1株植物乳杆菌发酵豆粕产有机酸的研究

毛银，邹宗胜，邓禹

(江南大学，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡，214122)

1株植物乳杆菌发酵豆粕产有机酸的研究

毛银，邹宗胜，邓禹*

(江南大学，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡，214122)

从发酵豆粕中筛选得到1株生长迅速产酸量大的乳酸菌，经鉴定为植物乳杆菌，命名为JUN-DY-6，利用该菌对豆粕进行固态发酵。通过高效液相色谱法(HPLC)对发酵豆粕中的有机酸组成进行了定性定量分析。结果显示：用JNU-DY-6生产的发酵豆粕中主要有6种有机酸，其中以乳酸、乙酸、丙酸和柠檬酸为主。且发酵豆粕工艺中糖蜜的添加与否对发酵豆粕中丙酸含量影响较大。碱性蛋白酶添加量0.5%，糖蜜添加量为3%的条件下发酵豆粕，产生有机酸含量峰值为14.646 g/L，比仅使用乳酸菌发酵的情况下提高了23.1%。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示，发酵豆粕中的大豆蛋白基乎完全降解为小分子多肽。

植物乳杆菌；发酵豆粕；发酵工艺；有机酸

豆粕是畜禽最重要的植物性蛋白源，其粗蛋白含量高，营养丰富并有较平衡的氨基酸组成。在饲料发酵中，乳酸菌被公认为是最传统、最安全的发酵菌种，并被称为益生菌[1]。用乳酸菌发酵豆粕，乳酸菌能进一步降解，并把有效蛋白质作为营养源，产生生物活性肽[2]，发酵产生各种有机酸，导致pH降低[3]。

有机酸已经广泛用作畜禽(尤其是猪)的饲料添加剂。有机酸可直接参与机体能量、结构和酶促反应[4-5]，作为一种高效率的能量来源，有机酸可减少因糖异生和脂肪分解造成的组织损耗，从而提高营养物质消化率，促进生产性能发挥；可降低胃肠道pH值，减缓胃的排空速度，改变肠道内微生物区系，抑制病原菌的繁殖，减少胃肠毒素的产生，同时促进益生菌繁殖[6-7]。另外柠檬酸、乳酸和甲酸等有机酸一方面可直接刺激口腔味蕾，使唾液分泌增多，增强食欲[8-10]；另一方面，由于其具有芳香味，可掩盖不良气味，起调味作用，从而改善饲料的适口性，促进仔猪采食，加快生长[11]。丙酸具有良好的防止饲料发霉、腐败的作用。

发酵豆粕的核心是降解大分子蛋白，使豆粕中的大分子蛋白降解为多肽、小肽和游离氨基酸等小分子。本研究通过添加一定量的碱性蛋白酶来确保大分子蛋白的完全降解，在改进发酵工艺的同时采用了1株从发酵豆粕中分离的生长迅速，产酸量高的植物乳杆菌，不仅大大减少了蛋白酶的使用量，还缩短了发酵周期，提高了发酵豆粕的质量。

1 材料与方法

1.1 菌株

植物乳杆菌JNU-DY-6，从发酵豆粕中分离纯化得到，由本实验室保藏。

1.2 主要试剂

CH3COONa、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、CaCO3、柠檬酸氢二铵：分析纯，上海国药集团。豆粕来源于丰益(上海)生物技术研发中心有限公司；放线菌酮，上海生工(Sangon)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，北京索莱宝科技有限公司(Solarbio)。

1.3 培养基

MRS培养基(g/L)：蛋白胨 10.0，牛肉浸取物 10.0，酵母提取液 5.0，葡萄糖 5.0，CH3COONa 5.0，柠檬酸氢二铵2.0，吐温80 1.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·7H2O 0.05，pH 6.2～6.4，分离培养基：在MRS固体中添加2% CaCO3。

1.4 主要仪器与设备

隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；HYG-II 空气恒温摇床，上海欣蕊自动化设备有限公司；高压蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；UVmini-1240紫外分光光度计，日本SHIMADZU公司；PL2002电子天平，METTLER TOLIDO公司；5804R冷冻离心机，Eppendorf公司；5424台式高速离心机，Eppendorf公司；高效液相色谱仪，Hitachi公司；基因扩增仪(C1000TM Thermal Cycler)，Bio-Rad公司；DYY-6C 型电泳仪，Bio-Rad 公司；GelDoc凝胶成像仪，Bio-Rad公司。

