钙粘蛋白E、脑源性神经营养因子在胃癌中的表达及临床意义研究

徐文静 刘焕星 李 磊

(1. 泰山医学院，山东 泰安 271000；2.泰山医学院附属泰山医院，山东 泰安 271000)

钙粘蛋白E、脑源性神经营养因子在胃癌中的表达及临床意义研究

徐文静1刘焕星2李 磊2

(1. 泰山医学院，山东 泰安 271000；2.泰山医学院附属泰山医院，山东 泰安 271000)

目的 研究分析两个因子在胃癌组织、癌旁组织、正常组织中的表达变化，为临床早期诊断胃癌、评价患者预后提供参考。方法 采用免疫组织化学法检测65例胃癌中央组织及癌旁正常组织和40例正常胃粘膜组织上皮中钙粘蛋白E、脑源性神经营养因子的表达，并分析比较两个因子的表达分别与年龄、性别、肿瘤直径、分化水平、淋巴结转移、lauren分型、TNM分期、CEA、CA19-9、CA72-4、Hp的关系及两个因子表达的关系，分析临床意义。结果 ①E-cad在胃癌中央组织组的表达率低于在正常胃粘膜组织上皮组和癌旁正常组织组的表达率，BDNF在胃癌中央组织组的表达率高于正常胃粘膜组织上皮组和癌旁正常组织组表达率。②E-cad的表达与淋巴结转移、分化水平及TNM分期有关，与直径、年龄和性别无关。BDNF表达与肿瘤直径、淋巴结转移、癌分化水平及TNM分期有关，与年龄和性别无关。③E-cad、BDNF与Lauren分型有关。④E-cad、BDNF的表达与CA19-9、CA72-4、CEA无关。⑤E-cad、BDNF的表达与Hp感染有关。⑥E-cad与BDNF的表达无关，可作为独立的影响胃癌因子。结论 ①钙粘蛋白E、脑源性神经营养因子的表达与胃癌发生发展有关。②钙粘蛋白E、脑源性神经营养因子存在潜在机制/通路拮抗另一因子，影响胃癌转移、浸润过程。

胃癌；E-cad；脑源性神经钙黏蛋白E/营养因子/BDNF；免疫组织化学

胃癌是世界上位居第四位的常见恶性肿瘤，是临床上仅次于肺癌、位于第二位的常见癌症相关死亡原因[1]。影响患者预后及生存率的最主要原因为转移复发和早期诊断。转移是多步骤的过程。钙粘蛋白E(E-cadherin E-cad)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor BDNF)被证明参与肿瘤生长转移过程。本实验选取外科手术胃恶性肿瘤组织病理标本和内镜下正常胃粘膜组织病理标本，通过免疫组化方法检测分析BDNF、E-cad在胃癌中央组织组、正组常胃粘膜上皮组织组、癌旁正常组织组的表达变化，分析对比两个因子与临床病理因素、Hp感染、lauren分型、胃癌相关生物标志物及两个因子相互的关系，对胃癌的早期诊断、治疗、评价和提高胃癌患者预后生存率有着重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1标本收集

选取2015年1月—12月山东省泰安市中心医院病理科65例患者胃癌组织及相应癌旁组织(距肿瘤部位4 cm以上)石蜡标本块，男性患者33例，女性患者32例，平均年龄(48±16)岁，33例≥60岁的老年患者，32例<60岁的中青年患者，按分化程度将胃癌分为高-中-低分化，中低分化癌者40例，高分化癌者25例。按美国癌症联合委员会(AJCC)和国际抗癌协会(UICC，第8版)分期，I-II期23例，III-IV期42例。无淋巴结转移患者12例，有淋巴结转移患者53例。以上所有患者标本均有病理学、影像学CT支持诊断及完整的病人信息。所有手术切除的胃癌患者术前均未接受任何抗肿瘤治疗。所有标本均经10%甲醛固定后按常规方法进行石蜡包埋，所有患者均与医院签订《医学伦理学知情同意书》。

