鲑鱼肉和饲料中类胡萝卜素的分析方法

刘 洋，郝若伊，夏俪宁，潘锦锋

( 1.大连工业大学 食品学院，国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁 大连 116034；2.海洋食品教育部工程研究中心，辽宁 大连 116034 )

鲑鱼肉和饲料中类胡萝卜素的分析方法

刘 洋1,2，郝若伊1,2，夏俪宁1,2，潘锦锋1,2

( 1.大连工业大学 食品学院，国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁 大连 116034；2.海洋食品教育部工程研究中心，辽宁 大连 116034 )

鱼肉和饲料中的虾青素分析方法对于研究鲑鱼肉色质量及饲料对其影响至关重要。本研究建立了北极红点鲑鱼肉类胡萝卜素的正相高效液相色谱分析方法。该方法采用正己烷与异丙醇等度洗脱(93∶7，体积比)，流速 1.1 mL/min，可实现18 min内4种常见鲑鱼类胡萝卜素包括虾青素、角黄素、β-胡萝卜素和玉米黄素的有效分离。研究结果显示，虾青素的回收率和变异系数值分别为 97%和1.5%。正己烷和异丙醇复合溶剂提取的鱼肉样品与丙酮提取并经氨基固相萃取小柱纯化后的鱼肉样品的虾青素含量接近，但比丙酮提取样品中虾青素含量略低。正相高效液相色谱法和分光光度法测定鱼肉虾青素含量分别为1.43 mg/L和2.43 mg/L。研究同时建立了鲑鱼饲料虾青素分析方法。研究结果表明，-80 ℃冷冻结合氨基固相萃取小柱纯化可去除饲料样品中的大部分脂肪。饲料中虾青素酯皂化的最佳条件为：0.10 mol/L 甲基化氢氧化钠，22 ℃，20 min；或者0.12 mol/L甲基化氢氧化钠，4 ℃，3 h。研究结果表明，两种方法可用于鲑鱼肉和饲料中的虾青素分析，为相关研究带来方便。

鲑鱼；虾青素；高效液相色谱；皂化；固相萃取；分光光度计

鲑鱼肌肉颜色是鲑鱼质量的重要方面，鲑鱼肌肉的红色源于其沉积的类胡萝卜素，很多研究表明虾青素是其中最重要的一种[1-3]。不少鱼类营养研究专注于鲑鱼饲料对肉色的影响，而针对二者的快速有效的类胡萝卜素分析方法显得尤为重要。常用的类胡萝卜素分析方法有分光光度法和高效液相色谱法。前者简便易行，但测定结果不准确，准确定量还需依靠高效液相色谱法。目前，大部分类胡萝卜素的高效液相色谱法主要针对植物类样品，并且大都是反相高效液相色谱法，而有关动物组织类胡萝卜素的高效液相色谱测定法相对较少。

鲑鱼营养对肌肉品质影响相关研究往往同时关注鱼肉色素和脂肪酸组成的品质。由于类胡萝卜素是脂溶性色素，提取时易引入脂肪，在后期反相高效液相色谱分析中易引起分析柱堵塞。正己烷和异丙醇混合物对类胡萝卜素和脂肪都有较好的提取效果，且正己烷和异丙醇混合物通常用作正相高效液相色谱的流动相。若能实现虾青素的正相高效液相色谱分析，则正己烷和异丙醇混合物提取样品还可用于脂肪分析，这会给此类研究带来极大方便并降低成本。另一方面，近年来虾青素的高成本使得圆红酵母(Rhodosporidrumtoruloides)[4]、绿藻[5-6]、甲壳类[7-8]、磷虾[9]等新型资源受到鲑鱼养殖业的关注。这些原料中的虾青素多以虾青素酯的形式存在，其定量需采用酶或化学方式进行水解或皂化，而此过程易导致虾青素的氧化损失。同时，鲑鱼饲料脂肪含量高，会妨碍虾青素酯的皂化，因此需要优化脂肪去除方法和皂化反应条件，建立安全高效的虾青素酯水解方法。

本研究以北极红点鲑鱼(Salvelinusalpinus)和含有磷虾粉的鲑鱼饲料为研究对象，采用正相高效液相色谱法分析鲑鱼鱼肉虾青素，所得结果与反相高效液相色谱和分光光度法结果比较。进一步研究建立鲑鱼饲料的脂肪去除方法和虾青素酯皂化条件，建立一整套适合鲑鱼鱼肉和饲料的虾青素分析方法，为鲑鱼肌肉品质分析和饲料作用研究提供支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