1.5 实验与方法

1.5.1 乳酸菌的富集

将发酵豆粕以100 g/L的接种量接种于添加了放线菌酮(50 μg/mL)的MRS液体培养基中，200 r/min，37 ℃培养48 h，连续增殖2～3次。

1.5.2 乳酸菌的分离纯化

取一定量的富集菌液，用无菌生理盐水逐级稀释，涂布于已经制备好的分离培养基(含2%的碳酸钙)平板上，其上再覆盖一层同样的培养基，夹层厌氧培养(30 ℃，48 h)，然后挑选溶钙圈大的单菌落，在分离培养基上多次划线分离纯化得到纯培养物经鉴定为植物乳杆菌，并命名为JUN-DY-6。

1.5.3 菌株的生长曲线的测定

挑取单菌落接种于MRS液体培养基中200 r/min，37 ℃恒温摇床培养过夜作为种子液待用。取2.5 mL菌悬液于45 mL MRS培养基中(5%的接种量)，37 ℃ 200 r/min恒温培养。用分光光度计测量OD值，跟踪菌种生长情况。选用600 nm波长，以蒸馏水做参比，开始培养前测定种子的OD值作为起点，开始培养后，每隔4 h测定1次，每次测量3组数据做对照。处理OD600值，绘制该菌生长曲线图。

1.5.4 发酵豆粕

将风干的豆粕、水、糖蜜、碱性蛋白酶以及对数期的植物乳杆菌菌液按不同的的配比混合均匀后置于经无菌处理的自封袋中，封口置于37 ℃培养箱中发酵48 h，每4 h取1次样。每批次实验做3个平行。

1.5.5 发酵豆粕的预处理

1.5.5.1 高效液相色谱样品处理

每次取样取4 g发酵豆粕于50 mL离心管中，加入40 mL去离子水搅拌混匀静置1 h后取上清，经0.22 μm滤膜过滤后置于液相瓶中用于下一步实验。

1.5.5.2 SDS-PAGE凝胶电泳样品处理

称取3 g豆粕于100 mL烧杯中，加入30 mL 0.2% NaOH室温下搅拌15 min，于6 000 r/min离心7 min，弃脂层和沉淀小心留取上清液2 mL，稀释5倍留样。取30 μL经稀释的样品上清液，加10 μL 4×buffer，沸水浴10 min，13 000 r/min离心5 min用上清上样。

1.5.6 高效液相色谱法(HPLC)分析样品

使用日立高效液相色谱仪，紫外吸收检测器，分析柱用有机酸柱(Aninex Hpx-87H ion exchange column)柱温50 ℃，流动相5 mmol/L H2SO4溶液，流速0.6 mL/min，进样量10 μL，标样及样品每个跑27 min。输出图谱进行分析。根据出峰时间和峰面积和标准品比对，计算样品中各种有机酸的含量。

1.5.7 SDS-PAGE凝胶电泳

按照试剂盒中的说明书配置：12%的分离胶，5%的浓缩胶。上样量20 μL，先用80 V的电压跑20 min后，继续用120 V的电压跑120～180 min。跑胶结束后，先用固定液固定0.5 h，再用考马斯亮蓝染色液染色1 h，最后用脱色液脱色3 h，用凝胶成像仪拍照，进行图像分析。

2 结果与讨论

2.1 植物乳杆菌JUN-DY-6生长曲线

测定OD600后绘制该菌的生长曲线(图1)。该菌生长24 h左右进入平台期。实验选用15～18 h的菌液作为种子液为宜。

图1 植物乳杆菌JUN-DY-6生长曲线Fig.1 Growth curve of plant Lactobacillus JUN-DY-6

2.2 发酵豆粕不同有机酸含量分析

以下图中出现的ABCDEFGH分别代表不同的发酵工艺：A.未添加蛋白酶且同时加乳酸菌；B.未添加蛋白酶且隔夜后添加乳酸菌；C.0.5%蛋白酶同时接种乳酸菌；D.0.5%蛋白酶隔夜接种乳酸菌；E.1%蛋白酶同时接种乳酸菌；F.1%蛋白酶隔夜接种乳酸菌；G.2%蛋白酶同时接种乳酸菌；H.2%蛋白酶隔夜接种乳酸菌。

