女贞子中齐墩果酸提取制备与含量测定方法的研究进展

常艳丽，李鹏跃，何婷，赵怡程，陈晓怡，白少娟，王乐，王秀环，刘斌，折改梅*

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100102；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

综述

女贞子中齐墩果酸提取制备与含量测定方法的研究进展

常艳丽1，李鹏跃2，何婷1，赵怡程1，陈晓怡1，白少娟1，王乐1，王秀环1，刘斌1，折改梅1*

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100102；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

女贞子作为中国传统中医常用的滋补肝肾药物。2015版药典收载了一百多种含女贞子的中药制剂，临床应用广泛。齐墩果酸(Oleanolic acid，OA)是女贞子中主要有效成分，具有保肝等多种生理活性。且OA为多个女贞子中药制剂的指标控制成分。近十年,随着新方法、技术与仪器设备用于女贞子中齐墩果酸的提取制备和含量测定，研究取得了较为显著的成果。笔者围绕女贞子中齐墩果酸提取制备与含量测定方法进行综述，为含女贞子中药制剂工艺改进和质量控制的提升提供依据。

女贞子；齐墩果酸；提取纯化；含量测定

女贞子为木犀科常绿乔木女贞(L.lucidumAit.)的干燥成熟果实，始载于《神农本草经》，临床使用已有2000多年的历史[1]。其气微，味甘、微苦，性凉，归肝、肾经，具有滋补肝肾，明目乌发的功效。三萜、环烯醚萜、黄酮和苯乙醇苷等化合物是女贞子的主要有效成分[2-5]。现代化学和药理研究表明三萜类化合物齐墩果酸(Oleanolic acid，OA)和熊果酸(Ursolic acid，UA)是主要有效成分。迄今有115种含女贞子的中成药收载于药典(2015版)，其中含有女贞子提取工艺的中成药有79种，涉及到80种提取工艺，且多以齐墩果酸为指标成分进行质量控制[6]。据此对女贞子中OA为质量控制指标的提取工艺的改进以及质量控制方法提升是含女贞子制剂剂型改进的出发点之一。

早在90年代开始，科学家们就对女贞子中OA的提取和质控进行了大量研究，但由于OA含量较低，且与UA 结构相似，从而造成含量测定方法专属性较差等问题，为研究造成了较大的困难。近十年随着多种提取技术在女贞子中齐墩果酸提取中的应用，使其提取率和转移率显著增加；以及高效液相色谱方法和毛细管电泳方法对其含量测定的应用研究均取得了突出的成果。据不完全统计发现相关专利申报超70项，文章发表超过150篇。本文对2009年至今，近10年的女贞子中齐墩果酸的提取制备及其含量测定方法的研究成果进行综述，为含女贞子中成药的制剂改进和质量控制提供依据。

1 齐墩果酸(OA)的基本概括

OA被认为是女贞子的药效成分。它是一种五环三萜类化合物，结构见图1,具有弱酸性，是肝病辅助治疗OTC药物齐墩果酸片的原料。研究表明[7-13]，OA除具有保肝的功效外，还具有抗炎、抗菌、抗病毒、免疫凋节、降三高、抗癌、护胃和抗过氧化等多种药理作用，有广阔的临床应用前景，具有极高的科学研究价值。OA主要分布于木犀科、龙胆科、伞形科、五加科、葫芦科、杜鹃花科等科属中的女贞子、青叶胆、大星芹、楤木、大籽雪胆和滇白珠等药用植物中。其中，中药女贞子中OA含量较高，是提取OA的常用中药材。UA是OA的同分异构体，在女贞子中和OA共同存在，且二者理化性质和药理活性相近。因此，从女贞子中提取制备OA以及质量控制中都应考虑UA的存在和影响[14]。

图1 齐墩果酸化学结构式

2 女贞子中OA提取方法的研究进展

齐墩果酸成分是女贞子多种功效的药效成分，且OA在女贞子中含量较高，约为0.8%～1.5%[15]。中药女贞子中OA的传统提取方法主要有煎煮、回流提取等溶剂提取法。随着科学的不断发展，超声波提取法、微波提取法、闪式提取法、超临界流体萃取法等一些新技术开始应用于中药女贞子中OA的提取。

