspp,Staphylococcusaureus,Pasteurellamultocida,Escherichiacolipositive sera were negative.85 positive sera were tested and the sensitivity was 98.8%.The repeatability test showed that the coefficient of variation of OD450between the same batch and different batch were 1.5%-3.7% and 6.5%-8%,respectively.The clinical 215 serum samples were tested using established system and the positive rate was 25.1%.The established system in this test can be used for clinical detection of serum antibody and epidemiological investigation ofHpgserotype A.

Haemophilusparagallinarumserotype A; HA protein; prokaryotic expression; purification; polyclonal antibody; indirect ELISA

2017-04-19

陕西省科技攻关项目(2016NY-096)；杨凌示范区重大科技项目(2016-XY-16)

张 曼(1979-)，女，陕西泾阳人，副教授，硕士，主要从事家禽养殖和疫病防控研究。

S855.1

A

1007-5038(2017)12-0018-05