卡拉胶酶的发酵培养基及培养条件优化

,,, ,3,,,3,4,*

(1.集美大学食品与生物工程学院,福建厦门 361021；2.绿新福建食品有限公司,福建漳州 363100；3.福建省海洋功能食品工程技术研究中心,福建厦门 361021；4.厦门市海洋功能食品重点实验室,福建厦门 361021)

卡拉胶酶的发酵培养基及培养条件优化

朱云鹏1,李永幸1,洪清林2,倪辉1,3,郭东旭2,肖安风1,3,4,*

(1.集美大学食品与生物工程学院,福建厦门 361021；2.绿新福建食品有限公司,福建漳州 363100；3.福建省海洋功能食品工程技术研究中心,福建厦门 361021；4.厦门市海洋功能食品重点实验室,福建厦门 361021)

以生物量与卡拉胶酶活为指标,研究发酵培养基组成和培养条件对菌株ASY5产卡拉胶酶的影响,优化菌株PseudoalteromonascarrageenovoraASY5产卡拉胶酶的培养基和培养条件,以提高卡拉胶酶的产量。结果表明,最优培养基和培养条件为:卡拉胶5 g/L,胰蛋白胨5 g/L,NaCl 20 g/L,CaCl20.2 g/L,NaH2PO4·2H2O 1.3 g/L,Na2HPO4·12H2O 3.8 g/L,温度18 ℃,初始pH为6.5,接种量2%,装液量70 mL。在优化工艺条件下,菌株ASY5的生物量和卡拉胶酶活比初始条件分别提高了80.4%和52.2%,菌株ASY5发酵产卡拉胶酶的能力大幅度提高。

卡拉胶酶,发酵培养基,培养条件,工艺优化,酶活

卡拉胶是从海藻中提取的一种海藻多糖[1],可作为增稠剂、胶凝剂、乳化剂用于食品[2]及化工行业[3]中,因其抗病毒、抗凝血等功能[4],也用于医药行业中。卡拉胶寡糖是卡拉胶的降解产物,具有多种生理活性,且分子量低,易吸收、毒性低,日益被人们重视[5]。

卡拉胶寡糖的制备主要用化学法,但是反应剧烈,不易控制,且产物不单一。而卡拉胶酶能特异性水解卡拉胶生成卡拉胶寡糖,且条件温和,产物单一,故酶法制备卡拉胶寡糖具有广阔的应用前景[6]。

人们通过菌种选育[7],基因工程改造[8]及发酵工艺优化[9]的方法提高卡拉胶酶的活力。倪敏[10]利用单因素法优化菌株Cellulophagasp.QY201发酵产卡拉胶酶的碳氮源、无机盐含量及培养条件,优化后的酶活力为优化前的3.5倍。彭小珍等[11]通过单因素和正交实验对施氏假单胞菌产卡拉胶酶的发酵工艺进行优化,在最佳条件下酶活力比优化前提高了80%。王飞飞等[12]采用单因素法对产卡拉胶酶的菌株CellulophagalyticaN5-2进行发酵优化,优化后,酶活力提高了8.3倍。

目前卡拉胶酶的研究主要集中在产酶菌株的分离及酶学性质方面,但是获得的卡拉胶酶活性低,稳定性差,易受各种金属离子及蛋白抑制剂的抑制,对卡拉胶底物的亲和力差[13]。因此,获得能够高效降解卡拉胶的菌株和活性高、稳定性好的卡拉胶酶具有重要意义。本实验室利用以卡拉胶为唯一碳源的培养基分离筛选到一株产卡拉胶酶菌株假交替单胞菌Pseudoalteromonassp.ASY5,采用单因素法对产卡拉胶酶菌株ASY5的发酵培养基成分及培养条件进行优化,以提高其产卡拉胶酶的产量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种 产卡拉胶酶菌株PseudoalteromonascarrageenovoraASY5由集美大学发酵工程研究室筛选得到,在中国工业微生物保藏管理中心(CICC)保藏编号为23819。

ZHWY-2102型双层全温度恒温摇床 上海智城分析仪器制造有限公司;ALP-高压蒸汽灭菌器 日本ALP公司;Unic7200型紫外-可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;FE20/EL20型pH计 北京哈纳科仪科技有限公司;BS233S型电子天平 德国赛多利科学仪器(北京)有限公司;Centrifuge 5415D型小型高速离心机 德国Eppendorf Co.,Ltd.;WB-10L1型精密恒温水浴锅 厦门精艺兴业科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基 种子培养基:牛肉浸膏10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、蒸馏水250 mL、人工海水750 mL[14-15]。牛肉浸膏和胰蛋白胨溶解后调pH至7.8,加热煮沸10 min,冷却后调pH至7.3,然后和人工海水混合,121 ℃灭菌20 min。

