重组聚半乳糖醛酸酶PGB的生化特征及其酶解产物活性分析

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(1.天津科技大学化工与材料学院生物化工系,天津 300457;2.天津科技大学生物工程学院与工业发酵微生物教育部重点实验室,天津 300457)

重组聚半乳糖醛酸酶PGB的生化特征及其酶解产物活性分析

谌新然1,黄永生2,田康明1,2,*,金鹏1,董自星1,刘晓光1,路福平2,王正祥1,2

(1.天津科技大学化工与材料学院生物化工系,天津 300457;2.天津科技大学生物工程学院与工业发酵微生物教育部重点实验室,天津 300457)

解析重组聚半乳糖醛酸酶PGB的酶学性质,研究PGB制备的果胶水解物的基本成分和生物学活性。通过摇瓶发酵制备聚半乳糖醛酸酶酶液,研究其基本酶学性质。再在最优作用条件下对果胶进行水解,并考察水解产物的组成、抗菌活性和抗氧化活性。在摇瓶发酵水平,黑曲霉聚半乳糖醛酸酶PGB的酶活达到10790 U/mL;该酶的最适作用温度和pH分别为55 ℃和5.0;在40 ℃或pH4.0～6.0条件下具有较好稳定性。Mg2+和Cu2+对其活性有促进作用,K+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Fe3+和Fe2+等对其活性均有不同程度的抑制作用;它对低酯果胶的Km和Vmax分别是0.756 mg/mL和9.225 mg/(mL·min)。高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)的分析表明,PGB对果胶的酶解产物是半乳糖醛酸单体和聚合度2～4为主的寡聚半乳糖醛酸,它对金黄色葡萄球菌的生长有显著抑制作用,其最小抑菌浓度和抗氧化活性分别为0.64 mg/mL和6.125 U/mL。

聚半乳糖醛酸酶,生化特征,果胶,寡聚半乳糖醛酸

果胶是植物细胞壁基质多糖的主要组成成分,其主链是由同型半乳糖醛酸(Homogalacturonan,HG)和鼠李糖半乳糖醛酸(Rhamnogalacturonan,RG)[1]组成,其中RGI上连接着阿拉伯糖、半乳糖和阿拉伯半乳糖等中性糖链[1-2]。果胶不完全降解产生的不同聚合度的半乳糖醛酸,称为寡聚半乳糖醛酸,是第一个被发现的功能性多糖[3]。寡聚半乳糖醛酸是一类酸性寡糖,由2～20个α-1,4-D-吡喃半乳糖醛酸组成[4],部分半乳糖醛酸以甲酯化形式存在。寡聚半乳糖醛酸可作为植物抗病防病的诱导剂[5],食品添加剂中的抗氧化剂[6]及抑菌剂[7],并有可能作为化妆品中的有抑菌活性和抗氧化活性的添加剂。

寡聚半乳糖醛酸是通过水解(降解)果胶大分子为低聚或寡聚分子而得,常见的制备方法包括热处理[8]、酸水解方法[9]及酶法水解[10]。当利用热处理法降解果胶时,果胶的降解效果与其甲酯化程度呈负相关,水解效果不明显。果胶在强酸性溶液中是不稳定的,会发生长链的部分水解,即糖苷键的断裂,形成许多分子量大小不等的片段,高度水解则大部分变成单体(糖)。与前两种方法相比较,酶法水解有处理方式简单、高效且产物组分明确可控等优势,其作用过程是随机水解果胶结构内部的(1→4)-α-D-半乳糖醛酸键。可以依据不同酶的运用以及通过控制酶解条件,生产出不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸[11]。可见,酶法制备寡聚半乳糖醛酸是主要的发展方向,相关酶制剂的获得则是本制备方法成功实施的关键所在。