2.2.1 乳酸含量分析

乳酸(C3H6O3)能维持动物肠道菌群平衡，减少腹泻，促进钙质的吸收。从乳酸含量来看(图2)，G.添加2%蛋白酶同时接种乳酸菌的条件下乳酸含量最高为7.435 g/L，其次是D.添加0.5%蛋白酶隔夜添加乳酸菌、F.添加1%蛋白酶隔夜添加乳酸菌和C.0.5%蛋白酶同时添加乳酸菌的条件，乳酸含量分别为6.495 g/L、6.470 g/L和6.385 g/L，与对照组A相比，分别增加了31.9%、32.4%、33.0%。由此可见，若想提高豆粕中的乳酸含量，可以选择添加2%蛋白酶同时接种乳酸菌。

图2 发酵豆粕乳酸含量Fig.2 Lactic acid content in fermented soybean meal

2.2.2 乙酸含量分析

乙酸(C2H4O2)是很好的抗微生物剂、酸度调节剂和酸味剂，但是有较为刺激的气味。从乙酸含量来看(图3)，G.添加2%蛋白酶同时接种乳酸菌的条件下乙酸含量最高为4.261 g/L，其次分别是C.添加0.5%蛋白酶隔夜添加乳酸菌、D.0.5%蛋白酶同时添加乳酸菌和E.添加1%蛋白酶同时添加乳酸菌，产酸量分别为3.650 g/L、3.575 g/L、3.680 g/L。对照组(A)乙酸的含量为3.07g/L。

图3 发酵豆粕乙酸含量Fig.3 Acetic acid content in fermented soybean meal

2.2.3 丙酸含量分析

丙酸(C3H6O2)具有很好的防真菌和霉菌的作用，效果优于苯甲酸，是极佳的食品防腐剂。从丙酸含量看(图4)，D.添加0.5%蛋白酶隔夜接种乳酸菌的条件下发酵，丙酸含量最高，为2.840 g/L，而对照组A丙酸的含量为1.945 g/L。其次是H.添加2%蛋白酶隔夜接种乳酸菌，丙酸含量为2.525 g/L。发酵豆粕中丙酸的积累，能有效延长发酵豆粕存储的时间。另外，实验发现糖蜜的添加与否与丙酸的积累存在紧密联系，不添加糖蜜组基本不积累丙酸。

图4 发酵豆粕丙酸含量Fig.4 Propionic acid content in fermented soybean meal

2.2.4 柠檬酸含量分析

柠檬酸(C6H8O7)具有抗氧化、增加酸味、抑制细菌、护色、改进风味、清除有害金属的作用，是良好的食物酸味剂。由图5分析，从柠檬酸含量看，各种发酵条件下都明显比对照组产量多，都在1.000 g/L左右。

图5 发酵豆粕柠檬酸含量Fig.5 Citric acid content in fermented soybean meal

2.2.5 苹果酸含量分析

苹果酸(C4H6O5)是很好的稳定剂，有较好的抗氧化能力，在酸性条件下杀菌性很强，能促进氨基酸的吸收。与柠檬酸相比，酸度更大，产生热量更低，口味上更柔和。由图6可知，从苹果酸含量来看，C.添加0.5%蛋白酶同时接种乳酸菌的条件下产量最高为0.940 g/L，其他条件下苹果酸的产量相差不大。

图6 发酵豆粕苹果酸含量Fig.6 Malic acid content in fermented soybean meal

2.2.6 琥珀酸含量分析

琥珀酸(C4H6O4)可以产生酸味、呈味，也可以用作防腐剂。由图7可知，H. 2%蛋白酶隔夜接种乳酸菌的条件下琥珀酸含量最高为0.695 g/L，其他条件下琥珀酸含量明显比对照组A产琥珀酸量高，且差别不大。

图7 发酵豆粕琥珀酸含量Fig.7 Succinate content in fermented soybean meal

2.2.7 总酸含量分析

发酵豆粕中，各种有机酸的含量和总酸的量决定了发酵豆粕的品质。添加糖蜜的发酵豆粕，由图8可以看出，C.0.5%蛋白酶同时接种乳酸菌、D.0.5%蛋白酶隔夜接种乳酸菌和G.2%蛋白酶同时接种乳酸菌这3种条件下总酸量相对较高，分别为14.646、14.818和14.854 g/L。综合各种有机酸的情况，且考虑生产成本，不难看出，条件G.2%蛋白酶同时接种乳酸菌的情况下乳酸、乙酸含量最高；C.0.5%蛋白酶，同时接种乳酸菌的条件产苹果酸最多，D.0.5%蛋白酶，隔夜接种乳酸菌的条件下产丙酸最多，其他有机酸的含量在3种条件下大体相当。若要使发酵豆粕保存时间长，则选择D.0.5%蛋白酶隔夜接种乳酸菌的条件；若要发酵豆粕中乳酸乙酸含量最高、总酸含量最高，要选择G.2%蛋白酶同时接种乳酸菌的条件；若要提高发酵豆粕的风味和适口性，需要选择C.0.5%蛋白酶同时接种乳酸菌的条件来制备发酵豆粕。