北极红点鲑鱼(100±12) g和鲑鱼饲料均由瑞典农业科学大学Kälarne鱼站提供。虾青素标准品购于德国Dr. Ehrenstorfer公司，角黄素、β-胡萝卜素、玉米黄素标准品购于美国Fluka-Sigma公司。固相萃取小柱TELOS silica购于英国Kinesis公司，ISOLUTE NH2和ISOLUTE C18 购于英国International Sorbent Technology 公司。正己烷、丙酮、甲醇、异丙醇、氢氧化钠等试剂均由德国Merck公司提供。

1.2 试验仪器

分光光度计[UV-2401 (PC)，Shimadzu公司]；高效液相色谱(Merck-Hitachi公司)；离心机组织匀浆机(T25DS25 IKA公司)；Thermo Fisher冷冻离心机(赛默飞公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼肉和饲料中虾青素的提取

分别采用丙酮法与正己烷和异丙醇混合物法提取鲑鱼鱼肉中的虾青素。丙酮法如下：5 g鱼肉与40 mL丙酮匀浆3×30 s ，加入2 g 硫酸钠，振荡提取，离心5 min，取上清液，以上操作重复3次，直至丙酮提取液颜色不变，所得提取物用氮气吹干，并采用丙酮复溶。正己烷和异丙醇混合物法参考文献[10]方法。采用丙酮法提取饲料中虾青素酯，提取方法与鱼肉相同。

1.3.2 鱼肉中虾青素含量分析

分别采用分光光度法和高效液相色谱法分析鱼肉中虾青素含量。采用文献[11]中分光光度法分析总虾青素含量，测定样品在480 nm下吸光值。虾青素含量计算公式如下:

虾青素质量浓度/mg·L-1= 吸光值×10000/2100

式中，2100为虾青素溶于正己烷和异丙醇混合物的吸光常数(1%虾青素于1 cm比色杯中吸光值)，10000为稀释倍数。

采用正相高效液相色谱法分析正己烷和异丙醇混合物提取鱼肉虾青素样品，分离条件：Alltech SI 4.6×250 mm 5 μm 硅胶色谱柱；正己烷∶异丙醇(93∶7，体积比)流动相，1.1 mL/min等度洗脱；柱温40 ℃；上样量10 μL；测定波长480 nm。采用反相高效液相色谱法分析丙酮提取虾青素含量，方法参照文献[1]略作修改。分离条件: 反相色谱柱LiChrospher®100RP-18 (5 μm，250 mm×4 mm)；流动相甲醇∶水(94∶6，体积比)，0.5 mL/min等度洗脱；柱温、上样量同正相液谱法。以虾青素、角黄素、β-胡萝卜素、玉米黄素为标准品，采用峰面积与含量比例做标准曲线，计算样品虾青素含量。

1.3.3 样品脂肪去除

鱼肉和饲料的丙酮提取样品经-80 ℃ 冷冻30 min，取出于4 ℃，4000 r/min离心去除大部分脂肪。采用硅胶小柱，氨基小柱和C18小柱进一步去除脂肪。其中硅胶小柱和氨基小柱采用1∶1丙酮和正己烷混合液活化，上样后采用正己烷洗脱脂肪，再用1∶1丙酮甲醇混合液洗脱虾青素。C18 小柱则采用甲醇活化，再用1∶1的丙酮甲醇混合液洗脱虾青素。收集洗脱样品，氮气吹干，复溶于丙酮。

1.3.4 皂化反应

采用文献[12]方法，以甲基化氢氧化钠为皂化试剂对饲料样品中的虾青素酯进行皂化反应。考察22 ℃和4 ℃下，0.12、0.10、0.08、0.06 mol/L甲基化氢氧化钠的虾青素酯皂化反应动力学变化。采用上述正相高效液相色谱法测定皂化反应后样品中游离虾青素的含量，优化饲料样品虾青素酯的最佳皂化条件。

2 结 果

2.1 4种鲑鱼色素的正相高效液相色谱分析

β-胡萝卜素在2.3 min 出峰(峰1)，角黄素在5.4 min 出峰(峰 2)，虾青素在7.9 min出峰(峰3) ，玉米黄素在15.6 min 出峰(峰4)，整个分离过程正相高效液相色谱法在 18 min 内实现了4种色素的完全分离(图1a)。