目前,商品化的果胶酶酶制剂绝大多数是复合型果胶酶,无法直接用其对特定的果胶底物进行水解制备寡聚物。在前期工作中,本课题组对黑曲霉果胶水解酶系进行了系统研究与筛查,其中聚半乳糖醛酸酶PGB为未公开报导的新酶,对果胶分子具有较好内切水解活性。本研究进一步对其酶学特征进行了系统分析,探讨应用此酶水解果胶制备寡聚半乳糖醛酸的可能性,并检验其生理学功能。对果胶的深度生物加工、衍生新产品的开发及其在食品、保健品和化妆品中的应用具有重要参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种:毕赤酵母GS115、重组毕赤酵母GS115-PGB(表达黑曲霉聚半乳糖醛酸酶PGB,课题组前期构建,未发表数据)以及金黄色葡萄球菌 均保藏于天津科技大学生物催化与生物转化研究室；毕赤酵母培养基有YPD、BMGY、BMMY 均参照Invitrogen的毕赤酵母操作手册进行配制,其培养温度为30 ℃；金黄色葡萄球菌 采用LB培养基进行培养；胰蛋白胨(Tryptone)和酵母提取物(Yeast Extract) 英国OXOID公司产品;低酯果胶(酯化度30%～40%) 购自江苏锐阳生物科技有限公司;寡聚半乳糖醛酸 由Sigma公司提供；其它试剂 均为国产分析纯。

回旋式恒温调速摇床 上海欣蕊自动化设备有限公司;HG75-3电热恒温培养箱 南京实验仪器厂;GL20A型冷冻离心机 梅田科学仪器有限公司;SP-2012UV型分光光光度计 上海光谱仪器有限公司;HW SY21-K电热恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司;Infinite M200 PRO型多功能酶标仪 天津志卓生物科技有限公司;ICS5000多功能离子色谱仪 美国戴安公司。

1.2 实验方法

1.2.1 重组酶的制备 按照毕赤酵母表达操作手册(Invotrogen),将甘油管中保藏的重组菌GS115-PGB接种于YPD平板,三区划线后于30 ℃培养箱中培养72 h,挑取单菌落转接于25 mL YPD液体培养基中,于30 ℃、200 r/min培养16～18 h。待菌体OD600达2.0～6.0,移取250～500 μL于25 mL BMGY液体培养基中,于30 ℃、200 r/min培养16～18 h,4 ℃、8000 r/min离心5 min收集菌体,将菌体用BMMY培养基稀释至OD600=1.0,于30 ℃、200 r/min继续培养。每隔24 h补加0.5%(v/v)的甲醇进行诱导,并取样进行酶活测定。发酵结束后,离心收集发酵上清液,即为粗酶液,-20 ℃保存,备用。采用盐析(30%～80%硫酸铵)[12]和透析对重组酶PGB进行初步纯化,得到纯化后的PGB酶液。

1.2.2 重组酶的酶活测定 PGB酶活的测定按照文献介绍的方法进行[13],其一般步骤是:取经过适当稀释的200 μL粗酶液,加入1.8 mL 1%(w/v)低酯果胶(溶于0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L柠檬酸缓冲液,pH3.5),50 ℃下反应30 min。再加入1 mL去离子水和2.5 mL DNS溶液置于沸水中煮沸5 min显色,冷却并定容到12.5 mL后,于540 nm测定吸光度。以加热灭活的PGB发酵液为对照。在50 ℃、pH3.5条件下,每小时酶解果胶生成1 mg半乳糖醛酸定义为一个酶活单位,用U/mL表示。其中,DNS试剂的配制方法如下:称取酒石酸钾钠18.2 g,溶于50 mL蒸馏水中,加热,于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸0.63 g,NaOH 2.1 g,苯酚0.5 g,搅拌至溶解,冷却后用蒸馏水定容至100 mL,贮于棕色瓶中,室温保存。

1.2.3 重组酶的酶学性质分析

1.2.3.1 重组酶的最适作用温度和pH分析 固定反应体系的pH为3.5,在30～80 ℃下进行反应,然后按照1.2.2的方法进行酶活测定,确定重组酶PGB的最适反应温度。在50 ℃下,分别在pH2.0～7.0的0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中进行反应,然后进行酶活测定,以酶活最高者为100%计算相对酶活力，确定PGB的最适反应pH。