2.1 女贞子中OA提取方法

2.1.1 回流提取法

早期试验[16-17]采用石油醚、氯仿等进行提取，但二者具有毒性，会对人体造成一定伤害，因此现代研究中多选用乙醇作为溶剂进行女贞子中OA提取； 2005版药典规定95%乙醇回流提取女贞子药材，提取3次，每次30 min，OA含量应 > 0.6%[18]。郗艳丽[19]等选用甲醇为溶剂，研究了提取温度、料液比、回流次数对女贞子中OA提取含量的影响，结果表明在提取温度为85 ℃，料液比1∶30，回流5次的条件下，OA的提取含量最高，可达到122.66 μg/mL，提取率为4.066%。郭宇洁[20]等以OA含量为指标优化女贞子醇提工艺，得到最佳提取工艺为6倍量75%乙醇提取3次，每次2 h，含量最高可达到8 mg/g。研究数据表明由于OA极性小，分子量大，不易被较大极性的醇溶剂提取。

2.1.2 煎煮法

由于OA是有机弱酸，在碱性条件下溶解度增大，所以有学者尝试采用碱水提取OA，效果显著。刘东锋[21]等以此原理，采用10～15倍量石灰水，煎煮提取2～3次，每次2～3 h提取女贞子中OA。多篇文献研究比较发现，优化后碱水煎煮条件OA提取效率高于乙醇水溶液的提取效率。王悦[22]采用pH=14的碱液在85 ℃油浴下煮40 min，提取3次，提取效率优于95%乙醇。1999年，龚慕辛[23]等通过实验证明，碱水提取OA效果优于75%乙醇。该方法用于在实际生产时，出现溶剂用量较大，浓缩困难、沉淀过程OA损失过多等现象。为了克服碱水在提取出现的问题，吕金顺[24]等采用碱性醇溶液提取女贞子，得到OA的粗提物。该方法不仅提高了OA的提取率，降低了提取成本。而且避免了二者的缺陷，具有极大的发展空间。

2.1.3 超声波提取法

超声提取法是利用超声波所产生的空化效应、热效应和机械效应，以加速提取速率，缩短提取时间，减少溶剂用量。Xia[25]等采用超声辅助提取女贞子中OA，结果显示在40 ℃条件下，20倍量95%乙醇提取10 min，可使OA含量达到(6.3±0.25)mg/g。蒋珍菊[26]等采用乙醇作为溶剂，研究了超声频率、溶剂浓度、料液体积比、超声提取时间等影响因素对女贞子中的OA含量的影响，结果显示最佳提取工艺为：料液体积比1∶8，乙醇浓度95%，超声频率44 000 Hz，提取时间60 min。在此条件下，女贞子中OA提取含量可达到(1.271±0. 002)%。何新蕾[27]等通过响应面优化了女贞子中OA的提取工艺，结果显示在超声波功率为156.4 W，超声波时间为65.4 min，乙醇浓度为75.1%，料液比为1∶16.7的条件下，OA的提取率最高，为6.86%。与传统的溶剂提取法相比，超声波提取法对溶剂损耗较小，提取时间短，得率高，是现代研究和工业生产的发展趋势[28-29]。

2.1.4 微波提取法

微波辅助提取技术是利用微波能来提高提取效率的一种技术。其主要是通过调节微波加热的参数, 有效地加热物料中的目标成分，对目标成分进行选择性提取。樊维[30]等采用微波提取方法提取女贞子果中的OA，在单因素实验的基础上通过响应面法优化了提取工艺：体积分数为91%的乙醇溶液，微波温度62 ℃，微波时间3 min，微波功率300 W，料液比为1∶11，此条件下OA的实际提取率为2.105%。朱沛沛[31]等采用微波辅助提取女贞子中OA，通过响应面法优化提取工艺，结果表明，当乙醇浓度为82%，料液比为1∶11，微波功率300 W，温度58 ℃，时间为3 min的条件下，OA提取率最高，达到2.858 9%。孙阿慧[32]等采用微波辅助提取女贞子中OA，在单因素实验基础上通过正交试验对工艺条件进行了优化，最佳提取条件为：乙醇浓度为90%，料液比为1∶10，微波功率400 W，温度为60 ℃，时间为3 min，在此条件下OA提取率为2.518%。微波辅助提取法可显著缩短提取时间，适用于对时效要求高的提取。