1.2实验方法与步骤

采用免疫组化S-P法，对比E-cad、BDNF和PBS缓冲液两组在胃癌中的表达情况：石蜡切片(4 μm 厚)烘烤，脱蜡水化，修复；经内源性过氧化物酶封锁液、正常封锁液用山羊血清工作液、兔抗人E-cad/BDNF多克隆抗体(阴性对照用PBS缓冲液代替一抗)、生物素标记的羊抗兔的二抗工作液、辣根过氧化物酶HRP标记的链霉菌素亲和素工作液、DAB工作液后，苏木素染色液复染细胞核，脱蜡水化，中性树胶封片，高倍镜下阅片，采集图片。

1.3结果判定

E-cad、BDNF阳性表达均以细胞膜/细胞质出现棕黄色颗粒染色为准，细胞核出现棕黄色颗粒视为无效染色(异位染色)。E-cad判断标准: a染色强度:分四级:0分:无染色,1分:少量染色,2分:适度淡黄色, 3分:棕黄褐色。b按阳性细胞的百分比分为五组:0分:<5%,1分:5%～25%,2分:26%～50%, 3分:51%～75%,4分:>75%, 将a×b的乘积作为染色计数。总分<3为阴性,3～6分为阳性染色,>6分为强阳性染色[2]。BDNF判断标准: a染色强度:分四级:0分:无染色,1分:淡黄色,2分:适度淡黄色,3分: 棕黄褐色。b按阳性细胞所占百分比分为四组:0分:<5%,1分:5%～25%,2分:26%～50%,3分:51%～75%,4分:>75%;(3)染色方式评分:0分,无染色阳性细胞;1分,散在染色阳性细胞;2分,局灶染色阳性细胞;3分,弥漫染色阳性细胞。以上三个和为阳性程度,阴性为0～3分,阳性为4～10分[3]。

1.4统计学方法

应用SPSS20.0统计软件分析处理数据。计数资料选用频数及百分比率(%)表示，组间对照选用χ2检验，阳性率的两两比较结果，使用Scheffe法。配对计数资料采用McNemar检验，结果均以P≤0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1E-cad、BDNF在正常胃黏膜组织上皮组、胃癌中央组织组及癌旁正常组织组的表达

免疫组化发现E-cad在胃癌中央组织组、癌旁正常组织组、正常胃黏膜组织上皮组表达率依次为：10.8%、78.5%、82.5%，BDNF在胃癌中央组织组、癌旁正常组织组、正常胃黏膜组织上皮组表达率依次为：84.6%、20%、22.5%，表达差异有统计学意义。见附图1～6和表1。

图1 正常胃腺体组织的E-cad强阳性表达200×：E-cad在正常胃黏膜上皮细胞中可见计分为8分的细胞浆或细胞膜大片强阳性黄褐色表达，细胞核蓝染颜色较深，有与之重叠的不连续、点状的异位表达的无效染色。

图2 癌旁腺体组织E-cad的阳性表达200×：E-cad在癌旁组织中可见比正常胃黏膜上皮组染色强度稍弱的计分为5分的细胞浆或细胞膜表达染色，蓝染的细胞核颜色较深，有与之重叠的不连续、点状的异位表达的无效染色。

图3胃癌组织E-cad的少量表达200×：E-cad在胃癌组织中有计分为2分的少量表达，呈阴性，可见细胞核增多，排列成团状，部分形态不规则，部分不清，蓝染不均，核膜有凹陷，有与之重叠的不连续、点状的异位表达的无效染色。

图4 正常胃腺体组织BDNF的阴性表达200×：BDNF在正常胃黏膜组织上皮组细胞浆或细胞膜中表达呈阴性，部分计分为1分的少量染色或0分的不着色，细胞核蓝染颜色较深，排列规则，有与之重叠的不连续、点状的异位表达的无效染色。

图5 癌旁腺体组织BDNF的阴性表达200×：BDNF在癌旁正常组织组中细胞浆或细胞膜表达呈阴性，部分计分为2分的少量染色或0分的不着色，细胞核蓝染颜色较深，排列规则，有与之重叠的不连续、点状的异位表达的无效染色。

图6 胃癌组织BDNF的阳性表达200×：BDNF在胃癌组织中可见计分为10分的细胞浆或细胞膜大片黄褐色阳性表达染色，可见细胞核增多，排列成团状，部分形态不规则，部分不清，蓝染不均，核膜有凹陷，有与之重叠的不连续、点状的异位表达的无效染色。