1.2.3.2 重组酶的热稳定性和pH稳定性分析 将重组酶PGB在40～80 ℃条件下保温2 h,每隔30 min取样并终止反应,测定酶活,以未进行热处理的酶液酶活力为100%,计算相对酶活,确定聚半乳糖醛酸酶的热稳定性。pH稳定性实验在pH2.0～8.0的0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中于最适作用温度下保温1 h后,测定酶活,以酶活最高者为100%计算残余酶活力,确定聚半乳糖醛酸酶的pH稳定性。

1.2.3.3 金属离子对重组酶酶活的影响 在聚半乳糖醛酸酶与其底物进行反应体系中,加入不同的金属离子,并使其最终浓度为1 mmol/L和5 mmol/L,以不加金属离子的反应体系的酶活为100%表示不同金属离子或化合试剂下的相对酶活性。

1.2.3.4 聚半乳糖醛酸酶动力学常数的测定 以不同浓度(4～10 mg/mL)的低酯果胶为底物,在50 ℃、0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L柠檬酸的缓冲液(pH3.5)中测定酶活力。按双倒数作图法(Lineweaver-Burk法)计算出其Km和Vmax。

1.2.4 酶解产物分析 在PGB的最适作用条件(55 ℃、pH5.0)下,根据酶活力计算酶液添加量,加入5 U/mL PGB作用于10 mg/mL低酯果胶,果胶被水解生成聚合度较小的寡聚物,并利用HPAEC-PAD对水解产物进行分析。HPAEC-PAD法:参照文献方法进行[14]。采用CarboPac PA200分析柱(3 mm×250 mm),柱温:30 ℃,淋洗液:(A)超纯水;(B)200 mmol/L NaOH(50%);(C)1 mol/L醋酸钠(20%～50%),流速为0.5 mL/min,脉冲安培检测器(PAD),进样量为1 mL。取果胶水解产物及寡聚半乳糖醛酸(1 mg/mL)进行检测分析。

1.2.5 抑菌实验及最小抑菌浓度测定 抑菌实验按照文献方法进行[15]。挑取金黄色葡萄球菌的单菌落接种于50 mL LB液体培养基中培养至OD600约1.5,吸取500 μL培养液加入到融化的LB固体培养基中,混匀倒平板,待平板凝固后于平板上等距离打孔,加入果胶酶解液。37 ℃培养过夜,观察菌落生长情况。以加入灭活PGB的果胶溶液为对照。

采用微量肉汤稀释法[16]测定最小抑菌浓度。首先,将果胶酶解液进行倍比稀释,吸取稀释后的溶液100 μL加入96孔板,并加入1.0×106CFU/mL的金黄色葡萄球菌菌液100 μL吹吸混匀。然后,于37 ℃培养箱过夜培养,采用多功能酶标仪测定菌体OD600,并以在96孔板的小孔内抑制细菌生长的最低果胶水解物浓度为最小抑菌浓度。以加入灭活PGB的果胶溶液为对照。

1.2.6 总抗氧化活性分析 采用Fe3+还原法对果胶水解产物的总抗氧化活性进行分析[17]。在37 ℃时,每分钟每毫升提取液使反应体系的吸光值增加0.01为1个总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)单位(U/mL)。

1.3 数据处理

相关实验均设置三个平行实验,数据分析及图的绘制借助Origin 8.0软件处理完成。采用软件SAS 9.4进行方差分析(AVONA)。

2 结果与讨论

2.1 聚半乳糖醛酸酶PGB的酶学性质

2.1.1 最适反应温度和pH 对酶活达到10790 U/mL的重组酶PGB进行研究，研究不同温度或pH对重组酶PGB酶活的影响,结果见图1。PGB的最适作用温度为55 ℃,最适作用pH为5.0;在40～65 ℃之间或pH4.0～5.5之间有较好的酶活力,相对酶活力在80%以上。