2.1.5 其他先进提取技术

除上述常见的提取方法外，也有文献报道了从女贞子中提取OA的新技术：闪式提取法、超临界流体萃取法、仿生提取法。

吴景路[33]采用闪式提取技术优化了女贞子的提取工艺。闪式提取技术的主要原理为利用粉碎刀具对药材产生破碎作用，达到快速粉碎、快速提取的目的。作者以OA总含量提取率及干膏收率两个考察指标进行综合评分，采用正交试验设计优选出最佳工艺：提取时间60 s，料液比1∶4，提取温度65 ℃。含量测定结果显示，在干膏收率一致的条件下，闪式提取法可以提高OA的提取率。闪式提取法[34]是近年来兴起的一种中药提取技术，具有高效、快速、节能、操作简单等特点，现在大部分研究集中在单味药提取，为提高药物的提取率提供了良好的开端。

蒋珍菊[35]等采用超临界CO2流体萃取法提取女贞子中OA，其含量最高为1.107%，效果良好。除此之外，文献也报道了仿生提取法。OA是大分子化合物，不易从细胞中溶出，在提取时加入纤维素酶酶解女贞子药材的细胞壁，节约了能量，并且有利于OA的溶出[36]。

2.2 女贞子中OA提取样品来源筛选和前处理方法的研究进展

大量研究表明，OA的含量与女贞子的产地、采收时期以及炮制方法密切相关，药材的粉碎粒度和提取部位也对OA的含量有一定的影响，因此对女贞子药材的筛选以及前处理逐渐成为影响OA提取效率的重要因素。

陈倩倩[37]等通过实验测定了6月份和9月份女贞子中OA的含量，结果表明9月份女贞子中OA含量相对较高，提取率为3.11%。韩月芝[38]等通过比较7月至次年1月采收女贞子药材中OA的含量，确定9月份女贞子中OA含量最高。李涛[39]等比较了10批不同产地女贞子药材中OA的含量，结果显示，产地为福建的女贞子药材中OA含量最高为1.89%，其次是河南，含量为1.53%。肖薇[40]等的实验结果表明OA含量依次为酒制女贞子>盐制女贞子>醋制女贞子>女贞子生品。张丽[41]等学者同时考虑了不同树龄和不同炮制方法，考察不同炮制方法及不同树龄女贞子中OA的含量变化，筛选出OA含量较高的女贞子原料。综上所述，为提高OA的提取率，可以考虑选择9～10月份福建产的女贞子，对女贞子进行蒸煮或者酒炙也可适当增加OA的溶出量。

女贞子药材的粉碎粒度是影响OA提取率的因素之一[42]。从女贞子中提取OA时，通常将女贞子药材粉碎，过40、50、60目筛以提高含量[30,41,43-45]。但是也有研究采用超微粉进行提取，黄新平[46-47]等将女贞子药材用超微粒粉碎成粒度为5～10 μm的细粉，再用醇提法提取OA，此时选用小的液固比也可达到较好的提取效率。

又有文献报道，女贞子的OA主要集中于果皮和果肉中[17,48]，果核中OA含量仅占果实中总含量的7%，而重量却为总重量的53%。因此，将女贞子的果皮、果肉和果核分开，可显著提高OA含量。有学者将[48-49]女贞子在高温高压条件下蒸煮后，于2 500～2 800 r/min转速下搅拌，在水中形成糊状物，启动离心泵，由于果皮、果肉的密度较小，而果核的密度较大，因此在体系循环水的作用下二者完全分开。女贞子去核后OA含量显著增加，可达到15%以上。吕金顺[24]等用酸水蒸煮女贞子药材20～50 min，将蒸煮后的女贞子通过研磨、搅拌、分离出果肉，再经干燥后得到干燥果肉。

