猪蛔虫GST蛋白编码基因克隆及序列分析

吴 飞，边青青，王 丹，邹 勇，胡雄峰，任世斌，芮 聪，李 坤，杨 莹，林 青*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.商洛市动物疫病预防控制中心，陕西商洛 726000)

猪蛔虫GST蛋白编码基因克隆及序列分析

吴 飞1，边青青2，王 丹1，邹 勇1，胡雄峰1，任世斌1，芮 聪1，李 坤1，杨 莹1，林 青1*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.商洛市动物疫病预防控制中心，陕西商洛 726000)

为预测并分析猪蛔虫(Ascarissuum)谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)蛋白编码基因的结构特征及其B细胞抗原表位，采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增猪蛔虫GST蛋白编码序列(coding sequence，CDS)，将纯化的DNA与pMD19-T载体连接并转化入JM109感受态细胞，并将阳性菌液测序后进行序列分析、结构预测和抗原表位预测。结果表明，获得的猪蛔虫GST蛋白CDS序列与参考基因(Y10613.1)相比，在第243和248位核苷酸处发生变异，并导致第83位氨基酸由甲硫氨酸(Met)变异为苏氨酸(Thr)；其优势B细胞抗原表位可能位于肽段29-38、43-47、80-87、114-120、129-131、143-145、190-194、201-204区域内或附近，其中最可能位于肽段43-46和201-204区域内或附近。研究结果为猪蛔虫基因工程疫苗的研发奠定了理论基础，同时为后续猪蛔虫GST基因功能和耐药相关性研究提供了基础资料。

猪蛔虫；GST基因；克隆；序列分析；猪

猪蛔虫病(Swine ascariasis)是由猪蛔虫(Ascarissuum)寄生在猪小肠而引起的一种寄生线虫病。虽然人与猪的蛔虫是否属于同一个种，目前还存在争议[1]，但据有关报道称，二者存在交叉感染现象，属于人兽共患寄生虫病[2-4]。猪蛔虫病呈全球性分布，感染普遍，无论是集约化饲养或是散养的猪均极易感染发病，造成地方性流行。感染本病的猪生长发育不良，饲料回报率低[5]，是造成“僵猪”的主要原因之一，给养猪业造成重大经济损失，严重制约我国养猪业的发展。基于有关资料报道和笔者近几年的调查结果发现，我国的猪蛔虫感染率为13%～80%，远高于北欧国家[6]。目前，由于临床上没有可使用的猪蛔虫病疫苗，药物预防仍是控制猪蛔虫病的有效方法之一。然而，过度依赖抗寄生虫药物，在短期内虽能达到降低寄生虫感染率、提高猪生产性能的目的，但必然会导致耐药虫株的出现，给猪蛔虫病的防治带来新的挑战。故而，寻找新的疫苗及药物靶位基因显得极为重要。

GST是机体内重要的解毒物质，它可以催化亲核性的谷胱甘肽和亲电性的外源化学物结合以阻止化学物与细胞生物大分子重要成分发生共价结合，从而起到解毒作用[7]。大量研究表明，GST在多种生物体内都有表达，且对干旱、药物等环境胁迫具有一定抗性作用[8-12]。另有国内学者研究发现，肝片吸虫和猪蛔虫GST免疫小鼠对日本血吸虫尾蚴攻击感染有明显的抵抗力[13]。因此，GST极有可能是猪蛔虫一个理想的疫苗候选基因或是一个重要的药物靶位。

目前，对部分生物和寄生虫GST的研究已取得了一定的进展，但对猪蛔虫GST结构和功能的研究相对不足，尤其是GST在猪蛔虫耐药性形成和入侵过程中可能扮演的角色和作用机制方面尚未明确。本研究拟通过分子生物学技术克隆猪蛔虫GST蛋白编码基因序列，利用生物信息学手段分析其序列并预测其结构和抗原表位，旨在为深入研究猪蛔虫GST的功能及分析其作为疫苗候选基因和药物靶位的可行性奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫株 本研究中所用猪蛔虫采自于陕西扶风成年猪小肠。

1.1.2 主要试剂 胶回收试剂盒TIANgel Midi Purification Kit购于天根生化科技(北京)有限公司；Trizol裂解液购于北京康为世纪生物科技有限公司；感受态细胞JM109、pMD19-T Vector、rTaq酶、PCR试剂(Buffer、MgCl2、dNTPs)、DNA Ladder Marker DL 2000及PrimeScriptTMRT Reagent Kit试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司；三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇等试剂均为国产分析纯。

1.1.3 分析软件 序列分析软件Lasergene 由实验室提供；NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)系在线共享网络平台。

