蚕蛹蛋白肽酶水解条件优化

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(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学食品学院,江西南昌 330047;3.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所,广东广州510610)

蚕蛹蛋白肽酶水解条件优化

黄美佳1,2,程剑锋2,戴燕2,杨帆1,2,徐玉娟3,邹宇晓3,李欣1,2,*

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学食品学院,江西南昌 330047;3.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所,广东广州510610)

为了降低蚕蛹过敏风险,提高蚕蛹优质蛋白利用价值并制备免疫活性肽,对蚕蛹蛋白进行了酶解优化。本文选用菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶这5种酶对脱脂蚕蛹蛋白进行酶解。通过对小鼠脾细胞增殖和水解度的检测,选取最佳蛋白酶。在此基础上对最佳蛋白酶的四个单因素(酶和底物量,初始pH,水解温度和底物浓度)进行优化,从而确定最佳的酶解条件。结果表明，5种蛋白酶中碱性蛋白酶对脱脂蚕蛹蛋白的酶解效果最好。对碱性蛋白酶进一步优化,通过Box-Behnken实验和回归分析获得碱性蛋白酶酶解脱脂蚕蛹蛋白的最佳条件为加酶量=6.0%,温度=55 ℃,酶解时间=2.00 h,pH=8.0,水∶底物=20∶1,测得的水解度为19.96%±1.02%,免疫活性OD490 nm为0.2512±0.0125。

蚕蛹蛋白,肽,酶解,优化

蚕蛹是一种化学成分含量较为复杂的蚕蛾的蛹,因其所富含人体必需的8种氨基酸且比例均衡[1],符合由世界卫生组织提出的氨基酸最佳组合模式[2],是一种优质的动物蛋白来源,在中国、韩国、日本、泰国和印度等亚洲地区成为了一种较受欢迎的食物[3-4]。此外,它还含有大量油脂[5]、多糖、溶菌酶和激素等生物活性类物质[6]以及铁、锌、铜、锰、硒等微量元素[7-8]。蚕蛹具有比较高的营养价值,因此可以将它作为一种生产具备生物活性功能产品的优质原料[9]。

蛋白酶水解蛋白质是指在一定的条件下断裂蛋白肽键,将大分子蛋白水解成小分子肽段的过程,它可以对蛋白质进行特异性位点切割,最终使蛋白质肽链长度缩短、极性基团数目增加、疏水基团暴露和平均分子质量降低[10],形成较多的生物活性肽。它是一种具有特殊生理功能的氨基酸肽段,一般由几个到数十个氨基酸组成[11]。脱脂蚕蛹蛋白富含18种氨基酸以及多种生物活性类物质[12],为了提高蚕蛹蛋白的利用价值,降低蚕蛹过敏风险且获得活性肽,本文通过酶解优化制备具有特殊生理功能的生物活性肽,也为脱脂蚕蛹的免疫活性肽制备提供理论基础。酶解可将蛋白分解成肽段,既能降低过敏的风险,又能获得活性肽。王艳[13]等人研究表明不同蛋白酶水解后,蛋白的致敏性降低。Maria[14]等人研究发现胃肠蛋白酶酶解后,蛋白的潜在致敏性降低。优质的蚕蛹蛋白会引起部分人群过敏,使蚕蛹在食品领域的应用受到限制,本实验将蚕蛹蛋白进行酶解优化,扩大其在食品领域的应用也为降低潜在致敏性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蚕蛹 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究院;菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶(酶活均为20万U/g) 南宁庞博生物工程有限公司;低分子量Marker 美国Thermo公司;邻苯二甲醛 Sigma公司;DTT、考马斯亮蓝G250 上海生工;胎牛血清 美国Gibco公司;RPMI-1640细胞培养基 北京索莱宝公司;NaOH、HCl等常规化学试剂 均为国产分析纯。