表1 E-cad、BDNF在正常胃黏膜上皮组织组、癌旁正常组织组、胃癌中央组织组中的表达

2.2E-cad、BDNF的表达分别与临床病理参数的关系

按T(浸润侵犯器官)N(淋巴结转移)M(远处转移)分期将胃癌划分为I、II、III、IV期，E-cad的表达与淋巴结转移、癌分化水平及TNM分期有关，差异有统计学意义，而与直径大小(cm)、年龄、性别无关，差异无统计学意义。而BDNF的表达与直径大小(cm)、淋巴结转移、癌分化水平、TNM分期有关，差异有统计学意义，与年龄、性别无关，差异无统计学意义。见表2。

2.3E-cad、BDNF的表达与65例胃癌患者Lauren分型的关系

依照胃癌组织Lauren分型将其分为：肠型、弥漫型。E-cad表达在IGC、DGC、混合型患者中，E-cad表达阳性者依次占胃癌组织中E-cad所有阳性表达患者的85.7%、14.2%、0%，表达差异有统计学意义。BDNF在胃癌Lauren分型的表达：在IGC、DGC、混合型患者中，BDNF表达阳性者依次占胃癌组织中BDNF所有阳性表达患者的38.2%、38.2%、23.6%，表达差异有统计学意义。见表3。

2.4E-cad、BDNF与胃癌相关免疫学标志物CEA、CA19-9、CA72-4的关系

在65例胃癌患者中，E-cad阳性表达患者共有7例，伴有CEA、CA19-9、CA72-4升高者依次占所有E-cad阳性表达患者的28.6%、42.9%、42.9%，E-cad与差异无统计学意义(P>0.05)。BDNF阳性表达患者的55例，伴有CEA、CA19-9、CA72-4上升者依次占所有BDNF阳性表达患者的60%、65.5%、63.6%，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4～6。

2.5E-cad、BDNF在65例确诊胃癌患者中的表达与Hp感染的关系

分析E-cad阳性表达患者与65例胃癌患者Hp感染的关系，在7例E-cad阳性表达患者中，伴有Hp感染者5例，占所有E-cad阳性表达患者的71.4%，差异有统计学意义。在55例BDNF阳性表达患者中，伴有Hp感染者占53例，占所有BDNF表达患者的96.4%，差异有统计学意义。见表7。

2.6E-cad在65例确诊胃癌患者的表达与BDNF在65例确诊胃癌患者表达的关系

在65例确诊为胃癌患者中，7例E-cad表达阳性者中，BDNF有1例不表达，在E-cad表达阴性的58例患者中，BDNF有9例不表达，统计分析两个因子表达的关联性得知：χ2=0.220，P=0.639。由于P>0.05，因此两个因子表达无关联性。两者可作为独立影响胃癌的因子。见表8。