3 女贞子中OA的纯化制备方法研究进展

OA从女贞子提取物的制备方法主要有重结晶法、沉降分离法和柱层析色谱法。

3.1 重结晶法

重结晶是将晶体溶于溶剂或熔融以后，又重新从溶液或熔体中结晶的过程，是物理化学作用的结果。重结晶法是常用的纯化方法。李法庆[15]等人将提取液用活性炭脱色，滤液用90%～99%乙醇重结晶，得到纯度>98%的OA纯品。杨存[36]采用活性炭脱色法对提取液进行脱色，之后将洗脱液浓缩，加甲醇重结晶，得到的OA纯度>98%。

3.2 沉降分离法

沉降分离法沉降分离法是指固体物与液体介质密度相差悬殊，固体物靠自身重量自然下沉，使固体与液体分离的一种方法。OA的分离制备常采用常用的沉降分离法有酸碱沉降法和盐析法。

酸碱沉降法是利用OA在碱水中成盐溶解性增大，加酸调至pH=1～3时，齐墩果酸盐转变为游离状态溶解度降低形成沉淀的原理，与其他成分分离开。盐析法是利用OA大分子的性质，在饱和盐水中溶解度低的原理，与其他小分子化合物分离开。朱秀辉[50]等以OA转移率为指标，优化女贞子粗提液水沉-醇溶碱沉-酸水沉淀纯化工艺条件，结果表明最佳纯化工艺为：药材提取浓缩液加7倍量水进行水沉；加6倍量95%乙醇醇沉；碱沉适宜pH=10；酸水沉适宜pH=2，在此条件下，OA转移率可达78.19%。王悦[22]采用碱水提取OA，之后加入食盐使齐墩果酸盐沉淀析出，沉淀加水溶解，再加盐酸调节pH=1，得到OA粗品，沸水洗4～5次后得到OA成品，提取效率高。部分研究将沉降分离法与重结晶法结合使用，效果良好[51]。张来新[48]等在女贞子乙醇提取液中加入盐酸调节pH=1，沉淀加pH=11～12的碱液煮沸40 min，加食盐进行盐析，沉淀经乙醇重结晶后得到OA纯品。沉降分离法操作简单，对条件要求较低，是较好的发展方向。

3.3 柱层析色谱法

3.3.1 大孔树脂吸附法

分离OA最常用层析法为大孔树脂吸附法。黄新苹[47]等通过实验发现适合分离纯化OA的树脂类型为AB-8。孔阳[52]以OA的吸附率和解吸附率为考察指标，筛选D101、D201、LSD001、XDA-7、C008、LSA-10、 LSA-40等8种树脂中最适合OA分离的树脂以及最佳工艺条件，结果表明最优树脂为LSA-21型，最佳工艺条件为：女贞子溶液浓度为4.0 mL/min，吸附流速为3 mL/min，上样量2 BV，洗脱剂为无水乙醇，解吸流速为3 mL/min，洗脱剂用量为1.5 BV洗脱液。马轶[53]等采用大孔树脂法分离纯化女贞子中OA，筛选出最佳工艺条件为：选用HPD-600树脂，以90%乙醇，树脂柱径高比为1∶3，洗脱流速4 BV/h，药材树脂用量比1∶7。大孔树脂分离效果好，实用性强，成本较低，经过再生后仍可继续使用，分离效果无明显改变，是较好的分离制备方法。