初始发酵培养基(g/L):卡拉胶2.5、NaCl 30、KCl 0.1、CaCl20.2、MgSO43.0、蛋白胨3.0、FeSO40.036、NaH2PO4·2H2O 1.3、Na2HPO4·12H2O 3.8,121 ℃灭菌20 min。

1.2.2 接种及发酵 将保存在-20 ℃的菌种解冻后,接入制备好的种子培养基中,在摇床温度20 ℃、转速180 r/min条件下培养24 h,即为活化的菌种。将活化好的种子液以2%的接种量接入制备好的发酵培养基中,在摇床温度20 ℃、转速180 r/min条件下发酵培养。

1.2.3 生物量的检测 1.0 mL发酵液在10000 r/min转速下离心5 min,用4 mL蒸馏水溶解菌体后,测OD600,空白为蒸馏水。

1.2.4 卡拉胶酶活力的测定 取50 μL处理后的酶液(对照组的酶液以沸水浴5 min后的酶液代替),添加550 μL浓度为0.5%的卡拉胶(用50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4pH7.0的缓冲液溶解)溶液,60 ℃水浴20 min,沸水浴5 min,然后加0.9 mL DNS溶液并沸水浴5 min,冷却至室温后加蒸馏水至5 mL,混匀,测OD520,根据标准曲线来计算反应液中还原糖的生成量,计算得到卡拉胶酶的活力。

在上述条件下,每分钟催化产生1 μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

1.2.5 单因素实验

1.2.5.1 发酵培养基的确定 从基础发酵培养基出发,依次用不同碳源(琼脂、卡拉胶、葡萄糖、淀粉、蔗糖),不同氮源(KNO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、蛋白胨、酵母粉),不同无机盐(NaCl、KCl、MgSO4、FeSO4、CaCl2、磷酸根)取代基础培养基中对应的条件,其他条件以基础培养基中为准。

1.2.5.2 发酵培养条件的确定 在上述培养基优化的基础上,考察在初始pH为6.5,接种量为2%,装液量为70 mL时,不同温度(15、17、19、21、23、25 ℃)对菌株ASY5产卡拉胶酶的影响;

考察在培养温度18 ℃,接种量2%,装液70 mL时,不同初始pH(5.5、6.5、7.5、8.5、9.5)对菌株ASY5产卡拉胶酶的影响;

考察在培养温度为18 ℃,初始pH6.5,装液量70 mL时,不同接种量(0.5%、1%、2%、6%、10%)对菌株ASY5产卡拉胶酶的影响;

考察在培养温度18 ℃,初始pH6.5,接种量2%时,不同装液量(10、30、50、70、90 mL)对菌株ASY5产卡拉胶酶的影响。

1.2.6 数据统计分析 所有实验进行3次重复,取其平均值,平均值和标准差的统计分析由Microsoft Excel 2016软件进行处理。

2 结果与讨论

2.1 培养基的确定

2.1.1 碳源种类及浓度对产酶的影响 如图1(a)所示,当以卡拉胶为碳源时,菌株ASY5生长较好且酶活最高,为23.6 U/mL。当以琼脂、葡萄糖、淀粉、蔗糖为碳源时,菌株均能良好的生长,但是检测不到酶活。当培养基中不添加碳源时,菌株生长最好,可能是培养基中添加的蛋白胨能满足菌株生长的需要,但检测不到酶活,表明该菌株是一种诱导表达型的酶,卡拉胶是其诱导剂。彭小珍等[11]研究发现,假单胞菌Pseudomonasstutzeri在以卡拉胶作为唯一碳源时产酶量最高,而只添加麦芽糖、果糖、葡萄糖及半乳糖时该菌株几乎不产酶。王飞飞等[12]对海洋细菌CellulophagalyticaN6-2进行碳源研究时发现,卡拉胶是菌株产酶的最佳碳源,而以海藻酸钠、淀粉和琼胶作为碳源时菌株几乎不产酶。综上所述,菌株ASY5发酵产卡拉胶酶的最佳碳源是卡拉胶,且该菌株是一种诱导表达型的酶,卡拉胶是其诱导剂[16]。