表2 E-cad、BDNF的表达与65例确诊为胃癌患者的临床病理特征关系

表3 E-cad、 BDNF的表达与65例胃癌组织学Lauren分型的关系

表4 E-cad、BDNF的表达与胃癌标志物癌胚抗原CEA的关系

表5 E-cad、BDNF的表达与胃癌标志物糖类抗原CA19-9的关系

表6 E-cad、BDNF的表达与胃癌标志物糖类抗原CA72-4的关系

表8 E-cad在65例确诊为胃癌患者的表达与BDNF在65例确诊为胃癌患者的表达的关系

3 讨 论

E-cad是一种多功能钙依赖型上皮黏附蛋白，参与影响上皮细胞与细胞基质的黏附、稳定膜细胞骨架和细胞极性调控。在本实验中，由表1和图1-3看出，E-cad在40例正常胃粘膜组织上皮组中有33例强阳性表达，在65例癌旁正常组织组及胃癌中央组织组有51例、7例阳性表达，说明了E-cad表达减弱与胃癌发生发展相关。由表2看出，65例胃癌患者组织中，E-cad的表达与淋巴结转移、分化水平、TNM分期有关，与直径、年龄、性别无关，随胃癌分化水平越低、浸润邻近器官深度的加深，E-cad的表达率是逐渐降低的，进一步证实了E-cad表达减弱或缺失使肿瘤细胞更易发生浸润。我们还得知，同一患者E-cad表达也存有差异，由此猜测E-cad表达差异性可能与胃癌组织学表型形成机制方面可能相关。另外，研究还发现，在有的胃癌原发灶E-cad表达意外的下调，如表1中，E-cad在正常胃粘膜上皮组和癌旁组织组中有7例、14例阴性表达，在胃癌中央组织组中有7例阳性表达，表2中，有淋巴结转移灶和中低分化胃癌中阳性表达有2例、1例阳性表达，此现象可能与E-cad的不稳定性表达、试剂不同、染色方法、切片技术、试验样本、基因、遗传等多方面因素有关，亦有可能与病人体内有潜在分子调控E-cad的表达有关。Bremnes RM等[4]研究用组织微列阵方法证实了E-cad表达缺失与分化水平、局部侵犯、远处转移、预后生存率密切相关，且认为E-cad可以作为今后临床上判断患者预后生存率的独立标志物。

进展期胃癌的按组织学lauren分型分为：肠型(IGC)、弥漫型(DGC)，在我们试验中，表3示：E-cad的表达与IGC、DGC有关，这与大多数研究相一致。Huggett J F等[5]人研究还认为，IGC、DGC的发生发展常常伴着E-cad的原癌基因和抑癌基因调控，如作为编码E-cad抑癌基因CDH1，在IGC前病变中，随着与之相应的标准蛋白CDH1基因转录减少及其对应的另一种亚型非规范转录(Cdh1a)存在时，Cdh1a过度表达，其功能变强大，作用于胃癌基因的其他机制，促进胃癌血管生成，使胃癌发生侵袭和浸润，而作为复杂机制的内含子2cdh1a、顺式调控元件、周围的外显子1A调节序列，任何功能障碍都可以使这些因素改变，导致CDH1基因转录的不平衡、失调，将隐约助于胃癌的发生发展[6-8]。此外，E-cad不同的替代调节机制变化可以巧妙地干扰信号调节，促进IGC的发展[9]。

目前常用筛选胃癌化验指标免疫学标志物有：CEA、CA19-9、CA72-4，由表4看出，E-cad的表达与CEA、CA19-9、CA72-4无关。由表5看出，E-cad的表达与Hp感染有关。通过查阅的文献猜测：幽门螺杆菌可以通过自身分泌的蛋白酶HtrA和隐藏的基因调节机制共同作用，使胃癌细胞获得裂解其胞外结构域能力，促进胃癌细胞从胞外域脱落，而那些隐藏的基因调节替代机制又可以调节E-cad基因，降低E-cad表达，促使胃癌细胞黏附到新的细胞上，因此，E-cad和Hp共同参与胃癌的发生、发展与转移[10-11]。

BDNF属神经营养因子家族成员之一，通过与TrkB受体结合发挥生物学作用。近几年新研究发现，BDNF的表达与原发性肝癌、胃癌、涎腺腺样囊性癌等肿瘤嘻嘻相关[13-15]。有实验证明BDNF在胃癌癌前病变呈过度表达状态时更易出现转移，预示着患者生存率更低，预后更差，因此，BDNF可以作为今后评价胃癌的预后标志物[15]。BDNF/TrkB通路可以激活与凋亡密切相关的通路PI3K/PKB，其发出信号可以介导肿瘤细胞抗失巢凋亡，促进肿瘤细胞生存。有学说认为，BDNF/TrkB赋予癌细胞失巢凋亡能力后，可再通过联合蛋白，确定癌细胞，刺激组织蛋白酶，导致亲酶激活，调节细胞外基质成分，选择性降解蛋白，启动蛋白级联扩大信号反应，在信号传递过程中，进一步激活癌细胞利用纤维蛋白溶酶和其他酶，使癌细胞分解基底膜，顺利穿越和突破血液循环系统或淋巴系统，种植到另一器官上[15]。还证明阻断BDNF/TrkB通路有望成为一种有效的抗肿瘤治疗手段[15]。这些试验都反复证明了BDNF/TrkB通路可直接参与胃癌侵袭和转移过程。在本实验中，由表1和图4～6看出，BDNF在正常胃粘膜组织上皮组中、癌旁组织组、胃癌中央组织组表达差异有统计学意义。由表2发现，BDNF 的表达与分化水平、淋巴结转移、直径、TNM分期相关。和其他研究不同的是，本实验还证明BDNF的表达与直径有关，推测可能由于不稳定性表达、试剂不同、染色方法、切片技术、试验样本、基因、遗传等多方面所致。由表4发现，BDNF的表达与CEA、CA19-9、CA72-4无关，而由表3和表5看出，BDNF的表达与Hp感染、Lauren分型有关，由表6证明，两个因子是独立影响胃癌的因子，猜测在转移过程中，两个因子可能与存在潜在机制/通路拮抗另一因子。