1.2 方法

1.2.1 虫体总RNA提取与验证 无菌条件下剪取50 mg～100 mg虫体活组织，剪碎后置于灭菌研钵中充分研磨；加入含1 mL Trizol裂解液的RNase Free离心管中，充分摇匀；匀浆样品室温(16℃～30℃)静置5 min；加入200 μL氯仿，振荡15 s，室温静置3 min；4℃、10 000 r/min 离心15 min；吸取上清液并加入等体积异丙醇(约500 μL)，轻轻混匀后室温静置10 min；4℃、10 000 r/min 离心10 min；弃上清液并加入1 mL 750 mL/L乙醇，轻轻颠倒洗涤沉淀；4℃、7 500 r/min 离心5 min；弃上清液室温干燥5 min～10 min；加入30 μL DEPC水充分溶解RNA；取5 μL进行凝胶电泳验证，其余RNA置-80℃保存。

1.2.2 总RNA的反转录 在0.2 mL RNase Free PCR管中加入DEPC水5.5 μL，5×Prime Script buffer 2 μL，OligodT 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，总RNA 1 μL，共计10 μL，混匀后瞬时离心，以37℃ 15 min，85℃ 5 s的程序在PCR仪上进行反转录，产物保存于-20℃。

1.2.3 目的基因的扩增 本研究所用引物根据GenBank登录号为：Y10613.1 的猪蛔虫GST蛋白CDS序列设计，并由上海英骏生物技术有限公司合成(F：5′-ATGCCGCAGTACAAGCTC-3′，R：5′-CTAATATGGCGTCTTCGG-3′)。以反转录产物cDNA为模板，按下述体系和程序扩增目的基因CDS区域，体系：ddH2O 15.375 μL，10×buffer 2.5 μL，Mg2+2 μL，dNTPs 2 μL，rTaq酶0.125 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，共计25 μL；程序：95℃ 5 min；94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃ 10 min。

1.2.4 目的基因的克隆与鉴定 PCR产物经凝胶电泳后按TIANgel Midi Purification Kit操作说明进行胶回收，回收产物按照说明书体系用PCR仪16 ℃ 12 h连接到pMD19-T载体上，连接产物转化到JM109感受态细胞中，摇床上37℃摇2 h后涂布到含氨苄青霉素(100 mg/L)的平板上，随后置于37℃恒温培养箱中培养12 h，取出平板挑取单个菌落接种到含氨苄青霉素的LB培养液中37℃摇12 h后收取菌液，菌液PCR产物经凝胶电泳鉴定后，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.5 序列分析、结构预测及B细胞抗原表位预测 用Lasegene对测序所获得的猪蛔虫GST基因CDS序列进行序列分析[14]；采用Garnier-Robson和Chou-fasman方法预测GST蛋白的二级结构；运用SWISS-MODEL在线服务器预测GST蛋白的三级结构；使用Karplus-Schulz、Kyte-Doolittle、Jameson-Wolf和Emini等方法分别预测GST蛋白的柔韧性、亲水性、抗原指数和表面可能性，以综合分析预测B细胞抗原表位。

2 结果

2.1 总RNA提取效果及菌液PCR结果

总RNA提取凝胶电泳验证结果可见有3个完整的RNA条带，证明RNA提取效果较理想(图1)。菌液PCR产物的凝胶电泳结果也表明在目的条带大小处有一条特异性条带(图2)，证明目的基因扩增成功，可以送往测序公司进行序列测定。

1.猪蛔虫总RNA1.The total RNA of Ascaris suum

M.DNA 标准DL 2 000 ； A.GST基因菌液PCR产物

M.DNA Marker DL 2 000; A.Bacterial liquid PCR products of GST gene

图2菌液PCR产物凝胶电泳

Fig.2 Agarose gel electphoresis of bacterial liquid PCR products

2.2 GST基因CDS序列测定及分析

2.2.1 核苷酸序列分析 测定的GST基因CDS序列经Lasergene分析表明，GST基因CDS序列长度为621 bp，四种核苷酸含量相当，碱基A、G、T、C分别含有164个、171个、134个、152个。A+T共298个占47.99%，而C+G共323个占52.01%，两者含量也十分相近。但特别要指出的是，通过与参考猪蛔虫GST基因(Y10613.1)比较得知，本研究从陕西扶风分离到的猪蛔虫在编码区第243和248位核苷酸发生变异，前者由G变异为A，后者由T变异为C(图3)，这导致编码的第83位氨基酸由甲硫氨酸(Met)变异为苏氨酸(Thr)。

