Mo6+对草鱼组织器官及抗氧化酶活性的影响

任洪涛，张春暖，林 霖

( 河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471003 )

Mo6+对草鱼组织器官及抗氧化酶活性的影响

任洪涛，张春暖，林 霖

( 河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471003 )

通过不同质量浓度Mo6+(0、30.67、122.66 mg/L)对(10.0±3.0) g草鱼幼鱼脑、肝脏、肾脏、心脏及性腺的组织学以及对肝胰脏抗氧化酶活性的影响，探讨了重金属Mo6+的毒性积累和毒性机制。结果表明，草鱼Mo6+中毒后，脑组织出现异常，表现为细胞破裂、细胞核聚集程度严重；肾脏充血，肾小管上皮细胞核肥大，肾小球明显萎缩；心脏肌纤维细胞体积增大，单位视野内细胞数变少，细胞核形态异常，以及局部的细胞空泡变性，出现少量细胞核偏移和密集并且细胞轮廓模糊，肌纤维有轻微断裂现象；肝脏的肝细胞出现严重的水样变性，伴随着细胞溶解、浑浊变性和轮廓模糊，血窦扩张，形成局部的点状病灶；卵巢中卵母细胞出现核变形，胞质中出现小的空泡，细胞核膨胀，扩张和核仁空泡化；精巢中生精小管畸形，含不同发育阶段的精原细胞、精母细胞、精子细胞，精细胞体积增大，精子数量明显减少。随着Mo6+质量浓度的升高和时间延长，草鱼肝胰脏中的超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量降低。

Mo6+; 草鱼; 组织器官; 抗氧化酶

鱼类是人类优质蛋白质的主要来源，我国是淡水鱼类人工养殖的主要国家，其养殖产量居于世界第一位。随着近年来工业生产的发展，大量含有过量重金属离子的工业废水流入水域中，使鱼类的生存水环境受到了严重污染，使鱼类的品质受到很大影响，严重威胁人类的健康[1]。钼是动物和人体的必需微量元素，Mo6+是黄嘌呤氧化酶、醛氧化酶、亚硫酸氧化酶等组成部分和活性中心，钼的生物学功能主要是通过这些酶体现，能提高动物的生产性能，促进动物生长[1]。但钼过量则会引起动物的中毒反应[2-3]。洛阳地区的淡水养殖环境受到钼金属影响较其他地区严重，因此，有必要深入研究钼对淡水鱼类的影响。草鱼(Ctenopharyngodonidellus)是我国的四大家鱼之一，是淡水养殖的主要种类之一，目前有关草鱼的研究主要集中在营养价值、转基因抗病、人工繁殖、疾病防治等方面，而对于养殖水环境重金属污染对草鱼毒性效应方面的研究较少。

养殖水环境中的Mo6+的毒性主要取决于在生物体内的吸收和积累，所以，研究在一定Mo6+含量和时间下，草鱼组织对Mo6+的吸收、积累的影响，有利于揭示鱼类对重金属离子的吸收、积累机制。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用草鱼鱼种取自洛阳市郊的鱼苗场，体格健壮，体长为(10.0±1.0) cm，体质量为(10.0±3.0) g。鱼种自养殖场运回来后驯养7 d再进行试验。试验在水族箱中进行。Mo6+由钼酸钠(Na2MoO4·2H2O，分析纯，上海化学试剂总厂生产)配制。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性试验

试验设为3组，对照组(0 mg/L)采用曝气后的自来水进行饲养，低质量浓度组(30.67 mg/L)和高质量浓度组(122.66 mg/L)。每组设3个重复。试验用鱼90尾。试验过程中，记录好试验开始的时间，随时观察桶内鱼苗的生活状况。

1.2.2 样品采集

及时捞出各个时间点各质量浓度下死亡的草鱼以及对照组的草鱼，取出脑、肝脏、肾脏、心脏及性腺组织，经生理盐水漂洗后，用波恩氏液固定，用各级乙醇逐级脱水、包埋、定位、切片、苏木精—伊红染色，显微观察并拍照。取部分肝胰脏装入1.5 mL EP管中并做好明确标记，置于冰箱中-20 ℃保存，最后采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)的方法测定肝胰脏组织中抗氧化物指标的活性。

1.3 数据的统计与分析

试验数据用平均值±标准差表示,用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析和Duncan氏检验法统计分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 Mo6+对草鱼幼鱼组织器官的影响

2.1.1 Mo6+对脑的影响

在显微镜下观察组织的石蜡切片，发现脑组织出现不同程度的异常(图1)。

由图1可见，对照组草鱼脑细胞完整，可以清晰地分辨出细胞轮廓，无异常；低质量浓度组Mo6+处理3 d时，脑细胞出现轻微异常，细胞核出现轻微的聚集状况；高质量浓度组Mo6+处理3 d时，草鱼脑细胞出现异常的程度更加严重，表现为脑组织间的腔隙变大。