由于很多研究并未涉及BDNF的表达与胃癌 Lauren分型、CEA、CA19-9、CA72-4、Hp感染及两个因子表达的关系，具体确切调节机制不明，那么，研究BDNF/TrkB通路下游因子和与E-cad的关系、潜在调控基因的具体机制成为我们下一步的研究任务，为胃癌的诊断、治疗、评价和提高患者预后提供依据。

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Expression of cadherin E and brain - derived neurotrophic factor in gastric carcinoma and its clinical significance

XUWen-jing1LIUHuan-xing2LIlei2

(1.Taishan Medical University，Taian 271000，China；2.Taian City Central Hospital，Taian 271000，China)

Objective: To study and analyze the expression changes of two factors in the gastric cancer tissue and the adjacent tissues and normal tissue for clinical early diagnosis of gastric cancer, improve and evaluate the patients to provide the reference. Method:Immunohistoche-mical method was used to detect the expression of cadherin E and brain-derived neurotrophic factor in gastric epithelium in 65 cases of gastric cancer central tissue, 65 cases of normal tissues and 40 cases of normal gastric mucosa. Additionally, the relationship between the expression of two factors and clinical clinicopathological factors: the age, sex, tumor diameter, gastric cancer differenttiation, lymph node metastasis, Lauren classification, TNM staging, CEA, CA19-9, CA 72-4, Helicobacter pylori infection were compared by the statistical analysis, analysis of them clinical significance.Results：①The expression rate of cadherin E in gastric cancer central tissue group was lower than that in normal gastric mucosa epithelium group and adjacent normal tissue group. And the expression rate of brain-derived neurotrophic factor in gastric cancer central tissue group was statistically significant higher than that in normal stomach mucosa tissue epithelium and adjacent normal tissue.②The relationship between the expression of cadherin E and lymph node metastasis, gastric cancer differentiation and TNM staging, the difference was statistically significant, while The difference was not statistically significant with tumor diameter size, patient age and gender. The expression of brain-derived neurotrophic factor were significantly correlated with tumor diameter, lymph node metastasis, gastric cancer differentiation and TNM staging, the difference was statistically significant , however the difference was not statistically significant with age and gender.③The difference was statistically significant between cadherin E, brain-derived neuro-trophic factor expression and gastric cancer histological lauren type.④The expression of cadherin E and brain-derived neurotrophic factor was not associated with gastric cancer-related immunological markers CA19-9,CA72-4andCEA,and the difference was not statistically significant.⑤The difference was statistically significant between cadherin E, brain-derived neuro-trophic factor expression and Helicobacter pylori infection.⑥E-cad and BDNF expression has nothing to do with each other, so they can be used as an independent effect of gastric cancer factor.Conclusions：①The expression of cadherin E and brain-derived neurotrophic factor was related to the development of gastric cancer.②The expression of cadherin E and brain-derived neurotrophic factor are potential mechanis-ms/pathway for them to antagonism another factor, to affect gastric cancer transfer, infiltration process.

gastric cancer/GC;cadherin E/E-cad;brain-derived neurotrophic factor/BDNF;immunohistochemistry

徐文静(1990—)， 泰山医学院在读硕士，老年医学。

刘焕星，主任医师， liuhuanxing8266@126.com。

R735.2

A

1004-7115(2017)12-1352-06

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.12.011

2017-07-26)