图3 陕西扶风分离的猪蛔虫GST蛋白编码基因与参考基因的比对结果

2.2.2 氨基酸序列分析 根据测定序列推导得到的氨基酸序列通过Lasergene分析表明，GST基因CDS序列全长为206个氨基酸(不含信号肽)，分子质量为23555.21 D，等电点为7.385，其中碱性氨基酸(K，R)和酸性氨基酸(D，E)均有30个，占总体氨基酸数目的14.56%，亲水性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)有34个，占16.50%，而疏水性氨基酸(A，I，L，F，W，V)有78个之多，占总体37.86%。

2.2.3 氨基酸序列相似性比较 陕西扶风分离的猪蛔虫GST蛋白编码基因与猪蛔虫参考GST蛋白编码基因(登录号：CAA71620)、人蛔虫GST蛋白编码基因(登录号：4Q5F)、西氏贝蛔虫GST蛋白编码基因(登录号：AJH66211)、犬弓首蛔虫GST蛋白编码基因(登录号：KHN74035)氨基酸序列相似性分别为99.5%、99.5%、91.7%和77.2%。另外，由图可见，猪蛔虫参考GST蛋白编码基因与人蛔虫GST蛋白编码基因氨基酸序列同源性达100%(图4)。

2.3 GST蛋白的结构预测

2.3.1 二级结构预测 Garnier-Robson和Chou-Fasman方法预测结果显示，α 螺旋、β 折叠、β 转角分别有8个、4个、7个和10个、4个、14个(图5)，其具体分布位置及所占比例如表1所示。且Garnier-Robson方法预测的无规则卷曲有9个(图5)，其分布见表1。两种预测方法结果显示，α 螺旋最多，β 折叠和无规则卷曲相对较少，但GST蛋白二级结构整体含量较高，几乎涵盖整个序列。

2.3.2 三级结构预测 将猪蛔虫GST蛋白氨基酸序列输入SWISS-MODEL预测网站中，可以观测到其3D结构(图6)。由图可知，其3D结构中含有多个转角和随机扭曲结构，这些结构可能在其行使生物学功能过程中发挥重要作用。该预测是以人蛔虫(Ascarislumbricoides)GST蛋白(登录号：4Q5F)为参照，且两者之间序列相似性达到99.51%，结构上也基本相同。

图4 GST蛋白编码基因氨基酸序列相似性比较

图5 GST蛋白编码基因的不同参数预测

预测参数Predictiveparameters预测方法Predictionmethod预测位置Predictedposition百分比/%Percentageα-螺旋Alpha-helixGarnier-Robson1-5,16-25,27-42,53-67,83-149,151-170,172,174-20077.78Chou-Fasman14-29,34-44,50-55,60-68,85-102,107-113,118-141,165-168,179-190,195-20255.56β-折叠Beta-sheetGarnier-Robson6-11,68-70,75,2075.31Chou-Fasman6-9,64-75,146-149,154-16013.04β-转角Beta-turnGarnier-Robson44-45,47-49,71-74,150,173,202-203,206-2077.25Chou-Fasman2-5,10-13,30-33,46-49,56-59,81-84,103-106,114-117,142-145,150-153,161-164,175-178,191-194,204-20727.05无规则卷曲Ran-domcoilGarnier-Robson12-15,26,43,46,50-52,76-82,171,201,204-20510.14柔韧性FlexibilityKarplus-Schulz13-18,29-38,43-49,56-59,79-87,94-96,113-122,129-131,141-146,151-152,172-173,175,190-196,201-20435.75亲水性(≥0)Hydro-philicityKyte-Doolittle1-9,12-16,20,26-49,59,61,66,69-73,76-78,80-94,96-101,103,113-121,126-135,140-150,153-154,164-166,169-170,176,179-194,196-20765.70抗原指数(≥0)An-tigenicindexJameson-Wolf2-4,10-18,27-50,55-60,71-72,76-88,90-91,94-96,98-100,102-106,112-122,124-135,139-145,148-151,153-154,160,162-165,171,173,175,180,183-194,197-20766.67表面可能性(≥1)SurfaceprobabilityEmini1-7,9,29-38,40,42-47,70-71,80-87,94-95,98,114-120,128-132,139,143-145,180-184,188-194,197-198,200-20736.71合计*Total*29-38,43-47,80-87,114-120,129-131,143-145,190-194,201-20421.74

注：* 合计是根据的柔韧性、亲水性、抗原指数和表面可能性预测的最可能B细胞抗原表位。

Note:* The most likely B cell epitopes predicted based on flexibility,hydrophilicity,antigenic index and surface probability.