2.1.2 Mo6+对肾脏的影响

在显微镜下观察组织的石蜡切片，发现肾脏组织出现不同程度的异常(图2)。

由图2可见，对照组的中肾组织无损伤，肾小体、肾小管结构正常；低质量浓度组Mo6+处理3 d时，出现了肾小管壁与周围组织间的腔隙变大，肾间组织充血，细胞结构不清晰；高质量浓度组Mo6+处理3 d时，肾间组织充血明显增大，且肾小管壁与周围组织间的腔隙明显变大。

2.1.3 Mo6+对心脏的影响

显微镜下观察组织的石蜡切片，发现心脏组织出现不同程度的异常(图3)。

图1 Mo6+对草鱼脑组织结构的影响a1：空白对照；a2：Mo6+ (30.67 mg/L)处理3 d；a3：Mo6+ (122.66 mg/L)处理3 d；×40；箭头示脑细胞异常与脑组织间隙增大.

图2 Mo6+对草鱼肾脏组织结构的影响a1：空白对照；a2：Mo6+ (30.67 mg/L)处理3 d；a3：Mo6+ (122.66 mg/L)处理3 d；×40；箭头示肾间组织充血与组织间的腔隙明显.

图3 Mo6+对草鱼心脏组织结构的影响a1：空白对照；a2：Mo6+ (30.67 mg/L)处理3 d；a3：Mo6+ (122.66 mg/L)处理3 d；×40；箭头示心脏细胞核密集与肌纤维有断裂现象.

由图3可见，对照组草鱼心脏肌纤维细胞核明显，纵横切面明显，闰盘清晰。低质量浓度组Mo6+处理3 d时，毛细血管增多，肌纤维细胞核出现偏移但不够明显，肌纤维有裂开痕迹，肌纤维细胞核有不同程度的缩小。高质量浓度组Mo6+处理3 d时，心脏显微结构可以看到肌纤维细胞体积增大，单位视野内细胞数变少，细胞核形态异常，以及局部的细胞空泡变性，出现少量细胞核偏移和密集并且细胞轮廓模糊，肌纤维有轻微断裂现象。

2.1.4 Mo6+对肝脏的影响

显微镜下观察肝组织的石蜡切片，发现肝脏组织出现不同程度的异常(图4)。

由图4可见，对照组草鱼肝细胞轮廓清晰，肝细胞排列整齐，肝血窦大小正常，未出现肝细胞核溶解和坏死；低质量浓度组Mo6+处理3 d时，肝细胞肿胀，细胞核肿大、偏移和溶解，并出现肝细胞空泡化，但依旧未出现细胞坏死；高质量浓度组Mo6+处理3 d时，肝细胞出现严重的水样变性，并且发现严重的血窦扩张，伴随着细胞溶解、浑浊变性和轮廓模糊，形成局部的点状病灶。

2.1.5 Mo6+对卵巢的影响

显微镜下观察组织的石蜡切片，发现卵巢组织出现不同程度的异常(图5)。

由图5可见，对照组草鱼卵巢轮廓清晰，卵母细胞排列整齐，未出现异常现象；低质量浓度组Mo6+处理3 d时，卵母细胞首先出现核变形，可见核周间隙增大，胞浆内出现空泡；高质量浓度组Mo6+处理3 d时，可见核周间隙增大，胞浆内出现空泡。

2.1.6 Mo6+对精巢的影响

显微镜下观察精巢组织发现，对照组精巢小叶结构清晰可见，小叶边缘为精原细胞，向内为胞囊包裹的精母细胞，中间小叶腔开阔，充满精子以及精子细胞；低质量浓度组Mo6+处理3 d时，初级精原细胞和初级精母细胞的比率增加，精子细胞和精子比率减小，小叶腔不明显，小叶边缘观察到强嗜碱性的固缩核，可见到整个精小囊中细胞正在被除去的现象；高质量浓度组Mo6+处理3 d时，精子数量明显减少，生精小管明显畸形，含不同发育阶段的精原细胞、精母细胞、精子细胞，精细胞体积增大(图6)。

图4 Mo6+对草鱼肝脏组织结构的影响a1：空白对照；a2：Mo6+ (30.67 mg/L)处理3d；a3：Mo6+ (122.66 mg/L)处理3d；×40；箭头示肝细胞肿胀，局部点状病灶.

图5 Mo6+对草鱼卵巢组织结构的影响a1：空白对照；a2：Mo6+ (30.67 mg/L)处理3 d；a3：Mo6+ (122.66 mg/L)处理3 d；×40；箭头示卵巢细胞间隙增大.