继而,以卡拉胶为碳源,培养基其它成分不变,研究不同卡拉胶浓度对菌株ASY5发酵的影响。如图1(b)所示,随着卡拉胶浓度的增加,菌株ASY5的生物量和酶活均呈现增加的趋势,在卡拉胶浓度为5 g/L时,酶活力达到了最大31.4 U/mL,而当卡拉胶的浓度为6 g/L时,培养基在室温下流动性会变差,甚至会出现凝固现象,故卡拉胶的适宜添加浓度为5 g/L。菌株Bacillussp.Lc50-1[17]产酶的最佳碳源卡拉胶的添加量为3 g/L,而菌株Cytophagasp.M2-4-4[18]产卡拉胶酶所需的最佳卡拉胶浓度为2 g/L,表明不同的菌株对碳源的浓度需求不同。综上所述,卡拉胶的最佳添加浓度为5 g/L。

图1 碳源种类及浓度对ASY5生长及卡拉胶酶产量的影响Fig.1 Effect of different carbon sources and the concentrations of carrageenan on cell growth and carrageenase production of ASY5

2.1.2 氮源种类及浓度对产酶的影响 氮源是生物体合成蛋白质及核酸的材料,能促进生物的生长。不同的菌株产酶时对氮源的要求有较大差异,考察氮源对菌株ASY5发酵的影响,分别在培养基中添加3 g/L的无机氮源KNO3、NH4Cl和(NH4)2SO4,有机氮源蛋白胨及酵母粉,结果见图2(a)。

由图2(a)知,氮源为有机氮源时,生物量更高,菌体生长迅速,可能是因为有机氮源含有的蛋白质、肽类、少量糖类、生长因子和脂肪等促进了该菌株快速生长[19]。在添加的无机氮源中,只有(NH4)2SO4能促使菌株产生卡拉胶酶,而添加有机氮源均能促使菌株产生卡拉胶酶。胡秋实[17]研究菌株Bacillussp.Lc50-1的产酶条件,得出该菌株以蛋白胨为氮源时产酶量较高,为8.9 U/mL。相比于蛋白胨,添加酵母粉和(NH4)2SO4时所产生的卡拉胶酶活力明显偏低,因此蛋白胨是最适产卡拉胶酶的氮源。

继而,考察不同蛋白胨添加量对菌株ASY5生长及产酶的影响,如图2(b)所示,该菌株的生物量随着蛋白胨的量增加而增加,而酶活力呈现出先增大后减小的趋势,说明高浓度的蛋白胨利于菌的生长,但不利于酶的产生,可能是因为高浓度的蛋白胨促使菌株快速生长,致使菌分泌的一些其他代谢产物抑制了卡拉胶酶分泌[20]。在蛋白胨的添加量为5 g/L时,菌株能较好的生长,而酶活力最高,为32.0 U/mL,因此蛋白胨的最佳浓度为5 g/L。

图2 氮源种类及浓度对ASY5生长及卡拉胶酶产量的影响Fig.2 Effect of different nitrogen sources and the concentrations of peptone on cell growth and carrageenase production of ASY5

2.1.3 无机盐对产酶的影响 在培养基中添加不同浓度的NaCl,结果如图3(a)所示,不添加NaCl时菌株可以较好地生长但是不产酶,随着NaCl浓度的增加,生物量及卡拉胶酶活力都呈现一种先增加后减少的现象。过高和过低的盐浓度对生物量影响较大,表明菌株的生长对盐浓度较为敏感。当NaCl为20 g/L时,酶活力最高,且菌株能较好的生长,因此选取NaCl的最佳浓度为20 g/L。

在培养基中添加不同浓度的KCl,结果如图3(b)所示。随着KCl浓度的增加,生物量有略微的增长,酶活力几乎不发生改变。添加和不添加KCl,酶活力没有显著性差异,故该菌株的产酶能力和KCl没关系,以后的实验中均不添加KCl。

在培养基中添加不同浓度的MgSO4,结果如图3(c)所示,硫酸镁浓度在0～3 g/L范围内,产酶能力没有明显区别,菌株生物量略微下降,表明该培养基不需要额外添加镁离子就能满足菌株ASY5的产酶需求。

