国产酱类产品中的生物胺

朱天傲，刘春凤，王金晶，李永仙，郑飞云，钮成拓，李崎*

1(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)2(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)

国产酱类产品中的生物胺

朱天傲1,2，刘春凤1,2，王金晶1,2，李永仙1,2，郑飞云1,2，钮成拓1,2，李崎1,2*

1(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)2(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)

采用高效液相色谱法检测了五大类38种市售酱类产品中8种生物胺的含量，并测定了相关理化指标。所有样品都有生物胺检出，总量范围7.21～45.11mg/100g，其中组胺、β-苯乙胺和酪胺的占比最大。五类酱品的生物胺总量从高到低依次是豆酱、菌菇酱、海鲜酱、肉酱和面酱。对于原料不同的酱品，生物胺含量与理化参数的相关性并不一致，部分参数数值和生物胺含量呈现显著相关。

酱；生物胺；食品安全

生物胺是一类含氮的小分子物质，主要由脂肪族(腐胺、尸胺、亚精胺、精胺)、芳香族(酪胺、β-苯乙胺)和杂环族(色胺、组胺)构成。生物胺作为一类生理活性物质，参与生物体内的代谢活动[1]，因此食品中的生物胺可由原材料带入，同时微生物的脱羧反应也是重要来源。因为传统的发酵过程难以控制、机理不明晰，天然发酵食品中的生物胺问题愈发受到人们关注。过量摄入生物胺，可能会引发头痛、头晕、恶心、呼吸窘迫、心悸等各种中毒症状[2-3]。出于对食品安全的考虑，人们应尽可能降低生物胺的摄入量，而检测和监控食品中生物胺的含量则是必不可少的一环。

酱是一种有悠久历史的食品，用于佐餐和调味，因其风味独特、味道鲜美、营养丰富而被广泛制作和食用。但酱的制作普遍采用自然发酵的方法，发酵菌种复杂，存在较高的微生物源性生物胺安全隐患。韩国[4-5]、西班牙[6]、台湾[7]等对当地酱品中的生物胺进行过报道。中国内地的报道则较少，胡鹏等测定和比较了18种毛霉和细菌型豆豉中的生物胺，但未结合其他理化数据进行深入讨论[8]。此外，目前酱类产品中的生物胺研究大多集中于豆类酱，而已有报道表明，鱼肉和发酵肉制品的生物胺含量较高[9-10]，因此以鱼或肉制成的酱品值得重点关注。为了综合全面地评估传统酱类食品中的生物胺问题，本研究检测了市场上包括肉类和非肉类在内的多种类型酱品，同时分析和讨论了pH、盐度、总酸、氨基酸态氮等可能影响生物胺含量的理化参数，并结合相关系数，以期分析出可能影响生物胺的因素。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从当地超市购买38种不同种类的酱品，所有样品都储存于4℃，并尽快进行分析。

标准品：组胺二盐酸盐，购自加拿大Bio Basic公司；色胺、β-苯乙胺，购自瑞士AdamasReagent公司；腐胺二盐酸盐、尸胺二盐酸盐、酪胺盐酸盐、精胺、亚精胺，购自美国Sigma-Aldrich公司。所有标品的纯度都高于98%。

试剂：色谱级乙腈、甲醇，购自美国Sigma-Aldrich公司；苯甲酰氯，购自瑞士AdamasReagent公司；超纯水，购自无锡飘之霖公司。

标准溶液配制：用超纯水溶解标准品，配制1 g/L的储备液，4℃避光保存，3个月内有效。分别吸取1.00 mL各生物胺单组分标准储备液，置于同一个10 mL容量瓶中，0.1 mol/L超纯水定容，配制成生物胺标准混合使用液。随后，分别吸取一定量的标准混合使用液置于多个10 mL容量瓶中，分别加水定容，使终浓度为0.1、1、2.5、5、10、15、25、50 mg/L。

1.2 仪器与设备

SHZ-B型水浴恒温振荡器，上海博讯公司；LE438型pH计，瑞士Meltler-Toledo 公司；Centrifuge 5804R型低温高速离心机，德国Eppendorf公司；日立高效液相色谱仪，日本日立公司。