图6 Mo6+对草鱼精巢组织结构的影响a1：空白对照；a2：Mo6+ (30.67 mg/L)处理3 d；a3：Mo6+ (122.66 mg/L)处理3 d；×40；箭头示生精小管畸形.

2.2 Mo6+对草鱼抗氧化酶指标的影响

与对照组相比，3 d和6 d时，低质量浓度组(30.67 mg/L)草鱼肝胰脏超氧化物歧化酶的活性下降不显著(P>0.05)；高质量浓度组(122.66 mg/L)，3 d和6 d时草鱼肝胰脏超氧化物歧化酶活性下降显著(P<0.05)(图1)。同一质量浓度下，不同时间相比： 0、3 d和6 d时低质量浓度组(30.67 mg/L)与高质量浓度组(122.66 mg/L)草鱼肝胰脏超氧化物歧化酶活性差异显著(P<0.05)。

与对照组相比，3 d和6 d时，低质量浓度组(30.67 mg/L)草鱼肝胰脏丙二醛含量下降显著(P<0.05)；高质量浓度组(122.66 mg/L)，3 d和6 d时草鱼肝胰脏丙二醛含量下降显著(P<0.05)。同一质量浓度下，不同时间相比，0 d、3 d和6 d时低质量浓度组(30.67 mg/L)与高质量浓度组(122.66 mg/L)草鱼肝胰脏丙二醛含量差异显著(P<0.05)。

表1 不同质量浓度Mo6+对草鱼肝胰脏抗氧化酶指标的影响

注：同列肩标小写字母，不同表示差异显著(P<0.05)；同行肩标大写字母，不同表示差异显著(P<0.05)；字母相同表示差异不显著(P>0.05).

3 讨 论

3.1 Mo6+对草鱼组织器官的影响

钼是动物必需的微量元素，钼是黄嘌呤氧化酶、醛氧化酶、亚硫酸氧化酶等的重要组成部分和活性中心，其中黄嘌呤氧化酶对机体组织器官特别是肝脏有重要的保护作用，醛氧化酶的主要作用是维持动物机体正常生理代谢和生殖机能的正常运行，参与多种生理调节，将体内形成的有毒醛氧化为无毒酸，缓解醛类对机体的毒害作用，同时参与细胞内电子传递，在与代谢和繁殖相关的生理活动中起重要作用；另外钼对动物机体内的肝微粒体苯胺羟化酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、血清铜蓝蛋白、超氧化物歧化酶以及黄嘌呤氧化酶等这些含铜酶和含钼酶的活性均产生影响[4-7]。若机体摄入过多的钼，则会造成多种组织器官损伤[2-3]。本研究采用高质量浓度与低质量浓度的Mo6+溶液对草鱼的中毒反应发现，Mo6+对草鱼的组织器官皆造成一定程度的损伤。

重金属离子被鱼体组织吸收后，随血液循环到达各组织器官，妨碍组织细胞代谢过程而出现组织学的超微损伤[8]。大脑是重要的神经调节器官，机体感应外部环境的变化通过神经传导的方式传递到大脑组织，经大脑处理后，通过机体调节来适应环境变化。试验过程中观察到草鱼出现一系列异常行为，皆是由水中含有Mo6+而对草鱼的脑组织造成影响的外在表现。

肝脏是鱼类代谢和积累重金属离子的主要器官，肝脏对来自体内和体外的非营养性物质以及体内某些代谢产物，具有生物转化作用。通过新陈代谢将它们彻底分解或以原形排出体外。所以重金属对肝细胞结构的破坏无疑将影响到鱼类的代谢功能。本试验观察到肝细胞肿大、水样变性、细胞空泡化和细胞轮廓模糊，并且伴随着细胞核溶解偏移，非常明显的出现了点状病灶，说明肝脏受到了一定的损伤。这些组织病理学现象，在其他水体污染物对鱼类的毒性试验中也出现类似的结果，如鱼类在有机化合物胁迫下出现充血、血窦扩张及肝细胞空泡化[9-11]。

重金属对鱼类心脏损伤的研究较少。心脏是动物体中最重要的一个器官，是动物体血液循环的中枢，所以本试验对心脏作了组织切片进行了研究。草鱼在较高含量的Mo6+中，肌纤维细胞体积增大，单位视野内细胞数变少，细胞核形态异常，以及少量细胞核偏移和密集并且细胞轮廓模糊，肌纤维有轻微断裂现象。这与长江华溪蟹(Sinopotamonyangtsekense)受镉中毒[12]表现一致。