图8 加糖蜜组总酸情况Fig.8 Total acids content in add molasses group

2.3 糖蜜对发酵豆粕有机酸含量影响分析

由图9分析得出，各条件下，未加糖蜜组的总酸量在3.594～10.463 g/L。而加入糖蜜组有机酸总量在8.819～14.818 g/L，可见不同的发酵工艺下添加糖蜜后总酸产量提高4.355～5.225 g/L。由图10、图11在不同的发酵条件下，未加糖蜜组和加糖蜜组发酵豆粕产各种有机酸含量对比可见，糖蜜对于乳酸菌发酵豆粕产乙酸、柠檬酸、苹果酸等影响较大。同时未加糖蜜组不产乳酸、丙酸，加入糖蜜组产生的乳酸、丙酸量则较高。由此可见糖蜜对于乳酸菌发酵豆粕产有机酸的种类、有机酸的总含量均有重要的影响。

图9 加糖蜜组及未加糖蜜组总酸含量比较Fig.9 Comparison of total acid content in molasses group and control group

图10 添加糖蜜组有机酸含量Fig.10 Various organic acids content in add molasses group

图11 未添加糖蜜组有机酸含量Fig.11 Various organic acids content in control group

2.4 SDS-PAGE凝胶电泳分析

大豆球蛋白是豆粕的主要营养成分之一，其中伴7S大豆球蛋白及11S大豆球蛋白是大豆球蛋白最重要的成分[12]。其中，7S伴大豆球蛋白由3个亚基组成，其相对分子质量分别为60 466 Da，55 029 Da，49 043 Da，11S大豆球蛋白也由3个亚基组成，其相对分子质量分别为44 634 Da，39 779 Da和17 952 Da。根据SDS-PAGE凝胶电泳结果图12可知，利用乳酸菌，在少量酶的作用下能够完全降解伴7S和11S大豆蛋白，而且效果非常明显。

图12 发酵豆粕中大豆蛋白的降解情况Fig.12 Degradation of soybean proteins in fermented soybean meal

3 结论

发酵豆粕中的酸谱根据发酵工艺的不同有较大的差别，主要含有3种有机酸：乳酸、乙酸和柠檬酸。在添加了糖蜜的情况下，发酵豆粕中可积累较大量的丙酸，且植物乳杆菌的生长情况明显较未添加糖蜜组好，未加糖蜜组的总酸量在3.594～10.463 g/L。而加入糖蜜组有机酸总量在8.819～14.818 g/L，明显较未加糖蜜组高。碱性蛋白酶添加量0.5%，糖蜜添加量为3%的条件下发酵豆粕，产生有机酸含量峰值为14.646 g/L，比不添加碱性蛋白酶仅使用乳酸菌发酵的情况下提高了23.1%。实际生产中应根据具体目的调整发酵工艺以满足生产要求。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示，发酵豆粕中的大豆蛋白降解为小分子多肽。

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ResearchonproductionoforganicacidsinsoybeanmealbyfermentationwithLactobacillusplantarum

MAO Yin, ZOU Zong-sheng, DENG Yu*

(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

JNU-DY-6 was isolated from soybean meal and identified asLactobacillusplantarum.It had great potential in acid production and it grew rapidly. we analyzed the composition of organic acids in fermented soybean meal by high performance liquid chromatography (HPLC).The results showed that there were 6 kinds of organic acids in fermented soybean meal,mainly including lactic acid,acetic acid,propionic acidandcitric acid. And the addition of molasses had great influence on the composition and yield ofpropionic acidin soybean meal.we worked out the optimum mass ratio for soybean meal fermentation(100g): Alcalase 0.5%,molasses 3%,the total organic acids content reached 14.643 g/L,which was 1.231 fold higher than that of normal contro lgroup respectively. By SDS-PAGE we found that soybean protein degraded into small molecular peptides.

Lactobacillusplantarum; soybean meal;fermentation techniques;organic acids

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014341

硕士研究生(邓禹教授为通讯作者,E-mail：dengyu@jiangnan.edu.cn)。

国家自然科学基金(31500070)；江苏省自然科学基金青年基金(BK20150136)

2017-03-20，改回日期：2017-05-23