高速冷冻离心机 美国Thermo公司;TU-1901紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;HJ-A6恒温磁力搅拌水浴锅 常州迈科诺仪器有限公司;CO2细胞培养箱 日本三洋公司;Mode 1860酶标仪、PowerPac 3000电泳仪、Quantity One凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 最优蛋白酶的筛选 将蚕蛹清洗除油制备脱脂蚕蛹蛋白粉[15],蚕蛹清洗脱脂得到的蚕蛹蛋白粉,用考马斯亮蓝G250测定蛋白浓度为6.9 mg/mL。称取一定量脱脂蚕蛹蛋白粉,用PBS(20 mmol/L磷酸盐缓冲液)稀释后搅拌均匀,用1 mol/L的NaOH(或1 mol/L HCl)调节体系酸度至各蛋白酶最适pH范围,并于恒温水浴器上搅拌加热恒温至设定温度。迅速加入己准备好的蛋白酶(菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶)溶液进行酶解,酶解过程中不断滴加HC1或NaOH溶液以保持体系恒定的pH,在水浴中反应15、30、60、90、120、150、180、240 min后取出,沸水浴灭酶10 min后得到蚕蛹蛋白酶解产物[16],冷却后将酶解液的pH调至7.0,然后以8000 r/min转速离心20 min,取上清液冷藏备用[17]。表1是说明书推荐的各蛋白酶在蒸馏水中酶解的最适条件以及酶活。

表1 各蛋白酶酶解最适条件Table 1 The optimum conditions of protease hydrolysis

1.2.2 水解度的测定 酶解过程中水解度的测定采用邻苯二甲醛(OPA)法并加以改进[13,18]。具体方法为:以精氨酸作为标准品,绘制标准曲线。取400 μL样品溶液加入到盛有3 mL OPA的离心管中,混匀5 s,避光反应2 min,同时做空白对照实验,未水解样代替,340 nm下测定吸光值,按标准曲线计算水解度如下:

h=(ht-hc)×DF

DH(%)=h/htot×100

式中,ht-样品的吸光度从标曲上查得的浓度;hc-对照品(未水解样品)的吸光度从标曲上查得的浓度;htot-全部酶解液的吸光度从标准曲线上查得的浓度;DH-样品的水解度;DF-样品的稀释倍数。

1.2.3 酶解多肽对小鼠脾细胞增殖检测 2只5周龄健康的18～20 g BAL B/C小白鼠,颈椎脱臼处死,置于消毒酒精中,10 min后在超静台中解剖分离出小鼠脾脏。然后碾碎并过100目尼龙细胞筛,加入10 mL不完全培养基RPMI-1640,转移至15 mL离心管中,1000 r/min离心5 min后弃上清,重复2次。加入3～4 mL红细胞裂解液,5 min后加入不完全培养基RPMI-1640重悬脾细胞,1000 r/min离心5 min弃上清,重复1次,加入含0.1 mg/mL胎牛血清的完全培养基RPMI-1640约2 mL。往0.15 mL 0.4%台盼蓝染色液中加入等体积的细胞悬液进行细胞计数。稀释细胞浓度为1～2×106cell/mL后,加入到96孔无菌细胞培养板中。蚕蛹酶解液经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌,以400 μg/mL浓度加入到细胞培养板中刺激脾细胞。同时设置阴性对照组(灭活的酶溶液)和空白对照组(生理盐水)。培养72 h后每孔加入0.01 mL MTT溶液(0.5%,w/v),继续在CO2细胞培养箱中培养4 h,1000 r/min离心10 min后小心吸去孔内培养液,每孔加入0.1 mL DMSO后置于摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。由酶标仪检测490 nm处的OD值。另设一组阴性对照组和调零孔(不加细胞)。每组设5个复孔,实验重复3次。

1.2.4 最优酶解条件的优化

1.2.4.1 初始pH对蚕蛹蛋白酶解制备活性多肽的影响 取2.5 g 蚕蛹蛋白于250 mL三角瓶中,加入50 mL缓冲液,混合搅拌均匀,使用1 mol/L的NaOH(或1 mol/L HCl)调节体系pH分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,并于恒温水浴器上搅拌加热恒温至设定温度,50 ℃下分别加入E0/S0为5.0%的酶进行酶解,1.5 h后取出,灭酶后得到蚕蛹蛋白酶解产物,冷却后将酶解液的pH调至7.0,然后以8000 r/min转速离心20 min,取上清液冷藏备用。测定各酶解液的水解度和对淋巴细胞的增殖。