1.3 实验方法

1.3.1 生物胺含量检测

根据HWANG[9]和栾光辉[11]等的方法稍作调整。准确称取5 g酱品置于50 mL离心管中，加入40 mL 60 g/L三氯乙酸溶液后，放入30 ℃的水浴恒温振荡器，200 r/min下振荡30 min。随后离心10 min，滤纸过滤。2 mL滤液放入10 mL离心管中，与1 mL NaOH溶液(2 mol/L)混合。加入20 μL苯甲酰氯后，立即将离心管放入水浴恒温振荡器，30℃，200 r/min振荡20 min。加入2 mL饱和NaCl溶液停止衍生化反应后，加入3 mL无水乙醚萃取，200 r/min振荡5 min后，1 200 g离心5 min。小心吸取上清液置于5 mL离心管中，氮气吹干。用1 mL乙腈溶解管中残留物，0.22 μm滤膜过滤后上机检测，进样体积10 μL，梯度洗脱程序如表1所示。色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18，柱温28℃，流速0.6 mL/min，检测波长254 nm。

表1 梯度洗脱程序Table 1 The gradient elution program for separation of biogenic amines

注：A相是乙酸铵溶液(0.01 mol/L)，B相是乙腈。

1.3.2 理化参数

PFD最常见的症状是POP、SUI，对女性正常生活影响最大。POP是盆底支持组织(肌肉和筋膜)松弛导致盆腔组织器官移位而出现的盆腔功能异常，子宫脱垂发生率较高，其次是阴道前壁膨出、阴道后壁膨出。我国中老年妇女POP患病率为30%，美国老年女性POP患病率为50%[10]。71%POP患者伴有SUI，59%SUI患者伴有POP[11]。PFD病因尚不十分清楚，流行病学研究[12]显示，年龄、雌激素水平下降、妊娠和阴道分娩、便秘、肥胖、盆腔手术史等是PFD的主要致病因素,其中年龄、经阴道分娩、多产是PFD独立危险因素，肥胖、便秘、雌激素分泌减少、慢性咳嗽是非独立危险因素。

根据SHUKLA[12]等描述的方法，取10mL去离子水加入5 g酱醅样品中，充分搅拌均质后，用pH计测定样品的pH。

根据国标GB 5009.40—2003，对样品的盐度、总酸、氨基酸态氮(AAN)进行检测。

1.4 数据分析

使用SPSS Statistic19.0 软件，根据样品中生物胺含量进行聚类分析，并结合pH、盐度、总酸、氨基酸态氮等理化指标进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 检测方法的效果

生物胺衍生物的分离效果如图1所示。图1-a表示质量浓度为10 mg/L的生物胺标准混合液出峰情况，图1-b则是样品中的生物胺的谱图。由图可知，该方法对标准品和样品中的生物胺都有较好的分离效果。

1-腐胺；2-尸胺；3-亚精胺；4-精胺；5-色胺；6-苯乙胺；7-组胺；8-酪胺图1 生物胺混合标准品与样品检测色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed biogenic amine standards and tested sample

根据进样结果制作标准曲线，计算回归方程，并进行相关实验确定检出限、精密度和回收率，结果如表2所示。8种生物胺的浓度在0.1～50 mg/L时，其回归系数R2≥0.981 5。色胺的检测限(LOD)最低，为0.002 mg/L，亚精胺最高，达到0.098 mg/L，本文使用LOD的3倍含量作为定量限，含量大于检出限但低于定量限者不定量。连续对同一生物胺标准品进样6次，其精密度(RSD)≤1.30%。酱样品中，生物胺的加标回收率为87.8%～110.5%，可满足检测要求。

