一种CD3+T细胞细胞内CD69分子的检测方法

王 静 王一任 王克强

(1.泰安市中医医院检验科，山东 泰安 271000； 2. 青岛大学医学部2016级医学检验班，山东 青岛 266000)

一种CD3+T细胞细胞内CD69分子的检测方法

王 静1王一任2王克强2

(1.泰安市中医医院检验科，山东 泰安 271000； 2. 青岛大学医学部2016级医学检验班，山东 青岛 266000)

目的 建立一种人外周血CD3+T细胞细胞内CD69的检测方法。方法 分离获取健康人PBMC，用PMA+IM(佛波醇酯+离子霉素)刺激PBMC，用蛋白转运抑制剂(Brefeldin A，BFA)阻断细胞内因子的分泌，用皂角素(Saponin)破膜，流式细胞术检测CD3+T细胞胞内CD69阳性率，以确定最佳的破膜时间。结果 最佳的破膜时间为15 min，CD3+T细胞胞内CD69表达的阳性率较高，可达87.82%。结论 流式细胞术是一种检测CD3+T细胞内CD69的较好方法，这一方法也为CD3+T细胞内其他分子的检测分析奠定了方法学基础。

CD3+T细胞；CD69分子； PMA+IM；流式细胞术

人体发挥细胞免疫功能的细胞主要是T淋巴细胞和NK细胞。现已证实，T淋巴细胞介导的细胞免疫反应在杀伤肿瘤细胞、控制肿瘤生长中起重要作用[1]。CD3+T是成熟T淋巴细胞的共同分化抗原，CD3+T细胞已在骨髓增生异常综合症(MDS)的研究中被证实为其共刺激分子表达存在异常改变，其表达异常可能在MDS的发病机制中起一定作用[2]；并且，有研究证实MDS患者骨髓CD3+T细胞中TET2 mRNA表达减低，DLK1 mRNA表达增高，提示CD3+T细胞有“质”的异常，这可能是导致机体免疫监视功能下降的机制之一[3]。在重型再生障碍性贫血(SAA)患者CD3+T细胞存在端粒长度及相关蛋白基因表达异常，且与病情相关[4]。目前有关检测T淋巴细胞分泌细胞因子的方法，基本上是检测T淋巴细胞分泌到细胞外的细胞因子[5-7]，虽然这样做也能反映出T淋巴细胞分泌细胞因子的基本情况，但不够精确。CD69分子是淋巴细胞活化最早表达的膜表面分子，通常作为T细胞活化标志用于许多研究中[8]。为CD3+T细胞内分子的检测分析以及CD69分子表达在血液学的基础研究及临床应用中奠定一个方法学基础，笔者用流式细胞仪，通过特异性染色技术，对单个CD3+T细胞表面及细胞内CD69分子进行了检测，报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要仪器 美国Beckman-counter公司流式细胞仪(Coulter EPICSR XL-MCL)；美国Harris hw0301T-VBA CO2孵箱；梧光WJ12-50 XSB-14倒置显微镜；日本Olympus BH光学显微镜；Falcon公司细胞培养板。

1.1.2主要试剂 RPMI 1640细胞培养液[9]；美国Sigma公司生产的佛波醇酯(PMA，产品编号：P1585)；杭州四季青生物公司生产的新生牛血清(NBS)；中国医学科学院血液学研究所生产的淋巴细胞分离液(批号：20000408)；美国Sigma公司生产的离子霉素(IM，产品编号：I0643)；美国Sigma公司生产的多聚甲醛(PFA，产品编号：M122)；美国Sigma公司生产的皂角素(Saponin，产品编号：S4521)；美国Sigma公司生产的蛋白转运抑制剂(Brefeldin A，BFA，产品编号：B7651)；美国Ancell公司生产的anti-CD3PE(产品编号：9734008)；美国Ancell公司生产的anti-CD69FITC(产品编号：819010)。

1.2方法

1.2.1准备细胞悬液 选择健康成人，抽取外周静脉血，用肝素抗凝，然后用淋巴细胞分离液分离获取外周血单个核细胞(PBMC)，用RPMI1640培养液将细胞浓度调整为1.5～2×106/ml，备用。