1.2.4.2 加酶量对蚕蛹蛋白酶解制备活性多肽的影响 取2.5 g 蚕蛹蛋白于250 mL三角瓶中,加入50 mL缓冲液,混合搅拌均匀,使用 1 mol/L 的NaOH(或1 mol/L HCl)调节体系酸度至各蛋白酶最适pH,并于恒温水浴器上搅拌加热恒温至设定温度。50 ℃下分别加入E0/S0为1.5%、3.0%、4.5%、6.0%、7.5%的酶进行酶解,1.5 h后取出,灭酶后得到蚕蛹蛋白酶解产物,冷却后将酶解液的pH调至7.0,然后以8000 r/min转速离心20 min,取上清液冷藏备用。测定各酶解液的水解度和对淋巴细胞的增殖。

1.2.4.3 料水比对蚕蛹蛋白酶解制备活性多肽的影响 取2.5 g蚕蛹蛋白于250 mL三角瓶中,分别与缓冲液以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的比例,混合搅拌均匀,使用1 mol/L的NaOH(或1 mol/L HCl)调节体系酸度至各蛋白酶最适pH,并于恒温水浴器上搅拌加热恒温至设定温度。在50 ℃下加入E0/S0为5.0%的酶进行酶解,1.5 h后取出,灭酶后得到蚕蛹蛋白酶解产物,冷却后将酶解液的pH调至7.0,然后以8000 r/min转速离心20 min,取上清液冷藏备用。测定各酶解液的水解度和对淋巴细胞的增殖。

图2 风味蛋白酶对脱脂蚕蛹蛋白的水解度和免疫活性的影响以及SDS-PAGE图谱Fig.2 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of flavourzyme to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein and SDS-PAGE patterns

1.2.4.4 水解温度对蚕蛹蛋白酶解制备活性多肽的影响 取2.5 g蚕蛹蛋白于250 mL三角瓶中,加入50 mL缓冲液,混合搅拌均匀,使用1 mol/L的NaOH(或1 mol/L HCl)调节体系酸度至各蛋白酶最适pH,并于恒温水浴器上搅拌加热恒温至设定温度。分别在45、50、55、60、65 ℃下加入E0/S0为5.0%的酶进行酶解,1.5 h后取出,灭酶后得到蚕蛹蛋白酶解产物,冷却后将酶解液的pH调至7.0,然后以8000 r/min转速离心20 min,取上清液冷藏备用。测定各酶解液的水解度和对淋巴细胞的增殖。

1.2.5 Box-Behnken中心组合实验设计 对pH、酶解时间(h)和水/底物三个因素设计Box-Behnken中心组合实验,因素和水平表如表2所示。

表2 Box-Behnken中心组合实验的因素和水平表Table 2 Factors and levels table of the Box-Behnken center combination experiment

1.3 数据处理

所有数据都以平均值的形式表示,每个测试都重复三次,结果采用SPSS statistical软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 最优蛋白酶的筛选

图1为本实验所选用的5种蛋白酶酶液和脱脂蚕蛹蛋白酶解前液以及PBS对小鼠脾淋巴细胞免疫活性在OD490处的吸光值。从图1可知,5种蛋白酶液、脱脂蚕蛹蛋白酶解前液以及PBS对小鼠脾淋巴细胞的免疫活性均不高,统计分析表明,酶解前液与碱性蛋白酶、中性蛋白酶及菠萝蛋白酶相比存在显著性差异(p<0.05),这为后续的实验提供了一个空白参考。近年来,李高扬[19]等人选用5种不同的酶酶解蚕蛹蛋白,以DPPH清除能力为指标对酶解过程进行分析。杨梅琳[20]选用6种蛋白酶对蚕蛹蛋白酶解,酶解后的多肽通过对其水解度和清除自由基的能力的测定来选择最优酶。而本文通过测定水解度和免疫活性来确定最优条件。

图1 不同蛋白酶液、脱脂蚕蛹蛋白酶解前液以及PBS的免疫活性Fig.1 The immunological activity of different protease solutions,pre-enzymatic hydrolysis of defatted silkworm pupa and PBS

图3 菠萝蛋白酶对脱脂蚕蛹蛋白的水解度和免疫活性的影响以及SDS-PAGE图谱Fig.3 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of bromelain to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein and SDS-PAGE patterns