2.2 酱品中的生物胺含量

本研究对38种市售酱品中的8种生物胺进行了检测，结果列于表3和表4，各类酱品中都含有一定量的生物胺，总量范围7.21～45.11 mg/100 g。其中腐胺0～5.04 mg/100g，尸胺0～6.48 mg/100 g，亚精胺0～2.07 mg/100g，精胺0～1.36 mg/100g，色胺0～1.80 mg/100g，β-苯乙胺0～6.75 mg/100g，组胺0～16.52 mg/100g，酪胺1.61～18.83 mg/100 g。样品中的各类生物胺按浓度占比从低到高分别是精胺(3.4%)、色胺(8.3%)、亚精胺(9.6%)、腐胺(10.4%)、尸胺(11.2%)、组胺(14.0%)、β-苯乙胺(19.9%)和酪胺(23.3%)。BYUN等发现被测豆瓣酱样品中含量最高的是腐胺(39.1%)和β-苯乙胺(38.6%)[13]。KUNG等检测的27个味增样品中的主要生物胺则是尸胺(32.0%)、酪胺(27.4%)和组胺(16.6%)[7]。

表2 检测方法的回归方程、相关系数、检测限和精密度Table 2 Regression equations, R2, LOD and RSD of the detection method

注：以信噪比S/N=3时的进样浓度为最低检测限。

表3 市售非肉类酱品中生物胺含量 单位：mg/100gTable 3 BA contents of commerical pastes made from non-meat ingredients

注：数值重复测定3次，平均值±标准差；ND表示未检出。表4同。

显然，组胺、β-苯乙胺和酪胺是中国内地市售酱品中最主要的生物胺，占总胺含量的58%。组胺是已知毒性最强的一种生物胺，会引发低血压、红脸和头痛[14]。酪胺已被证明是“乳酪反应”的原因，其过量摄入会导致末梢血管收缩、呼吸加速、高血糖[15]。过量摄入β-苯乙胺则会升高血压并导致头痛。考虑到这几种生物胺的强毒性，一些学者和机构给出了相应的安全阈值。欧洲食品安全机构(EFSA)建议组胺和酪胺的一次性摄入分别不应该超过50 mg和600 mg[16]。TAYLOR等[17]认为食品中生物胺总含量达到1 000 mg/kg会对人体有害。BRIMK等[3]建议食品中的组胺、酪胺和β-苯乙胺含量应分别低于100、100～800和30 mg/kg。若以上述建议为参考，则21种样品存有潜在的生物胺超限问题。

表4 肉类酱品中生物胺含量 单位：mg/100gTable 4 BA contents of commerical pastes made from meat

为对比不同酱品中的生物胺含量，本研究选择了豆酱、面酱、海鲜酱、肉酱和菌菇酱这五类原料相异的酱品。由大豆或蚕豆制得的豆酱是最常见的酱类。本研究中的海鲜酱特指添加了诸如鱼虾等水产品的酱品，包括沙茶、虾酱等，一般出产于靠海区域。面酱起源于种植业兴起的农业社会，值得一提的是，部分市售的所谓肉酱和海鲜酱，其配料表中其实不含肉类或水产品，而是以面酱为基料，通过香料等调配出类似于肉类或海鲜的风味，因此在本研究中都归入面酱范畴。猪肉和牛肉则是主要的肉酱原料。菌菇酱主要是以香菇为代表的菇类原料，辅以面酱或豆酱共同制成。

在SPSS 19.0 软件中，以生物胺总量的平方Euclidean距离为度量标准进行聚类分析，可将样品分为4个集群：第一组的生物胺总量小于15 mg/100g，包含20个样本；第二组范围15～30 mg/100g，包含16个样本；第三组和第四组的范围分别是30～40 mg/100g和40 mg/100g以上，各包含1个样本。聚类结果表明，样品的生物胺总量较为集中，大部分豆酱样品被归为第二组，与其他四类酱品的区别较大。图2是对五类酱品的生物胺总含量的比较。

图2 五类酱品中8种生物胺总含量Fig.2 Total biogenic amines contents of paste samples made from different ingredients

结果显示，豆酱中生物胺含量最高，接下来依次为菌菇酱、海鲜酱、肉酱和面酱。这五类酱品的平均生物胺浓度范围是12.69～19.78 mg/100g，水平总体差异不大，且水产品和肉类与其他非肉类的酱品的生物胺浓度并没有显著区别。豆酱中的生物胺含量最高，接下来依次是菌菇酱、海鲜酱、肉酱，而面酱中的最低。PAVEL KALAC[14]总结称，一些温血动物、豆类和菇类自身就含有较多的生物胺，这些食材也碰巧是中国传统酱品中常见的原料。因此，这三类酱品中的生物胺含量应值得特别注意。