在培养基中添加不同浓度的FeSO4,结果如图3(d)所示。随着FeSO4浓度的增加,生物量呈增加的趋势而产酶能力却呈现下降的趋势,表明适宜浓度的FeSO4能促进菌株的生长,过高的浓度抑制了代谢产物酶的合成,因此在后续的实验中选择不添加FeSO4。

图3 无机盐浓度对ASY5生长及卡拉胶酶产量的影响Fig.3 Effect of the concentrations of inorganic salts on cell growth and carrageenase production of ASY5

在培养基中添加不同浓度的CaCl2,结果如图3(e)所示,在所选浓度范围内,生物量随着钙离子浓度的增大而升高,而酶活力则呈现出先上升后降低的现象。当钙离子的浓度为0.2 g/L时,菌株可以较好地生长且酶活力最高。

在培养基中添加不同浓度的磷酸根,结果如图3(f)所示,在一定浓度范围内,随着磷酸根含量的增加,促使生物量和酶活力先增加后减小,当磷酸根浓度为19 mmol/L时,生物量和酶活力有峰值,即最佳的磷酸根添加量为19 mmol/L。

2.2 培养条件的确定

2.2.1 温度对产酶的影响 温度影响着微生物体内的一系列生化反应,适宜的温度可以促进微生物良好的生长及其代谢产物的合成[21]。据报道,菌HC4[22]及菌株Pedobacterhainanensis13-QT[20]产卡拉胶酶的最适温度分别为28 ℃和30.3 ℃。由图4可知,在所选取的温度范围内,菌株的生物量有增加的趋势,酶活力随温度的升高先增大后减小,且在18 ℃时,酶活力最高,达到33.8 U/mL。表明较高温度下有利于菌株的生长,而较低温度有利于产酶。

图4 温度对ASY5生长及卡拉胶酶产量的影响Fig.4 Effect of the temperature on cell growth and carrageenase production of ASY5

2.2.2 培养基初始pH对产酶的影响 pH是影响微生物生长的重要条件之一,初始pH通过改变营养物质在培养基中的溶解度、解离度以及微生物细胞膜的电荷量来影响微生物的生长及其产物的合成[23]。如图5所示,在pH为5.5～7.5时,菌株可以较好的生长和产酶,在pH为8.5～9.5时,菌株生长较差,且检测不到酶活力。在pH为6.5～7.5时,菌株都能较好的生长且酶活力没有显著差异(p>0.05),因为pH6.5为培养基自然pH,故选取pH6.5为培养基初始pH。

图5 初始pH对ASY5生长及卡拉胶酶产量的影响Fig.5 Effect of the initial pH on cell growth and carrageenase production of ASY5

2.2.3 接种量对产酶的影响 接种量与细菌生长的延滞期长短成反比,接种量过多会引入大量的代谢废物及快速地消耗营养物质,不利于诱导酶的合成[24]。由图6知,随着接种量的增加,生物量有较小的上升趋势,酶活力呈现先增加后减小的趋势,但是差异不显著(p>0.05)。考虑到接种时的方便,选取2%为最佳接种量。

图6 接种量对ASY5生长及卡拉胶酶产量的影响Fig.6 Effect of the inoculum size on cell growth and carrageenase production of ASY5

2.2.4 装液量对产酶的影响 在摇瓶发酵中,装液量是影响培养基溶氧量的重要因素之一,在其他培养条件相同时,装液量和培养基中的溶氧量成反比[25],从而影响菌株ASY5的发酵产酶。本实验,分别将10、30、50、70、90 mL培养基接入250 mL的摇瓶中进行发酵培养。结果如图7所示,高的装液量促进了菌株的生长,可能是因为低氧环境下有利于菌株的生长。装液量为10～70 mL时,酶活力变化不明显,当装液量为90 mL时,酶活力迅速下降,可能是该菌株可以在低氧下很好的生长,但不利于酶的合成。当酶活力相近时,装液量越大,总酶活力越大,因此选取70 mL为最佳装液量。

图7 装液量对ASY5生长及卡拉胶酶产量的影响Fig.7 Effect of the inoculum size on cell growth and carrageenase production of ASY5