图4 碱性蛋白酶对脱脂蚕蛹蛋白的水解度和免疫活性的影响以及SDS-PAGE图谱Fig.4 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of alkaline protease to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein and SDS-PAGE patterns

图5 木瓜蛋白酶对脱脂蚕蛹蛋白的水解度和免疫活性的影响以及SDS-PAGE图谱Fig.5 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of papain to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein and SDS-PAGE patterns

图6 中性蛋白酶对脱脂蚕蛹蛋白的水解度和免疫活性的影响以及SDS-PAGE图谱Fig.6 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of neutral protease to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein and SDS-PAGE patterns

图2～图6分别为风味蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶对脱脂蚕蛹蛋白在15、30、60、90、120、150、180、240 min时的水解度和免疫活性及SDS-PAGE图谱(图2中风味蛋白酶做了0 min时的SDS-PAGE图谱,其他酶的0 min与其相同)。从图中可以看出,风味蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶对脱脂蚕蛹蛋白的水解度明显高于菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶,其中以碱性蛋白酶对脱脂蚕蛹蛋白的水解度略高于风味蛋白酶、中性蛋白酶。而对于酶解脱脂蚕蛹蛋白肽的免疫活性,碱性蛋白酶和中性蛋白酶明显高于其他三种蛋白酶,其中碱性蛋白酶最大值略高于中性蛋白酶,综合考虑水解度和酶解肽的免疫活性,本实验选用碱性蛋白酶作为酶解脱脂蚕蛹蛋白的优势酶。并由图4可知,当酶解时间选用90 min时,酶解脱脂蚕蛹蛋白肽的免疫活性最强,因此,在后续的对酶解条件的初步优化过程中,我们将选用该酶解时间进行对其它实验条件进行优化。采用SPSS statistical软件分析得到:风味蛋白酶在酶解90 min时水解度与其他各时间都存在显著性差异(p<0.05),免疫活性在60、90 min与150、180、240 min存在显著性差异(p<0.05);菠萝蛋白酶在酶解60、90 min与150、180、240 min的水解度存在显著性差异(p<0.05),180 min时免疫活性与其他存在显著性差异(p<0.05);碱性蛋白酶各时间的水解度均存在显著性差异,90 min与其他各时间的免疫活性存在显著性差异(p<0.05);木瓜蛋白酶60、90 min与150、180、240 min的水解度存在显著性差异,免疫活性60 min与15、240 min存在显著性差异(p<0.05);中性蛋白酶在90 min的水解度与其他存在显著性差异,15 min免疫活性与其他存在显著性差异(p<0.05)。

2.2 碱性蛋白酶酶解脱脂蚕蛹蛋白粉的初步优化

通过以上对几种蛋白酶的酶解分析,选用碱性蛋白酶对其进行单因素实验,且图4确定碱性蛋白酶最佳酶解时间为90 min。刘旭辉[21]也用碱性蛋白酶通过单因素实验得出蚕蛹蛋白肽酶解最优工艺条件。图7～图10分别为pH、加酶量、料水比和温度对脱脂蚕蛹蛋白在90 min时碱性蛋白酶的水解度和免疫活性及SDS-PAGE图谱。脱脂蚕蛹蛋白在pH7.0～9.0范围内的水解度以及水解肽的免疫活性变化如图7所示,由图7可知,水解度以及水解肽的免疫活性都呈先上升后下降的趋势,且在pH8.0处达到最大值。水解度在pH7.0、7.5与pH8.0时存在显著性差异(p<0.05),免疫活性无显著性差异。

脱脂蚕蛹蛋白在加酶量1.5%～7.5%范围内的水解度以及水解肽的免疫活性变化如图8所示,由图8可知,水解度以及水解肽的免疫活均以先上升后平稳的趋势,经过单因素实验得出,碱性蛋白酶酶解脱脂蚕蛹蛋白的最优加酶量为6.0%。水解度和免疫活性均无显著性差异。

脱脂蚕蛹蛋白在料水比1∶10～1∶30范围内的水解度以及水解肽的免疫活性变化如图9所示,由图9可知,水解肽的免疫活性变化趋势不明显,略有先上升后下降的趋势,且在料水比1∶20处略高于1∶15和1∶25,然而对于水解度则呈现明显的先上升后下降趋势,在1∶20处达到最大值。水解度在1∶20、1∶15、1∶25与1∶30存在显著性差异(p<0.05);免疫活性不存在显著性差异。由结果推断当料水比过高时,蛋白浓度太高酶解表位可能叠在一起,影响其作用效果:当料水比过低时,酶浓度就会相应降低,影响其水解度。