不同原料的酱品间，豆酱中的精胺、β-苯乙胺、酪胺平均含量最高，面酱中尸胺、色胺的平均含量最高，菌菇酱中组胺的平均含量最高，肉酱中则是腐胺、亚精胺的平均含量最高。一般认为，鱼类和肉类富含蛋白质[15]且易腐败滋生杂菌[16]，有利于微生物脱羧形成生物胺。WANG等[5]检测了鱼肉中的生物胺，其组胺含量高达84.1 mg/100 g。张海萍等[17]检测了新疆各地的熏马肠，生物胺总含量最高的超过了1 000 mg/kg。但图2的结果表明，以海鲜和肉类为原料的酱品，生物胺含量较豆酱、面酱和菌菇酱等非肉类酱品体系，并没有显著区别。这可能是因为酱品的生产加工中，生物胺含量会受到较多因素的影响。而且肉类的加工条件更加严苛，已有报道发现高温[18]或辐射[19]会降低食品中生物胺含量，因此原料带入或后期积累的生物胺很有可能在加工过程中大量降解而损失。此外，酱品中往往会加入香辛料进行调味，JAE-HYUNG MAH等发现大蒜提取物对盐腌凤尾鱼中生物胺的生成有很强的抑制作用[20]，丁香和肉桂也有相近的效果[21]。这些发现能在一定程度上解释解释含肉和不含肉类的酱品中生物胺含量的微小差异。

2.3 酱品理化指标检测

与酱品质量相关的理化参数因为代表了环境特性，与生物胺的关系值得探究，本研究测定了样品中pH、NaCl、总酸、氨基酸态氮这4个理化性质，结果列于表5。

被检测的38种样品的pH为3.89～6.05，可知酱品体系是一种酸性环境。pH可以影响微生物的氨基酸脱羧酶[14]和胺氧化酶活性[18]，进而影响生物胺的形成。BOVER-CIDA等根据乳酸菌在酸性环境下产生物胺使pH发生变化的现象，从而开发了改进的指示性培养基[19]。而卢士玲等却发现，低pH对屎肠球菌的生长和生物胺的产生均有显著的抑制作用[20]。可见pH与生物胺形成量的关系并不能一概而论，还要视微生物和其他条件而定。酱品中富含多种有机酸，检测结果表明，样品中的总酸含量范围0.18～3.16 g/100g(以乳酸计)。对于某些微生物，尤其是乳酸菌，发酵后期的培养基含酸量较高，微生物为抵抗酸胁迫而合成氨基酸脱羧酶，产生碱性的生物胺以改善生存环境。盐在酱品生产中可以抑制杂菌并带来风味，不同样品的检测结果(以NaCl计)相差较大，范围1.46～14.74 g/100g。有报道发现，在高盐度的条件下，大多数的细菌生长缓慢，合成生物胺的能力也会变弱[18]。豆酱和面酱是含盐量最高的2种酱品，但二者生物胺含量的差距最大，这可能是因为不同原料的酱醅体系富集的发酵菌种不同，在含盐量相近的条件下依旧表现出相异的生物胺合成能力。氨基酸态氮是以氨基酸形式存在的氮元素的含量，是评价酱和酱油品质的重要指标。被测的38种样品中的氨基氮含量为0.04～0.9 g/100g，其中豆酱的氨基酸态氮平均含量高于其他类型酱品。

2.4 相关性分析

本研究同时对所有样品的生物胺浓度和理化参数进行相关性分析(Pearson)，相关系数列于表6和表7。与腐乳的研究结果[21]相近的是，不同类别酱品的相关系数和正负性并不一致，呈显著相关的也较少，可知不同的环境条件对不同类别的酱品中生物胺的存在影响各异。

表6 非肉类酱品中理化参数与生物胺的相关系数Table 6 Correlation coefficients for physicochemical properties and BAs contents of non-meat paste samples