3.3.2 离子交换树脂法

除大孔树脂吸附法外，离子交换树脂法也常用来制备OA。制备OA的离子交换树脂有凝胶性阴离子交换树脂和大孔阴离子交换树脂。张宝堂[54]等将提取液经过大孔阴离子交换树脂纯化，重结晶得到含量不低于98%的OA。杨裕启[55]等采用凝胶型阴离子交换树脂纯化从女贞子果皮中提取的OA粗品，以单因素实验为基础，采用正交试验优化了工艺条件。确定最优纯化工艺条件为：树脂粒度100目、吸附和洗脱温度为30 ℃、洗脱液乙醇体积分数为80%，在此工艺条件下，所得OA含量大于98%、回收率大于96%。大孔阴离子交换树脂价格昂贵，且吸附性能不稳定；凝胶型阴离子交换树脂价格便宜，使用寿命长，适用于工业生产。

除上述柱色谱方法制备OA以外，有学者[56]将半制备高效液相色谱法应用于OA的分离纯化，且纯化效果好、操作高效、快速，但在女贞子中OA制备没有相关报道，可作为参考。

4 女贞子中OA含量测定方法研究进展

OA与UA在药材中同时存在，且二者化学结构相近，性质相似，分离难度较大，因此OA含量测定方法的建立需要考虑到UA造成的干扰。近年来，随着技术的发展以及精密仪器设备在研究中的应用，女贞子中OA的含量测定多采用高效液相色谱法等。

4.1 薄层色谱扫描法

2005版药典[18]规定使用薄层色谱扫描法测定女贞子中OA的含量。以环己烷-丙酮-乙酸乙酯(5∶2∶1)为展开剂，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂，在100 ℃加热显色，采用双波长扫描法：λS=530 nm，λR=700 nm，测量吸光度积分值，计算。严华[57]等建立原位预处理-薄层扫描法分离测定女贞子中OA含量。操作方法为：样品溶液点样后，以1%碘-二氯甲烷溶液对斑点进行预处理后，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸(20∶5∶8∶0.1) 为展开剂，以 10%硫酸乙醇溶液为显色剂，105 ℃加热显色，采用双波长薄层扫描法，λS=530 nm，λR=700 nm，测得峰面积积分值，外标两点法计算含量。在该方法下，OA和UA薄层色谱分离度为1.3，虽然未达到实验标准，但在一定程度上解决了多年来困扰实验工作者的OA和UA混淆的问题。

4.2 高效液相色谱法

OA结构中有一个孤立的双键，在紫外光谱207 nm处有微弱的吸收，据此常采用高效液相紫外检测器作为OA检测器，检测波长多采用为210 nm。在女贞子中OA和UA多是共同存在，且保留时间很接近，为了准确测定OA含量，很多学者尝试了多种方法，且取得了较好的效果。其中卢桂英[58]等通过正交试验优化HPLC测定OA与UA的色谱条件，结果表明，以体积比为90∶10的甲醇与含有0.5%乙酸及0.01%三乙胺的水相混合溶液为流动相，流速为0.8 mL/min，OA和UA可以在16 min内得到有效分离。李芳美[59]等采用反相高效液相色谱法，测定女贞子药材中OA与UA的含量。色谱条件为：流动相：0.5%冰醋酸-乙腈(10∶90)，检测波长：210 nm，流速：0.8 mL/min，经过系统的方法学考察，所建立的测定方法具有操作简便、稳定、专属、可重复的特点。孙京海[60]等建立了测定女贞子中OA含量的高效液相色谱条件：流动相：甲醇-乙腈-水-磷酸(50∶40∶10∶0.03)，检测波长：210 nm，流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃。方法学考察良好，可用于测定女贞子中OA的含量。邢雅丽[61]等采用中心复合设计法，建立了有效、快速的分离测定OA和UA的HPLC方法。结果表明，在210 nm的检测波长下，以体积比为91.7∶8.3的甲醇与含有0.05%磷酸的水相混合为流动相，流速为0.6 mL/min，柱温为21 ℃，OA和UA分离效果最好，分离度可达到1.739。

通过对现有报道的方法进行分析比较，笔者发现为使OA与UA完全分离，现报道的高效液相色谱方法中多采用等度洗脱方式，且流速(0.5～0.8 mL/min)较慢、柱温(16～20 ℃)低等方法适当延长保留时间，改善分离效果。流动相中常加入一定体积分数的酸用以改善峰形，提高分离度，常见的有乙酸和磷酸等。