1.2.2细胞分组处理 细胞分三个处理组：①组I：PBMC；②组II：PBMC + PMA(20 ng/ml)+ IM(1 μg/ml)；③组III：PBMC + PMA(20 ng/ml)+ IM(1μg/ml)+ BFA(10μg/ml)。将1.5～2×106/ml细胞悬液，每空1 ml加入24孔培养板中，在37 ℃ 5% CO2条件下培养4 h，然后收集细胞，再用PBS-5% FCS-0.1% NaN3洗涤，用RPMI1640培养液将细胞重悬浓度成1.5～2×106/ml，备用。

1.2.3CD3+T细胞表面CD69分子检测 用CD3PE/CD69FITC双染色，检测上述组I、组II、组III中CD3+T细胞的CD69表达情况。

1.2.4CD3+T细胞细胞内CD69分子检测 对组I、组II、组III中CD3+T细胞细胞内的CD69进行检测。①细胞表面染色：取9个染色管分别加入组I(3个管)、组II(3个管)、组III(3个管)细胞悬液各100 μl，每管再加入anti-CD3PE，置于4 ℃冰箱30 min,取出后用PBS-5%FCS-0.1%NaN3洗涤细胞,然后用离心机以3000 rpm离心5 min,弃上清；②细胞固定：各管加PBS-2%PFA 400 μl，置于4 ℃冰箱20 min，取出后用PBS-5%FCS-0.1%NaN3洗涤细胞，然后用离心机以3000 rpm离心5 min,弃上清；③细胞穿膜：各管加PBS-0.1%Saponin-10%FCS 400 μl，置于4 ℃冰箱，各组5 min、15 min和25 min各取出1管，分别用离心机以3000 rpm离心5 min,弃上清；④细胞内染色：各管加anti-CD69FITC，置于4 ℃冰箱30 min,取出后用PBS-5%FCS-0.1%NaN3洗涤细胞,然后用离心机以3000 rpm离心5 min,弃上清；再用PBS-5%FCS-0.1%NaN3洗涤细胞,用离心机以3000 rpm离心5 min,弃上清；最后，将细胞重悬于400 μl PBS-0.5%PFA中，用流式细胞仪检测。

1.3流式细胞术检测

选用氩离子激光波长488 nm，以FSC/SSC二维点图设门于淋巴细胞群体，用MinMDI Version 2.8软件分析所得数据。

1.4统计学方法

用SPSS19.0统计软件，不同破膜时间的比较采用方差分析，以P≤0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1破膜条件的选择

用PBS-0.1%Saponin 4 ℃对细胞处理5 min、15 min和25 min的破膜结果见表1，结果显示，5 min时，对细胞破膜力度不足，CD3+T细胞胞内CD69的阳性率仅为66.90%；处理15 min时，细胞形态破坏不大，CD3+T细胞胞内CD69的阳性率为87.91%，破膜效果较好；处理25 min时，细胞形态受到破坏，CD3+T细胞所占比例仅为58.40%，破膜过度。

表1 PBS-0.1%Saponin 4 ℃不同作用时间的破膜结果

注：CD3+T阳性率比较(单因素方差分析)F=29.119,P<0.001，两两比较：*与5 min和15 min比较均有统计学差异(P<0.01)；CD69阳性率比较(单因素方差分析)F=112.805,P<0.001，两两比较：△与15 min和25 min比较均有统计学差异(P<0.01)。

2.2CD3+T细胞表面CD69分子检测 PBMC(组I)中的CD3+T细胞表面表达CD69阳性率为(0.65±0.05)%；PMA和IM刺激4 h后(组II) CD3+T细胞表面CD69表达阳性率为(64.09±1.96)%；加入阻断剂BFA(组III)后，CD3+T细胞表面CD69表达阳性率为(4.60±0.12)%,见图1(A1、B1、C1)。结果表明刺激剂(PMA、IM)和阻断剂(BFA)均是有效的。

2.3CD3+T细胞细胞内CD69分子检测 PBMC(组I)中的CD3+T细胞细胞内表达CD69阳性率为(0.49±0.04)%；PMA和IM刺激4 h后(组II) CD3+T细胞细胞内CD69表达阳性率为(2.81±0.16)%；加入阻断剂BFA(组III)后，CD3+T细胞表面CD69表达阳性率为(87.91±2.30)%,见图1(A2、B2、C2)。此结果表明对细胞内蛋白分子的检测是成功的。