注：*表示相关系数在0.05水平呈显著差异；**表示相关系数在0.01水平呈显著差异(双尾检验)。

双变量相关分析表明，面酱和海鲜酱的pH分别与组胺(-0.770)和酪胺(0.912)呈现显著的高度相关性。对于豆酱来说，盐度与亚精胺(-0.714)、组胺(-0.599)和总胺(-0.621)呈现较高的线性负相关，表明盐度对某些生物胺的形成有较显著的负面作用。以此推测，如果在加工过程中能选择合适的加盐量和添加方式，可以有效地控制生物胺的含量。微生物代谢来源的生物胺，是以游离氨基酸作为前体，经过脱羧作用生成的[22]。胡鹏等跟踪了永川豆豉制曲过程中生物胺含量变化，发现与氨基酸态氮的变化趋势一致[23]。本研究中，面酱的氨基酸态氮和尸胺(0.872)、酪胺(0.885)、总胺(0.926)呈现显著和高度的相关性，表明氨基酸与面酱中的生物胺含量具有紧密联系，控制氨基酸含量有助于降低面酱中生物胺的含量。

表7 肉类酱品中理化参数与生物胺的相关系数Table 7 Correlation coefficients for physicochemical properties and BAs contents of meat paste samples

注：*表示相关系数在0.05水平呈显著差异；**表示相关系数在0.01水平呈显著差异(双尾检验)。

3 讨论

目前酱的加工普遍采用自然发酵技术，通常是对原料预处理之后，将其转移至敞口容器晒露。不能忽视的是，大量未知的微生物都参与了发酵过程，一旦基质环境有利于生物胺的形成，安全风险就会急剧升高。本研究检测了市售常见的38个酱类样品，8种生物胺的总量为7.21～45.11 mg/100g。尽管国内并没有对酱品中的生物胺含量有限定，被测样品目前都是合格的，但是55.3%的样品中β-苯乙胺和组胺含量超过了相关研究者的建议值，可能具有潜在的生物胺风险。聚类分析可根据事物数值的特征进行分类，分析结果显示，94.7%的样品中生物胺总量都集中于0～30 mg/100g。被测样品涵盖了豆酱、菌菇酱、海鲜酱、肉酱和面酱五大类，生物胺总量浓度范围12.69～19.78 mg/100g，总体差异较小。

双变量相关性分析常用于衡量变量之间相互线性关系的强弱，本研究通过对理化参数和各种生物胺含量的相关分析，探究环境因素对各种生物胺的影响，并给出适当的推论。分析结果表明，不同原料来源的酱品，生物胺含量与理化参数的相关系数并无一致性。所有理化指标中，盐度与多种生物胺呈显著的负相关，因此盐可能是控制豆酱中生物胺含量的有效添加剂。而对于面酱来说，氨基酸态氮是影响最为显著的因素，如果选取低蛋白含量的原料或蛋白降解能力适当的发酵菌种，或许能更好地控制面酱中的生物胺含量。

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BiogenicaminesincommercialsauceproductsinChina

ZHU Tian-ao1,2,LIU Chun-feng1,2,WANG Jin-jing1,2,LI Yong-xian1,2,ZHENG Fei-yun1,2,NIU Cheng-tuo1,2,LI Qi1,2*

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Eight biogenic amines (BAs) in 38commercial sauce products in five categories were evaluated using high performance liquid chromatography (HPLC). Meanwhile, physico-chemical properties of the samples were measured. BAs was detected in all samples with the range from 7.21 to 45.11 mg/100g. Histamine, β-phenethylamine and tyramine were the majority biogenic amines. Bean sauces contain the highest level of BAs, followed by mushroom sauce, hoisin sauces, meat sauce and flour sauce. The correlations between BAs and physico-chemical properties are not consistent in different sauces, and some showed significant correlation.

paste product; biogenic amine; food safety

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013852

硕士研究生(李崎教授为通讯作者,E-mail：liqi@jiang-nan.edu.cn)。

江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)；国家高新技术研究发展计划(863计划，No.2013AA102106-03)；国家自然科学基金(No.31271919，No. 31571942，No.31301539，No.31601558，& No.31601445)；江苏省自然科学基金(BK20150159)；江苏基础研究资助项目(JUSRP51306A, JUSRP51402A & JUDCF13008)

2017-01-16，改回日期：2017-04-19