2.3 发酵工艺优化前后比较

如图8所示。在初始发酵工艺条件下(图8a),菌种接至发酵培养基后能迅速进入对数期,0～16 h能检测出生物量的明显增加,且能检测出酶活;16～24 h菌株生长较为迅速,此时酶活力也迅速增加;24～44 h菌株生物量缓慢增加,在44 h处达到最大,酶活力在24～32 h处呈现缓慢增加的趋势,32 h处酶活力达到最大,为26.8 U/mL;32～40 h时酶活力基本保持稳定,40 h后,酶活力呈现降低的趋势,可能是因为发酵中积累的一些代谢产物抑制了酶活力,或者长时间的发酵导致了部分酶失活[26]。因此,将摇瓶发酵卡拉胶酶的时间定为36 h较为适宜。在优化发酵工艺条件下(图8b),8～28 h之间生物量增加较快,在28 h处达到最大为1.4,比优化前的最大生物量0.776提高了80.4%。20～32 h之间酶活力迅速增加,且在32 h后酶活力基本维持不变,48 h处有最大酶活40.8 U/mL,较优化前的酶活力26.8 U/mL提高了52.2%。并且优化后培养基成分减少了三种(KCl、MgSO4、FeSO4),节约了成本,也使得培养基的配制更加方便快捷。

图8 菌株ASY5优化前后发酵曲线比较Fig.8 Comparison of fermentation curves before and after ASY5 optimization注:a图表示初始发酵工艺条件下菌株的发酵曲线;b图表示单因素实验适宜条件下菌株的发酵曲线。

3 结论

本文对菌株ASY5发酵生产卡拉胶酶的摇瓶发酵培养基和发酵条件进行了单因素实验,得到产卡拉胶酶的最佳发酵工艺条件为:卡拉胶5 g/L,胰蛋白胨5 g/L,NaCl 20 g/L,CaCl20.2 g/L,NaH2PO4·2H2O 1.3 g/L,Na2HPO4·12H2O 3.8 g/L,培养温度18 ℃,培养基初始pH为6.5,接种量2%,装液量70 mL。优化后的生物量最大达到1.4,比初始条件下的最大生物量提高了80.4%;优化后的卡拉胶酶活力最大达到40.8 U/mL,较优化前的酶活力26.8 U/mL提高了52.2%。本实验的发酵优化使得菌株ASY5发酵产卡拉胶酶的能力大幅度提高,为后续的中试放大发酵实验以进一步提高产酶量提供了技术参考,后续还可以在此单因素实验的基础上,设计正交实验,探寻最优的发酵培养基以及培养条件。

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Optimizationofmediumcompositionandcultureconditionsforcarrageenaseproduction

ZHUYun-peng1，LIYong-xing1，HONGQing-lin2，NIHui1,3，GUODong-xu2，XIAOAn-feng1,3,4,*

(1.College of Food and Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China;2.Green Fresh(Fujian)Food Stuff Co.,Ltd.,Zhangzhou 363100,China;3.Fujian Provincial Engineering Technology Research Center of Marine Functional Food,Xiamen 361021,China;4.Xiamen Key Laboratory of Marine Functional Food,Xiamen 361021,China)

Biomass and carrageenase activity was used as the index,the effects of medium compositon and culture conditons on cell growth and enzyme production was investigated in shaking culture ofP.carrageenovoraASY5.In order to increase the yield of carrageenase,the medium compositon and culture conditons were optimized for fermentation ofPseudoalteromonascarrageenovoraASY5.The optimal medium compostion was composed of carrageenan 5 g/L,tryptone 5 g/L,NaCl 20 g/L,CaCl20.2 g/L,NaH2PO4·2H2O 1.3 g/L,Na2HPO4·12H2O 3.8 g/L,while the optimal culture conditions were determined as tempreture 18 ℃,initial pH6.5,inculation volume 2%,liquid volume 70 mL. Under the optimum fermentation process,the production capability of carrageenase byP.carrageenovoraASY5 was significantly improved. Compared to the basic technical contidtions,the biomass and enzyme activity at the optimum technique were increased by 80.4% and 52.2%,respectively.

carrageenase;medium composition;culture conditions;processoptimization;enzyme activity

2017-03-29

朱云鹏(1993-)，男，硕士研究生，研究方向：食品生物技术，E-mail:jmuzyp@163.com。

*通讯作者:肖安风(1973-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail:xxaaffeng@jmu.edu.cn。

福建省高校产学合作项目(2016N5008)；福建省科技重大专项项目(2015NZ0001-1)；国家海洋公益行业科研专项(201505033)；福建省海洋高新产业发展专项(闽海洋高新[2016]08号)资助。

TS201.3

A

1002-0306(2017)23-0104-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.021