2.2 提取方法对虾青素测定结果影响

正己烷和异丙醇混合物提取鱼肉样品和丙酮提取鱼肉样品的正相液谱法虾青素分离色谱图见图1b、1c，角黄素和虾青素的加标分离色谱图见图1e。结果表明，鲑鱼鱼肉中含有大量虾青素和少量β-胡萝卜素，在正己烷和异丙醇混合物提取鱼肉样品中还检测到极低含量的玉米黄素。丙酮提取鱼肉样品中虾青素含量略高于正己烷和异丙醇混合物提取鱼肉样品中虾青素含量(1.81 mg/L>1.43 mg/L) (图1b、1c，表1)。丙酮提取鱼肉样品经固相小柱纯化并采用反相高效液相色谱分析其中虾青素含量为1.52 mg/L，与正己烷和异丙醇混合物的正相高效液相色谱分析结果(1.43 mg/L)相近。

图1 标准品和样品的色素正相HPLC分析色谱图a，40 mg/L的虾青素、角黄素、β-胡萝卜素和玉米黄素混合标准品；b，正已烷和异丙醇混合物提取北极斑点鲑鱼肉色素；c，丙酮提取北极斑点鲑鱼肉色素；d，丙酮提取北极斑点鲑鱼肉色素样品的虾青素加标样(20 mg/L)；e，丙酮提取北极斑点鲑鱼肉色素样品的角黄素加标样(20 mg/L).峰1为β-胡萝卜素，峰2为角黄素，峰3为虾青素，峰4为玉米黄素.

注：HIPs为正己烷和异丙醇混合物提取鱼肉样品,ACEs为丙酮提取鱼肉样品，ACEs-SPE为丙酮提取鱼肉经固相小柱纯化样品，下同.

2.3 虾青素高效液相色谱法与分光光度法分析结果

采用加标回收法考察正相高效液相色谱法对虾青素和角黄素的分析精准度。结果显示，二者标准曲线(0.625，1.25，2.5，5.0，10.0 mg/L)具有良好的线性关系(r2>0.9993)。最低检出限(3倍空白信号)和最低定量限(10倍空白信号)分别为虾青素0.06 mg/L和0.2 mg/L，角黄素0.07 mg/L和0.2 mg/L。以鱼肉样品做加标回收试验，采用正相高效液相色谱和反相高效液相色谱(经小柱纯化)分析虾青素和角黄素含量(表2)，正相高效液相色谱法所得虾青素和角黄素回收率分别为97% 和96%，反相高效液相色谱法则为82%和77%。正相和反相高效液相色谱分析结果RSD值分别为虾青素1.5%、角黄素2.1%，虾青素1.4%、角黄素2.5%。不同提取方法和测定方法所得虾青素含量见表1。无论是分光光度法还是正相高效液相色谱法，测定的丙酮提取样品中虾青素含量均高于正己烷和异丙醇混合物与丙酮提取鱼肉经固相小柱纯化样品中虾青素含量，而正己烷和异丙醇混合物与丙酮提取鱼肉经固相小柱纯化样品分析结果无显著差异。丙酮提取鱼肉样品的虾青素正相高效液相色谱分析结果最高的，且所有高效液相色谱分析所得虾青素含量均低于分光光度法测定含量。

2.4 饲料样品脂肪的去除和虾青素酯皂化

饲料提取样品于-80 ℃放置30 min后离心所得脂肪沉淀(试管底部絮状物较多)，大部分脂肪被去除(图2)。采用固相小柱清除残留脂肪，第3道为NH2小柱处理样品的脂肪分布情况，其游离脂肪和甘油三酯含量比其他类型固相小柱处理样品低(图3)。

研究考察了皂化试剂甲醇化氢氧化钠于22 ℃和4 ℃下水解饲料样品虾青素酯的过程，分析皂化样品中游离虾青素含量随时间的变化规律。22 ℃下0.12、0.10、0.08 mol/L和0.06 mol/L氢氧化钠水解样品中虾青素质量浓度分别在20、25、30、40 min 时达到最高值，即17.0、18.1、18.0、16.2 mg/L(图4a)。随着水解时间的延长，虾青素质量浓度在120 min内降至起始质量浓度以下。4 ℃皂化(图4b)，氢氧化钠浓度为0.12 mol/L和0.10 mol/L 时样品虾青素最高质量浓度出现在3 h，分别是 15.0 mg/L和14.9 mg/L，而使用0.06 mol/L和0.08 mol/L氢氧化钠时样品最高质量浓度则出现在4 h 和7 h，质量浓度分别是14.4 mg/L和13.9 mg/L。虾青素质量浓度的ln[1-(x/CAE0)] 和皂化时间呈现良好的线性关系(图4c, 4d)。另外，22 ℃皂化所得虾青素质量浓度略高于4 ℃下皂化所得含量。