肾脏是动物的排泄器官，水生动物的新陈代谢产物通过肾脏排出体外，同时肾脏还能够调节体内渗透压和离子的平衡，因此肾脏损伤可以作为环境污染的良好指标[13]。本研究中，Mo6+对肾脏的主要影响为肾小管退化变性，即肾小管壁与周围组织间的腔隙变大，肾间组织充血，细胞结构不清晰，肾小管上皮细胞核肥大，肾小球明显萎缩。这与Mishra等[11]报道重铬酸钾对翠鳢(Channapunctata)肾脏损伤，Velmurugan等[14]报道高效氯氟氰菊酯对麦瑞加拉鲮(Cirrhinusmrigala)肾脏损伤，及陈秀荣等[15]报道氰戊菊酯对草鱼肾脏损伤一致。

本研究发现，Mo6+对草鱼的性腺也造成一定程度的损伤，卵巢的卵母细胞出现核变形，然后胞质中出现小的空泡，随后细胞核膨胀，扩张和核仁空泡化；精巢小叶间非细胞组成成分增多，初级精原细胞和初级精母细胞的比率增加，精子细胞和精子比率减小，小叶腔不明显，小叶边缘观察到强嗜碱性的固缩核，可见到整个精小囊中细胞正在被除去的现象。这与曹娜等[16]报道双酚A对斑马鱼(Daniorerio)的性腺及胡晓晴等[17]报道邻苯二甲酸二丁酯对斑马鱼的性腺影响一致。

3.2 Mo6+对草鱼肝胰脏抗氧化酶的影响

正常情况下，作为保护酶系统的重要组成部分，超氧化物歧化酶能维持体内活性氧产生和清除的动态平衡，从而防止自由基的毒害。而逆境条件则往往使细胞中活性氧产生增多或清除能力减弱，在这种情况下活性氧清除能力的高低也就成为生物抗逆境能力大小和能否在逆境中生存的关键。丙二醛是膜脂过氧化的终产物之一，其含量高低可以作为考察细胞受到胁迫严重程度的指标之一，它主要导致膜脂过氧化，损伤生物膜结构，主要是细胞质膜，使得细胞膜结构和功能上受到损伤，改变膜的通透性，从而影响一系列生理生化反应的正常进行。本试验中，随着Mo6+的质量浓度的升高及处理时间的延长，其超氧化物歧化酶及丙二醛含量开始下降，可能是因为高质量浓度的Mo6+影响了超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量，这与林霖等[18]研究高Mo6+对小鼠肾脏的影响结果一致，可能是高质量浓度的Mo6+对动物机体产生大量的活性氧，当活性氧的增加超过正常的歧化能力，过多的氧自由基就使细胞内多种功能膜及酶系统遭到不同程度的破坏，超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量受到抑制而下降[19-21]。

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EffectsofMolybdenumIononHistologicalStructureofTissueandOrgansandAntioxidantEnzymeActivityinGrassCarp

REN Hongtao, ZHANG Chunnuan, LIN Lin

( Animal Science and Technology College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003， China )

In the experiment, the influence of different concentrations (0，30.67 and 122.66 mg/L) of molybdenum ion on histological structure of brain, kidney, hepatopancreas, heart and gonads were studied in grass carp with body weight of some 10 g by a hydrostatic test to seek for the accumulation and toxicity mechanism of heavy metal. It was found that the brain cells were found to be expansion, discrete, nuclear reduction, and residual nuclear material scattered distribution in the grass carp exposed to Mo6+, thus leading to cell necrosis.Tubular degenerations，congestion，cloudy degeneration，hypertrophy of nuclei in the tubular epithelial cells，and glomerular atrophy were observed in the kidney tissues of fish after exposure．The liver cells showed degeneration, serious water-like and serious blood sinus expansion, accompanied by lysis, turbidity degeneration and contour fuzzy, forming local dot lesions. Cardiac muscle fibers had increased cell volume, and the unit cells were less in view, the nuclear shape, as well as the local cell vacuole degeneration, but a small deviations and the density and cell nucleus contour fuzzy, and muscle fibers had a slight fracture phenomenon. Oocyte nuclear deformation and small vacuoles appeared in the cytoplasm, nuclear expansion, and nucleolar vacuoles. Testis was significantly reduced in the number of sperm, born seminiferous tubule obvious deformity, including different development stages of spermatogonium, spermatocyte and sperm, and sperm cell volumes were increased. With the increase in Mo6+concentration and time, the activity of SOD and MDA content in the hepatopanceas of grass carp was decreased.

Mo6+；grass carp；tissue and organ；antioxidant enzyme

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.03.010

S965.112

A

1003-1111(2017)03-0317-06

2016-03-28；

2016-06-06.

河南科技大学科学研究基金资助项目(2014QN059)；河南科技大学博士科研启动基金资助项目(09001760)；河南科技大学教育教学改革项目(2013Y-003).

任洪涛(1977-)，男，讲师，博士；研究方向:水产动物分子生物学. E-mail:hthn2012@163.com.