图1 聚半乳糖醛酸酶PGB最适作用温度(a)和pH(b)Fig.1 The optimal temperature(a)and pH(b)of PGB

图2 温度(a)和pH(b)对聚半乳糖醛酸酶PGB稳定性的影响Fig.2 Effects of temperature(a) and pH(b)on the stability of PGB

2.1.2 温度和pH稳定性 分别将重组酶PGB在不同温度或pH条件下维持一定时间后,测定残余酶活,研究其对酶的稳定性的影响,结果见图2。由图2可知,PGB在40、50和60 ℃下保温2 h,其相对酶活力分别保存72.7%、53.8%、43.7%;在70 ℃、80 ℃条件下孵育2 h后,残留酶活分别为40%和20%左右;在pH4.0～5.5下处理1 h后酶活仍能保持80%以上,在pH小于2.5或大于7.0条件下处理1 h后酶活力降到40%以下。

2.1.3 金属离子对重组酶PGB活性的影响 在酶促反应中加入不同的金属离子(终浓度为1 mmol/L和5 mmol/L),研究其对PGB酶活性的影响,结果见图3。Cu2+和Mg2+对其活性有不同程度的促进作用,其中5 mmol/L Cu2+的促进作用高于1 mmol/L,而1 mmol/L Mg2+的促进作用比5 mmol/L强,这可能是因为高浓度的Mg2+又会导致蛋白的变性而使酶活性丧失。1 mmol/L和5 mmol/L的K+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Fe3+和Fe2+等对其的活性均有不同程度的抑制作用。

图3 金属离子对聚半乳糖醛酸酶酶PGB活性的影响Fig.3 Effects of metal ions on the enzymatic activity of PGB

2.1.4 酶促动力学参数 固定PGB的添加量(5 U/mL),以不同浓度(4、6、8和10 mg/mL)低酯果胶溶液为底物,测定酶反应速度。采用双倒数作图法,绘制PGB水解果胶的动力学曲线,结果如图4所示。经过计算,求得PGB的Km值为0.756 mg/mL,Vmax为9.225 mg/(mL·min)。

图4 双倒数曲线确定PGB的动力学参数Fig.4 Determination of kinetic parameters of PGB by Lineweaver-Burk plot

2.2 果胶酶解物的组成分析

在55 ℃、pH5.0条件下,加入5 U/mL PGB作用于10 mg/mL低酯果胶,果胶被水解生成聚合度较小的寡聚物,并利用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)对水解产物进行分析。结果表明,经PGB作用后的果胶水解物是一定量的半乳糖醛酸单体和聚合度2～4为主的寡聚半乳糖醛酸(图5)。经计算,水解产物中各组分含量比为(GalA)1∶(GalA)2∶(GalA)3∶(GalA)4=30∶38∶24∶3.5。与Parenicová L[18]报道的PgaB的酶解相比,本文中酶解的底物是果胶,组成较之使用的聚半乳糖醛酸复杂,且水解产物中半乳糖醛酸聚合度1～3的含量较之有大幅度提高。据报道,当寡聚半乳糖醛酸的聚合度为3或更小时,其抑制有害菌生长、调整肠道菌群平衡等功能会显著增强[19]。

图5 HPAEC-PAD分析果胶酶解液的组成Fig.5 Analysis of pectin hydrolyzate composition by HPAEC-PAD注:Ⅰ:寡聚半乳糖醛酸标品;Ⅱ:果胶水解产物。每个峰上方的数字代表半乳糖醛酸的聚合度。

2.3 寡聚半乳糖醛酸的生物学活性

抑菌作用分析:经PGB水解的果胶水解液的抑菌效果如图6a所示。重组酶PGB水解果胶的产物对金黄色葡萄球菌抑菌效果明显,抑菌圈直径为12 mm。果胶水解液经过倍比稀释的抑菌效果见图6b,确定经过12次倍比稀释后的果胶酶解液浓度为最低抑菌浓度(MIC),经计算为0.64 mg/L。本研究获得的果胶水解物对金黄色葡萄球菌的抑菌直径大于李大峰等[20]获得的果胶水解液对该菌的抑菌直径(8.0～9.7 mm);MIC也小于其研究结果(3.75～7.5 g/L)。