图2 饲料提取样品于-80 ℃放置30 min后离心所得脂肪沉淀

图3 不同固相小柱处理的样品脂肪薄层色谱图1道，标准品；2道，无固相小柱处理样品；3道，NH2 小柱处理样品；4道，C18小柱处理样品；5道，硅胶小柱处理样品.FAME，脂肪酸甲酯；TAG，甘油三酯；FFA，游离脂肪酸；CLR, 胆固醇.

图4 游离虾青素质量浓度在不同皂化温度下随时间变化的动力学分析a为22 ℃，b为4 ℃；不同浓度甲醇—氢氧化钠对虾青素皂化速率的一级动力学模型(n=3)；c为22 ℃，d为4 ℃.

3 讨 论

3.1 4种常见色素的正相高效液相色谱分析法

虾青素和角黄素是鲑鱼鱼肉中最常见的两种色素，但在Ando等[13-14]之前的鲑鱼色素研究中也发现有β-胡萝卜素、玉米黄素存在，因此本研究建立的正相高效液相色谱法涵盖了这4种色素。本研究正相高效液相色谱法中4种色素出峰顺序依次为β-胡萝卜素、角黄素、虾青素、玉米黄素，而Yuan等[15]采用C18 柱分离以上4种色素时出峰顺序为虾青素6.0 min、玉米黄素7.2 min、角黄素14.1 min、β-胡萝卜素44.0 min。正相高效液相色谱与反相高效液相色谱分离所用的流动相和柱子性质截然相反，虾青素和玉米黄素非极性较强，故在正相中容易被洗脱，而β-胡萝卜素、角黄素极性较弱，因而在反相色谱中较早被洗脱。已有的报道中反相高效液相色谱法分离虾青素的保留时间出现在3.0～8.3 min[1,16]，本文正相高效液相色谱法的虾青素保留时间为7.9 min，两种高效液相色谱法相近。但对整个分离过程，本文的正相高效液相色谱法18 min 内实现了4种色素的完全分离，目前所查询到的反相高效液相色谱法均需45 min以上[12,15]，可见本研究建立的鲑鱼色素正相高效液相色谱分析法时间更短，具有优势。

3.2 不同提取方法对虾青素测定结果的影响

本研究发现北极红点鲑鱼肉中含有的主要色素是虾青素和β-胡萝卜素，正己烷和异丙醇混合物提取样中发现有玉米黄素。鲑鱼鱼肉最重要的色素是虾青素、角黄素，其他类型色素较少见。由于鲑鱼自身不能合成以上色素，因此饲料是决定鱼肉色素种类的关键因素，对此很多研究已经证实[14,17]。本研究发现的胡萝卜素和玉米黄素可能来源于鲑鱼摄入饲料中的磷虾粉和贻贝粉，后二者摄食海洋中的藻类，可沉积各种类胡萝卜素。高效液相色谱法测定的丙酮提取鱼肉样品虾青素含量高于正己烷和异丙醇混合物提取鱼肉样品含量，分光光度法测定结果亦是如此，表明丙酮对虾青素的提取效果优于正己烷和异丙醇混合物。丙酮极性适中，常用于类胡萝卜素的提取，而正己烷和异丙醇混合物极性较强，常用于脂类提取，该结果符合提取溶剂的性质。值得注意的是，经固相小柱纯化后的丙酮提取样品采用反相高效液相色谱分析时，虾青素含量与正己烷和异丙醇混合物提取的样品的正相高效液相色谱分析结果相近，这表明，研究建立的正己烷和异丙醇混合物虾青素提取法结合正相高效液相色谱可以取代丙酮提取法和反相高效液相色谱法用于虾青素的提取与定量分析。如前所述，鲑鱼营养研究往往同时关注鱼肉色素和脂肪品质。采用丙酮提取类胡萝卜素易引入脂肪，引起反相色谱分析柱的堵塞。本研究中正己烷和异丙醇混合物提取虾青素样品实现了正相高效液相色谱分析，同时该正己烷和异丙醇混合物提取样品亦可用于脂肪分析，这给鲑鱼营养管理对肉质的影响相关研究带来了方便、降低了成本。