图6 GST蛋白三级结构预测

2.4 GST蛋白B细胞抗原表位预测

综合B细胞抗原表位的4个主要参数(柔韧性、亲水性、抗原指数和表面可能性)的预测结果可知，虽然由于不同参数预测的表位存在些许差异，但肽段29-38、43-47、80-87、114-120、129-131、143-145、190-194、201-204是各个方法都认可的B细胞抗原表位(表1)，故而，猪蛔虫GST蛋白的优势抗原表位最可能处于这些肽段内或其附近。

3 讨论

猪蛔虫泛滥不仅会给养猪业造成重大的经济损失，其感染性幼虫还可在人体肝脏、肺脏等组织中生长，导致眼幼虫移行症和内脏幼虫移行症，造成各个器官和组织损伤和出血，引起患者发热、腹痛、咳嗽、视力障碍甚至失明等症状[15-16]，是一种重要的人兽共患寄生虫病。本研究通过分子生物学及生物信息学手段对猪蛔虫GST蛋白编码基因进行研究，结果表明，本次从陕西扶风分离到的猪蛔虫GST蛋白编码基因序列与参考序列(登录号：CAA71620)和人蛔虫GST蛋白编码基因(登录号：4Q5F)氨基酸序列相似性较高(图4)，三级结构预测结果也显示其与人蛔虫GST蛋白编码基因(登录号：4Q5F)结构基本相同，这说明GST在猪蛔虫和人蛔虫中可能行使着相似的功能，同时也预示着猪蛔虫与人蛔虫种群亲缘关系较近，可能是同一个物种寄生于不同的宿主而已。值得一提的是，通过与参考序列(登录号：CAA71620)进行核苷酸和氨基酸序列比对分析发现，陕西扶风分离到的猪蛔虫在GST蛋白编码基因的第243和248位核苷酸发生变异(图3)，并导致编码的第83位氨基酸发生改变(Met→Thr)，这种变化有可能是长期的环境胁迫如药物或是地理位置及气候因素造成的适应性改变，故而，其突变是否改变了其功能或是与耐药有关还有待进一步深入研究。

另外，对猪蛔虫GST蛋白编码的二级结构预测发现，其α螺旋和β折叠的区域较多，这有利于蛋白质结构的稳定，却不适宜作为抗原表位。但有报道称，除了柔韧性、亲水性、抗原指数和表面可能性这4个B细胞抗原表位的主要参数外，β转角和无规则卷曲因其较松散易于发生扭曲，盘旋并展示在蛋白表面而对抗原表位有很大的影响[17]。因此，蛋白质二级结构中β转角和无规则卷曲是B细胞抗原表位预测的另一重要参数，本研究综合以上参数预测得知，猪蛔虫GST蛋白优势抗原最可能出现在肽段43-46和201-204区域内或附近，该表位预测结果将为进一步研究制备猪蛔虫基因工程疫苗提供理论依据。

综上所述，本研究不仅分析了陕西扶风分离的猪蛔虫GST蛋白编码基因序列信息，还综合预测了其优势抗原表位，为进一步深入研究猪蛔虫GST的功能及其作为疫苗候选基因和药物靶位的基因工程疫苗研制和耐药相关性研究奠定了理论基础。

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CloningandSequenceAnalysisofAscarissuumGSTProtein-codingGene

WU Fei1,BIAN Qing-qing1,WANG Dan1，ZOU Yong1，HU Xiong-feng1，REN Shi-bin1,RUI Cong1,LI Kun1,YANG Ying1,LIN Qing1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China；2.ShangluoCityAnimalDiseaseControlCenter,Shangzhou,Shaanxi,726000,China)

In order to predict and analyze the structure characteristics and B cell antigenic epitopes ofAscarissuumglutathione S-transferase (GST) protein-coding genes,A.suumGST protein-coding gene was amplified by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) technology,followed by cloning the purified DNA products into pMD19-T vector and transforming into JM109 competent cells,and then positive bacterium liquid was sent to sequence.After that,the obtained sequence was analyzed,the structure and antigenic epitopes were predicted by bioinformatics methods.The result showed that GST protein-coding gene ofA.suummutated in 243 and 248 nucleotides,which result in the 83thamino acid turned into threonine from methionine comparing to the reference gene (Y10613).And the dominant B cell antigenic epitopes were located in sections 29-38,43-47,80-87,114-120,129-131,143-145,190-194,201-204 or the adjacent area,particularly in sections 43-46 and 201-204.These results will provide theoretical evidence for the development ofA.suumgenetically engineered vaccine and the subsequent studies onA.suumGST gene function and drug-resistance correlation.

Ascarissuum; GST gene; cloning; sequence analysis; pig

2017-03-31

国家级大学生创新创业训练计划项目(201610712020)

吴 飞(1992-)，男，安徽宣城人，硕士研究生，主要从事动物疫病防治研究。*

S852.731

A

1007-5038(2017)11-0042-06