图6 寡聚半乳糖醛酸的抑菌活性Fig.6 Antimicrobial activity of oligogalacturonic acid注:a图为寡聚半乳糖醛酸对金黄色葡萄球菌生长抑制图,A:灭活PGB作用的果胶溶液,B:果胶水解产物。b图为对果胶酶解液的倍比稀释次数对应的菌体生长情况。

抗氧化活性分析:采用Fe3+还原法对果胶酶解液的总抗氧化活性进行测定。不同浓度的果胶酶解液抗氧化能力测定结果见图7。最适条件下果胶酶作用得到的酶解液有一定的抗氧化能力,且抗氧化能力随浓度的增大而增大。在果胶酶解液浓度为0.25 mg/mL时,其总抗氧化活性(T-AOC)达到最大,为6.125 U/mL。该果胶水解液抗氧化活性显著,可用于具有增强机体抗氧化活性、延缓衰老的功能性食品、保健品、化妆品的开发。

图7 寡聚半乳糖醛酸的总抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity (T-AOC)of oligogalacturonic acid

3 结论

寡聚半乳糖醛酸有良好的生物学活性,但其复杂的制备工艺限制了其应用。本研究初步解析了黑曲霉聚半乳糖醛酸酶PGB的基本酶学性质,包括最适反应pH和温度、pH稳定性和热稳定性、金属离子对酶活的影响以及动力学常数等。利用重组酶PGB对低酯果胶进行酶解,得到了聚合度以2～4为主的寡聚半乳糖醛酸。生物学活性的研究表明,该寡聚半乳糖醛酸能较好地抑制金黄色葡萄球菌的生长,且具有较高的抗氧化能力,这为其作为防腐剂、抗氧化添加剂等应用于食品和化妆品行业提供了有效的理论基础和科学根据。

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BiochemicalcharacterizationoftherecombinantpolygalacturonasePGBandtheactivityanalysisofitsenzymatichydrolysisproduct

CHENXin-ran1,HUANGYong-sheng2,TIANKang-ming1,2 *,JINPeng1,DONGZi-xing1,LIUXiao-guang1,LUFu-ping2,WANGZheng-xiang1,2

(1.Department of Biochemical Engineering,College of Chemical Engineeringand Materials Science,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China;2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China)

To analyze the enzymatic properties of recombinant polygalacturonase PGB and to study the compositions and biological activities of pectin hydrolysate prepared by PGB. Polygalacturonase was prepared by shake flask fermentation and its enzymatic properties were investigated. Pectin was hydrolyzed by PGB under optimum conditions,followed by investigation of its compositions,and antioxidant and antibacterial activities. At the shake flask fermentation level,the activity of PGB reached 10790 U/mL. Its optimum temperature and pH was 55 ℃ and 5.0,respectively. And it was quite stable at 40 ℃ or pH4.0～6.0. Mg2+and Cu2+enhanced its activity,while K+,Ca2+,Zn2+,Mn2+,Co2+,Fe3+and Fe2+had different inhibitory effects on its activity. The Kmand Vmaxof PGB toward low-ester pectin was determined to be 0.756 mg/mL and 9.225 mg/(mL·min). After hydrolyzed by PGB,pectin hydrolysate was identified as galacturonic acid and oligogalacturonic acid with a polymerization degree of 2 to 4 by high performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detector(HPAEC-PAD). This oligomer significantly inhibited the growth of Staphylococcus aureus,and its minimum inhibitory concentration and antioxidant activity was 0.64 mg/mL and 6.125 U/mL,respectively.

polygalacturonase;biochemical characterization;pectin;oligogalacturonic acid

2017-05-05

谌新然(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：酶工程与技术，E-mail:1243720808@qq.com。

*通讯作者:田康明(1985-)，男，博士，讲师，研究方向：酶制剂的应用及新材料单体的制造，E-mail:jinantkm@163.com。

TS245.9

A

1002-0306(2017)23-0119-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.024