3.3 虾青素的正相和反相高效液相色谱与分光光度法比较

加标回收法的结果显示两种高效液相色谱分析法均具有良好的线性稳定性，RSD值则表明两种方法均具有良好精度，因此两种高效液相色谱法适用于虾青素的检测。最低检出限和最低定量限结果表明，两种高效液相色谱法对于虾青素的检测比角黄素更灵敏。鱼肉样品加标回收试验中正相高效液相色谱法的虾青素和角黄素回收率高于反相高效液相色谱法结果，这可能由于样品在小柱纯化过程中时间较长被氧化，也可能由于色素洗脱过程中未完全洗脱，导致结果偏低。可见正相高效液相色谱法操作简单，无需过多前处理步骤，可避免虾青素的损失风险。

分光光度法和正相高效液相色谱法测定的丙酮提取鱼肉样品虾青素含量均高于正己烷和异丙醇混合物提取鱼肉样品和丙酮提取鱼肉经固相小柱纯化样品结果。正己烷和异丙醇混合物常用于脂肪的提取，而丙酮则主要用于类胡萝卜素的提取，丙酮的提取效果略高于正己烷和异丙醇混合物，对此Yin等[18]已有报道。需要指出的是，丙酮提取鱼肉样品的虾青素正相高效液相色谱分析结果是所有分析样品中最高的，这证实固相小柱处理会导致部分虾青素的损失。另外，所有高效液相色谱分析结果均低于分光光度法测定结果，Li等[19]在雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)的虾青素含量测定中也发现了类似的结果。Young等[20]认为分光光度法测定结果包含了β-胡萝卜素、玉米黄素、叶绿素等非虾青素物质，不能代表虾青素的准确含量，精准测定仍需依靠高效液相色谱，本文研究结果与以上结论一致。

3.4 饲料中脂肪的去除和虾青素酯的皂化

Turchini等[21]总结了多种常见鲑鱼饲料的脂肪含量，发现鲑鱼饲料脂肪含量大都高于40%。陈兴才等[22]指出皂化反应是一个界面反应，高含量的脂肪会妨碍虾青素酯和酶或皂化试剂的接触，抑制皂化反应，因此皂化前需去除脂肪。本文结果表明，采用的-80 ℃低温冷冻结合离心法实现了大部分脂肪的去除。进一步采用固相小柱清除残余脂肪，发现氨基小柱对饲料样品的脂肪有较好清除效果。以上两种方法相结合去除脂肪方便可行，为后续水解皂化提供了良好条件。本研究所用鲑鱼饲料中引入了南极磷虾粉、贝类粉，该类虾青素资源多以酯的形式存在，因此采用皂化将其转为游离态才能被高效液相色谱准确测定。Goto等[23]指出虾青素具有紫罗酮和共轭双键结构，该结构的色素易被氧化。因此为避免皂化中的氧化损失，需对皂化条件进行优化。甲醇氢氧化钠是常用温和皂化试剂，Weissenberg等[24]报道该试剂可实现室温下叶绿素酯的安全皂化，Yuan等[12]随后采用甲醇化氢氧化钾进行了雨生红球藻中虾青素酯的皂化，取得了良好效果。笔者采用甲醇氢氧化钠对饲料中的虾青素酯进行皂化。4 ℃和22 ℃下虾青素含量达到最高峰时间随着碱浓度的增加而减少，4 ℃达到虾青素最高峰需要的时间远长于22 ℃所需时间，这表明碱的浓度和温度都显著影响了水解速度，浓度和温度越高，速度越快。虾青素含量在120 min和12 h后降低到了起始含量以下，表明长时间的皂化会导致虾青素的损失。22 ℃皂化所得虾青素含量略高于4 ℃下皂化所得含量，这可能是由于操作不均一性引起的。另外，虾青素含量的ln[1-(x/CAE0)] 和皂化时间呈现良好的线性关系(图4c, 4d)，表明虾青素酯的皂化反应符合一级动力学反应规律，该结果与Yuan等[12]的结论一致。综上结果可得虾青素的最佳皂化条件为：22 ℃下，碱浓度0.10 mol/L，皂化时间 20 min，或 4 ℃下，碱浓度0.12 mol/L，皂化时间3 h。