最后一组(图10)为脱脂蚕蛹蛋白在温度45～65 ℃范围内的水解度以及水解肽的免疫活性变化趋势,由图10可知,水解度以及水解肽的免疫活性对这区间温度的变化并不十分明显,总体有上升后下降的趋势,经过此单因素实验得出,碱性蛋白酶酶解脱脂蚕蛹蛋白的最优温度为55 ℃。水解度在55 ℃与65 ℃存在显著性差异(p<0.05),免疫活性均无显著性差异。

图7 不同 pH对脱脂蚕蛹蛋白的水解度和免疫活性的影响以及SDS-PAGE图谱Fig.7 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein at different pH conditions and SDS-PAGE patterns

图8 加酶量对脱脂蚕蛹蛋白的水解度和免疫活性的影响以及SDS-PAGE图谱Fig.8 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein at different enzymatic contents and SDS-PAGE patterns

图9 料水比对脱脂蚕蛹蛋白的水解度和免疫活性的影响以及SDS-PAGE图谱Fig.9 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein at the different proportion of substrate and water conditions and SDS-PAGE patterns

图10 温度对脱脂蚕蛹蛋白的水解度和免疫活性的影响以及SDS-PAGE图谱Fig.10 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein at the different temperature conditions and SDS-PAGE patterns

2.3 碱性蛋白酶酶解脱脂蚕蛹蛋白条件的进一步优化

因选用酶解温度在55 ℃上下以及加酶量在6.0%上下对实验结果影响不大,所以选用酶解时间、酶解pH和料水比三个因素作为优化的因素,以脱脂蚕蛹蛋白的水解度和免疫活性(OD490)作为结果值。Box-Behnken实验[22-23]结果如表3所示,利用软件Design-Expert 8.0对实验数据进行二次多项回归拟合,得到水解度R1和免疫活性R2对酶解时间(A)、酶解pH(B)和水/底物(C)三个因素的回归方程:

R1=17.70+3.55A-0.71B-1.15C+0.42AB+0.16AC+0.59BC-0.061A2-1.12B2-2.03C2

R2=0.26+0.00714A+0.0000388B+0.000208C+0.00358AB+0.00463AC+0.00214BC-0.011A2-0.013B2-0.00798C2

表3 Box-Behnken 实验设计和结果Table 3 Experimental design and results of Box-Behnken

由回归分析结果(表4、表5)可知,水解度和免疫活性两个回归模型的p值均小于0.01,说明该模型具有高度显著水平(p<0.01),水解度的相关系数为R2=0.9175,免疫活性的相关系数为R2=0.9076,这说明该两个回归方程的可信度高,水解度的失拟项p=0.3257>0.05以及免疫活性的失拟项p=0.3218>0.05,均为不显著,说明该回归方程的拟合度高。由模型的显著性检验可知,对于水解度模型,酶解时间的一次项以及水与底物比的二次项为极显著(p<0.01),水/底物的一次项以及pH的二次项为显著(p<0.05);对于免疫活性模型,酶解时间的一次项和二次项以及pH和水/底物的二次项为极显著(p<0.01)。由回归方程R1和R2可知,三个因素A、B、C的一次项回归系数的绝对值大小均为A>C>B,这说明酶解时间对碱性蛋白酶酶解脱脂蚕蛹蛋白的水解度以及免疫活性的影响最大,其次为水/底物,pH影响最小。

表4 水解度回归分析Table 4 Regression analysis results of degree of hydrolysis

表5 免疫活性回归分析Table 5 Regression analysis results of immune activity

根据图11和图12可知,酶解时间对于水解度的影响逐渐增加,而对酶解液的免疫活性则是先升高,而后下降,而对于pH和料水比,不管是对于水解度还是免疫活性,都呈抛物线形式,先升高后回落。