图1 PBMC中CD3+ T细胞表面及细胞内CD69分子检测

PBMC：图A1、A2；PBMC + PMA + IM：图B1、B2；PBMC + PMA + IM + BFA：图C1、C2。图A1、B1、C1：CD3PE/CD69FITC双染，检测CD3+T细胞表面CD69分子；图A2、B2、C2：CD3PE/CD69FITC双染，检测CD3+T细胞细胞内的CD69分子。

3 讨 论

本方法检测细胞内CD69分子的原理，是用BFA抑制细胞分泌CD69分子，让CD69分子滞留在细胞内，通过对CD3+T细胞固定、破膜、打孔等处理，用荧光素标记的抗细胞单抗，实现对细胞内因子的检测。

本实验PBMC(组I)中的CD3+T细胞表面表达CD69阳性率很少，仅为(0.65±0.05)%；当CD3+T细胞在不加蛋白质转运抑制剂、被PMA和IM刺激活化细胞表面CD69分子应高表达，且在刺激6 h达高峰[10-12]。本实验CD3+T细胞被PMA和IM刺激活化4 h后表面CD69表达上升为(64.09±1.96)%，与文献报道相符[10-12]。在加入阻断剂BFA(组III)后，CD3+T细胞表面CD69表达阳性率急剧下降，仅为(4.60±0.12)%。结果表明刺激剂(PMA、IM)和阻断剂(BFA)均是有效的。

对CD3+T细胞细胞内的CD69检测，PBMC(组I)中的CD3+T细胞细胞内表达CD69阳性率极少，仅(0.49±0.04)%，细胞经PMA和IM刺激4 h后(组II)但无阻断剂BFA时，CD3+T细胞细胞内CD69表达阳性率为(2.81±0.16)%,加入阻断剂BFA(组III)后，CD3+T细胞表面CD69表达阳性率为(87.91±2.30)%,可推断破膜打孔有效。实验破膜用PBS-0.1%Saponin，4 ℃处理细胞15 min效果较好。选择用4 ℃实验，操作简单，放4 ℃冰箱即可，便于控制温度，且4 ℃下细胞膜的流动性降低，更易于打孔。

综上所述，CD3+T细胞受PMA和IM刺激并有BFA存在时，可检测到CD3+T细胞87.82%的细胞内CD69表达，获得了较好的结果,这为CD3+T细胞内其他分子的检测分析以及CD69表达在血液学的基础研究及临床应用中奠定了一个方法学基础。

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A method for detecting intracellular CD69 molecules in CD3+T cells

WANGJing1WANGYi-ren2WANGKe-qiang1

(1.Dept.ofClinicalLaboratory,TaianHospitalofTraditonalChineseMedicine，Taian271000,China； 2.MedicalLaboratoryClass,Grade2016，MedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao266000，China)

Objective: To establish a method for detecting intracellular CD69 in human peripheral blood CD3+T cells. Methods： Healthy human PBMC was isolated, PBMC were stimulated by PMA and IM. Protein transport inhibitors (Brefeldin A, BFA) were used to block the secretion of cytokines. Saponin was used to destruct cell membrane. In order to find the best time of membrane destruction, we used flow cytometry to detect the positive rate of CD69 in CD3+T cells. Results： The best time of membrane destruction was 15 minutes. The positive rate of CD69 in CD3+T cells was higher, even up to 87.82%. Conclusion： Flow cytometry is a good method for the detection of intracellular CD69 in CD3+T cells, and flow cytometry also make a methodological foundation for the detection of other cytokines in CD3+T cells.

CD3+T cells;CD69 molecules;PMA+IM；flow cytometry

山东省保健科技协会科学技术课题(2016BJ0012)。

王静(1964—)，女，山东阳谷人，主管技师，主要从事临床检验诊断工作。

王克强，E-mail：wkqsd@163.com。

R446.6

A

1004-7115(2017)12-1337-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.12.006

2017-09-18)