4 结 论

所建立的类胡萝卜素正相高效液相色谱法可实现18 min内β-胡萝卜素、角黄素、虾青素和玉米黄素的有效分离。采用正己烷和异丙醇混合物提取的鲑鱼肌肉样品可用于虾青素分析。深度冷冻和离心结合NH2固相小柱可去除饲料中脂肪。采用碱浓度0.10 mol/L，22 ℃皂化20 min，或者碱浓度0.12 mol/L，4 ℃皂化时间3 h 可保证饲料中虾青素酯的安全水解。本文建立的鲑鱼肌肉和饲料中虾青素提取、分离、皂化方法可实现二者虾青素的安全有效分析。

[1] Caballo C, Costi E M, Sicilia M D, et al. Determination of supplemental feeding needs for astaxanthin and canthaxanthin in salmonids by supramolecular solvent-based microextraction and liquid chromatography-UV/VIS spectroscopy[J]. Food Chemistry, 2012, 134(2):1244-1249.

[2] Bjerkeng B. Carotenoid pigmentation of salmonids—recent progress[G]//Cruz-Suarez L E, Ricque-Marie D, Tapia-Salazar M, et al. Avances en Nutricion Acuicola, Nuevo Leon: Internacional de Nutrición Acuícola, 2000:71-89.

[3] 赵樑，王锡昌，吴旭干.饲料中虾青素对水产动物品质影响的研究进展[J]. 水产科学, 2016,35(4):440-445.

[4] Schmidt I, Schewe H, Gassel S, et al. Biotechnological production of astaxanthin withPhaffiarhodozyma/Xanthophyllomycesdendrorhous[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 89(3):555-571.

[5] Wang J, Han D, Sommerfeld M, et al. Effect of initial biomass density on growth and astaxanthin production ofHaematococcuspluvialisin an outdoor photobioreactor[J]. Journal of Applied Phycology, 2013, 25(1):253-260.

[6] 孟春晓，高政权，王依涛，等.影响雨生红球藻中虾青素积累条件的研究进展[J]. 水产科学, 2011, 30(2):118-121.

[7] López M, Arce L, Garrido J, et al. Selective extraction of astaxanthin from crustaceans by use of supercritical carbon dioxide[J]. Talanta, 2004, 64(3):726-731.

[8] Franco-Zavaleta M E, Jiménez-Pichardo R, Tomasini-Campocosio A, et al. Astaxanthin extraction from shrimp wastes and its stability in 2 model systems[J]. Journal of Food Science, 2010, 75(5):394-399.

[9] Arai S, Mori T, Miki W, et al. Pigmentation of juvenile coho salmon with carotenoid oil extracted from Antarctic krill[J]. Aquaculture, 1987, 66(3/4):255-264.

[10] Trattner S, Kamal-Eldin A, Brännäs E, et al. Sesamin supplementation increases white muscle docosahexaenoic acid (DHA) levels in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) fed high alpha-linolenic acid (ALA) containing vegetable oil: metabolic actions[J]. Lipids, 2008, 43(11):989-997.

[11] Tolasa S, Cakli S, Ostermeyer U. Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid[J]. European Food Research and Technology, 2005, 221(6):787-791.

[12] Yuan J P, Chen F. Hydrolysis kinetics of astaxanthin esters and stability of astaxanthin ofHaematococcuspluvialisduring saponification[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 47(1):31-35.

[13] Ando S, Osada K, Hatano M, et al. Comparison of carotenoids in muscle and ovary from four genera of salmonid fishes[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry, 1989, 93(3):503-508.

[14] Torrissen O J, Hardy R W, Shearer K D. Pigmentation of salmonids-carotenoid deposition and metabolism[J]. Reviews in Aquatic Science, 1989, 1(2):209-225.

[15] Yuan J P, Chen F, Liu X, et al. Carotenoid composition in the green microalgaChlorococcum[J]. Food Chemistry, 2002, 76(3):319-325.

[16] Peng J, Xiang W, Tang Q, et al. Comparative analysis of astaxanthin and its esters in the mutant E1 ofHaematococcuspluvialisand other green algae by HPLC with a C30 column[J]. Science In China Series C—Life Sciences, 2008, 51(12):1108-1115.