4.3 毛细管电泳法

毛细管电泳法是近年来应用的较多的一种含量测定方法，具有简单、稳定等优点。同时，毛细管电泳还可与其他技术联用，提高灵敏度和效率。巫利璇[62]等采用毛细管电泳高频电导法测定女贞子中OA和UA的含量。电泳条件为：选择未涂层弹性融硅石英毛细管柱，以1.2 mmol/L三乙胺- HCl (pH=10. 60)，0.08 mmol/L β-环糊精为运行缓冲液，分离电压为12.5 kV，重力进样10 s(高度20 cm)，温度为25 ℃。方法学考察结果显示该法简便、准确、快速、重现性好，可用于女贞子药材中OA和UA的含量测定。周逸芝[63]等采用胶束毛细管电泳法测定女贞子中含OA的6种有效成分的含量。测定方法为:未涂渍标准熔融石英毛细管(75 μm×64.5 cm，有效长度56 cm)为分离通道，60 mmol/L硼砂-10 mmol/L十二烷基硫酸钠-30 mmol/L羟丙基-β-环糊精-10%甲醇(pH=9.03)为电泳介质，分离电压为20 kV，检测波长为 210 nm，毛细管温度为25 ℃，压力进样为 5 kPa×6 s。此方法可准确测定6种有效成分的含量，可用于女贞子的质量评价和控制。黄宝美[64]等采用毛细管电泳-安培检测法测定女贞子中OA的含量，方法简便易行，结果准确。

5 总结

OA是女贞子的主要活性成分，药理作用丰富，药用价值高。但是对OA的开发较为缓慢，主要原因是OA合成困难，现从天然植物中提取制备。因此，不断探索和完善女贞子中OA的提取工艺具有特别重要的意义。目前OA制备多采用柱层析色谱法、含量测定多采用高效液相方法。提取方面除了常用的煎煮和回流提取等方法外，笔者发现一些新的技术，如闪式提取、仿生提取、超临界提取等开始尝试用于女贞子OA的提取，且具有提取率高、提取时间短、溶剂消耗量少等优点。据此笔者相信随着科学技术的不断发展，OA的提取分离与含量测定方法将会日臻完善，从而为含女贞子中药制剂的改进和质量控制提升奠定基础。

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ExtractionandDeterminationMethodsofOleanolicAcidinLigustrumlucidumAit.

CHANG Yan-li1, LI Peng-yue2, HE Ting1, ZHAO Yi-cheng1, CHEN Xiao-yi1, BAI Shao-juan1, WANG Le1, WANG Xiu-huan1, LIU Bin1，SHE Gai-mei1

(1.SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China; 2.InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100070,China)

LigustrumlucidumAit. has been used for at least 2000 years as a common herbs to nourish liver and kidney in Chinese materia medica. 2015 edition of Pharmacopoeia records 115 kinds of Chinese patent medicines containing L. lucidum Ait., which are used widely in clinical application. Oleanolic Acid(OA) having a variety of pharmacological activities, especially on liver, is one of the main active ingredients in L. lucidum Ait., and it is regarded as the quality controlling index ofLigustrumlucidumAit. In the last ten years, new extraction technologies and methods for the determination of OA were put forward. So this study summarized the research progress of extraction and determination methods of OA inL.lucidumAit. In recent years, providing reference for the reform of Chinese patent medicines and providing theoretical foundation for its quality control.

LigustrumlucidumAit.; Oleanolic acid; Extraction and purification; Quantitative determination

R284

A

1002-2392(2017)06-0113-06

2017-06-26

2017-07-15

国家自然科学基金项目(81573692)；北京中医药大学自主课题项目(2015-JYB-JSMS024)

常艳丽(1994-)，女，硕士研究生，研究方向：中药化学。

*通讯作者：折改梅(1976-)，女，研究员，博士生导师，研究方向：中(民族)药药效物质基础研究及其质控研究。