由软件Design-Expert 8.0对两回归曲线的精确计算,得到碱性蛋白酶酶解脱脂蚕蛹蛋白的最佳工艺参数为:酶解时间=1.96 h,pH=8.03,料水比=1∶20.16,且在此最佳条件下,预测酶解脱脂蚕蛹蛋白的水解度为20.87%,免疫活性OD490为0.2598。为了验证预测结果的准确性并方便实验条件,在酶解温度=55 ℃,加酶量=6.0%,酶解时间=2.00 h,pH=8.0,水∶底物=20∶1的条件下对脱脂蚕蛹蛋白进行了三次酶解实验,测得的平均水解度为19.96%±1.02%;平均免疫活性OD490为0.2512±0.0125,与模型预测值的相对误差在0.09%以下。因此,该响应面对酶解条件的优化准确可靠。

图11 三因素对酶解脱脂蚕蛹蛋白的水解度三维响应面图Fig.11 Three-dimensional response surface of three factors to the degree of hydrolysis of the defatted silkworm pupa protein注:A:固定水/底物为20∶1;B:固定pH为8.0;C:固定酶解时间为1.5 h。

图12 三因素对酶解脱脂蚕蛹蛋白的免疫活性三维响应面图Fig.12 Three-dimensional response surface of three factors to the immune activity of the defatted silkworm pupa protein注:A:固定水/底物为20∶1;B:固定pH为8.0;C:固定酶解时间为1.5 h。

3 结论

选用了5种不同的酶来酶解脱脂蚕蛹蛋白,综合考虑水解度和酶解肽的免疫活性,选用碱性蛋白酶作为酶解脱脂蚕蛹蛋白的优势酶。在单因素实验的基础上,通过Box-Behnken实验和回归分析,得出碱性蛋白酶酶解脱脂蚕蛹蛋白的最佳工艺参数为:加酶量6.0%,温度55 ℃,酶解时间=2.00 h,pH=8.0,水∶底物=20∶1,在此条件下平均水解度为19.96%±1.02%;平均免疫活性OD490为0.2512±0.0125。酶解可将蚕蛹蛋白分解成小肽段,可能大量破坏其结合表位,既能降低过敏的风险,又能获得活性肽。因此,实验对蚕蛹蛋白的酶解条件对潜在致敏性的研究有重要意义,同时给低致敏蚕蛹食品提供一定的理论依据,为后续脱脂蚕蛹的免疫活性肽制备提供理论基础。

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权威·核心·领先·实用·全面

Optimizationofthepeptidefromsilkwormpupaproteinbyenzymatichydrolysis

HUANGMei-jia1,2,CHENGJian-feng2,DAIYan2,YANGFan1,2,XUYu-juan3,ZOUYu-xiao3,LIXin1,2,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Department of Food Science,Nanchang University,Nanchang 330047,China; 3.Sericultural and Agri-Food Research Institute GAAS,Guangzhou 510610,China)

In order to reduce the risk of silkworm allergic reaction,to improve the use of high-quality protein and the preparation of immunoactive peptide,the enzymatic hydrolysis of silkworm pupa protein was optimized. For the preparation of immunoactive peptide,the five kinds of enzymes(bromelain,alkaline protease,neutral protease,flavourzyme,papain)were selected to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein. By the detection of spleen cell proliferation and the degree of hydrolysis,the optimal enzyme were determined. On the basis of that,the optimal condition was identified with four singe-factors of hydrolysis(E0/S0,pH,temperature and substrate concentration). The results showed that alkaline protease was the optimal enzyme and the optimum conditions of defatted silkworm pupa protein by alkaline protease enzyme was as that of the amount of enzyme=6.0%,temperature=55 ℃,enzymolysis time=2.00 h,pH=8.0,water∶substrate=20∶1.The degree of hydrolysis was 19.96%±1.02% and immunoreactive OD490 nmwas 0.2512±0.0125.

silkworm pupa protein;peptide;enzymatic hydrolysis;optimization

2017-04-11

黄美佳(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：食品科学与工程，E-mail:1049850344@qq.com。

*通讯作者:李欣(1980-)，女，博士，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail:zhizilixin@ncu.edu.cn。

2013年广东省教育部产学研专项资金(2013B090600060)；国家高技术研究发展计划(863计划)(2013AA102205)； 国家自然科学基金青年科学基金项目(31260204，31301522)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)23-0092-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.019