[17] 张娟娟, 李小勤, 冷向军, 等. 虾青素在虹鳟体内的沉积与降解研究[J]. 水产学报, 2012, 36(12):1872-1879.

[18] Yin C, Yang S, Liu X, et al. Efficient extraction of astaxanthin fromPhaffiarhodozymawith polar and non-polar solvents after acid washing[J]. China Journal of Chemical Engineering, 2013, 21(7):776-780.

[19] Li Y, Miao F, Geng Y, et al. Accurate quantification of astaxanthin fromHaematococcuscrude extract spectrophotometrically[J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2012, 30(4):627-637.

[20] Young A J, Britton G. Carotenoids in Photosynthesis [M]. Berlin: Springer Netherlands, 1993:409-457.

[21] Turchini G M, Torstensen B E, Ng W K. Fish oil replacement in finfish nutrition[J]. Reviews in Aquaculture, 2009, 1(1):10-57.

[22] 陈兴才, 黄伟光, 欧阳琴. 雨生红球藻中虾青素酯的皂化及游离虾青素的纯化分离[J]. 福州大学学报：自然科学版, 2005, 33(2):264-277.

[23] Goto S, Kogure K, Abe K, et al. Efficient radical trapping at the surface and inside the phospholipid membrane is responsible for highly potent antiperoxidative activity of the carotenoid astaxanthin[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)—Biomembranes, 2001, 1512(2):251-258.

[24] Weissenberg M, Schaeffler I, Menagem E, et al. Isocratic non-aqueous reversed-phase high-performance liquid chromatographic separation of capsanthin and capsorubin in red peppers (CapsicumannuumL.), paprika and oleoresin[J]. Journal of Chromatography A, 1997, 757(1/2):89-95.

AnalysisMethodsofCarotenoidsinMuscleandFeedinSalmonids

LIU Yang1,2, HAO Ruoyi1,2, XIA Lining1,2, PAN Jinfeng1,2

( 1.National Engineering Research Center of Seafood, School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China; 2. Engineering Research Center for Marine Food, Ministry of Education, Dalian 116034, China )

The carotenoind content in muscle and feed of Arctic charr (Salvelinusalpinus) was analyzed by normal-phase and revers-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) as well as spectrometric method. Muscle sample extracted by hexane: isopropanol (HIP) or acetone was detected for astaxanthin (AST) contents by the methods above. Results showed that a good separation of AST, canthaxanthin (CAN), β-carotene and lutein was achieved in 18 min by a normal-phase high-performance liquid chromatography (NHPLC) method, isocratic elution with hexane: isopropanol (HIP) (93:7,V/V) as mobile phase at a flow rate of 1.1 mL/min. Average AST recovery of 97% and AST coefficient value (CV) 1.5% were observed in fish muscle samples by NHPLC method. By the method, HIP-extraction showed similar muscular AST content (1.43 mg/L) to acetone-extracted sample cleaned with NH2-SPE column (ACEs-SPE) (1.60 mg/L), slightly lower than that in acetone-extracted sample (ACEs, 1.81 mg/L). It was found that the NPLHC method combined with HIP extraction was used to substitute the RHPLC and acetone extraction for AST in salmonids muscle, which brings many conveniences to lipid measurement as well. However, AST content analyzed by NHPLC (1.43 mg/L) was lower than that by spectrophotometric method (2.43 mg/L). For feed including algae, crustaceans and krill, AST appears as ester style requires a saponification reaction before measurement, and this usually is inhibited by the high content of lipid in feed. The study succeeded in using deep freezing coupled with NH2-SPE column treatment for removal of most fat and in establishment of optimal saponifcaition condition. There was the maximal AST content in 20 min saponifizion with 0.10 mol/L methic NaOH at 22 ℃ or 3 h and with 0.12 mol/L methic NaOH at 4 ℃. The findings suggest that two systematic methods involving sample extraction, fat removing and NHPLC method could be used for AST analysis in salmonid muscle and feed.

salmon; astaxanthin; HPLC; saponification; solid-phase extraction; spectrophotometer

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.03.004

S986

A

1003-1111(2017)03-0274-08

2016-07-01；

2016-09-06.

国家科技支撑计划项目(2014BAD04B09).

刘洋(1989-)，女，硕士研究生；研究方向：水产品加工. E-mail：1239015238@qq.com.通讯作者： 潘锦锋(1984-)，男，副教授，博士；研究方向：水产品加工理论与技术.E-mail：pjf613@163.com.