QuEChERS-高效液相色谱法检测牛肉中的阿维菌素类药物残留

张 伟，舒均喜，郑 妍，李 存

(天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384)

QuEChERS-高效液相色谱法检测牛肉中的阿维菌素类药物残留

张 伟，舒均喜，郑 妍，李 存1*

(天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384)

旨在建立牛肉组织中阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和甲氨基阿维菌素等4种阿维菌素类药物残留的QuEChERS-高效液相色谱检测方法。牛肉组织样品搅碎后，乙腈两次提取，QuEChERS净化，氮气吹干，含1-甲基咪唑和三氟乙酸酐的乙腈溶液衍生化，高效液相色谱-荧光检测器检测(激发波长365 nm，发射波长475 nm)。在0.1 μg/mL～2 μg/mL范围内4种药物均呈线性相关，相关系数大于0.999。检测限为2 μg/kg(S/N=3)，当添加浓度为2、10、40 μg/kg时，4种药物的平均回收率在77.3%～97.2%，日内相对标准偏差为2.05%～4.91%(n=5)，日间相对标准偏差为0.27%～1.64%(n=3)。建立的方法简便、灵敏、高效、安全，可用于动物组织中阿维菌素类药物残留的检测。

阿维菌素类药物；QuEChERS；高效液相色谱；多残留检测

阿维菌素类药物(avermectins，AVMs)是由阿维链霉菌产生的大环内酯类抗生素，是良好的杀虫剂[1]，对动物体内和体外节肢动物都有高效的驱杀作用，作为农药和兽药均使用广泛[2]。但阿维菌素类药物具有神经和发育毒性，在动物组织中残留时间较长，因此检测此类药物的残留至关重要。目前WHO将其列为高毒物质，其残留问题引起了很多国家极大关注[3]，我国农业部规定在牛、羊的肝、肾、肌肉、脂肪等组织中阿维菌素、伊维菌素和多拉菌素的最高残留限量，其中阿维菌素在牛肉中最高残留限量为100 μg/kg，伊维菌素或多拉菌素在牛肉中最高残留限量为10 μg/kg[4]。

动物组织成分复杂，前处理起到去除杂质、净化样品的作用，是仪器分析的前提，也是兽药残留分析的关键。前处理方法主要有固相萃取[5-6]、液相萃取[6-7]、免疫亲和色谱萃取[8]等方法，固相萃取和液相萃取使用大量有机试剂，污染环境；免疫亲和色谱需要特异性抗体，而抗体的制作费事费力，且净化范围有限。

QuEChERS即quick、easy、cheap、effective、rugged。QuEChERS样品净化是基于分散固相萃取建立起来的一种净化方法，具有快速、简单、便宜、高效、耐用和安全的特点[9]。通常含有提取剂乙腈、丙酮、乙酸乙酯或缓冲液等，脱水剂无水NaCl或无水MgSO4和净化剂PSA(乙二胺-N-丙基)、C18等。作为药物残留的前处理方法，QuEChERS有机试剂应用少，环境友好；特异性不强，可作为多类药物的净化方法[10-11]；处理时间短，能在30 min～40 min净化10～20个样品；操作简便，无需高技能便可完成等优点。本试验采用QuEChERS对待检牛肉组织样品净化后，进行牛肉样品中阿维菌素类药物残留的液相色谱检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器设备 高效液相色谱仪配荧光检测器(Agilent-1260)为安捷伦科技有限公司产品；氮吹仪(DC-12)为上海安谱实验科技股份有限公司产品；微型漩涡混合仪(WH-2)为上海沪西分析仪器厂产品；恒温水浴锅(DC-12H)为上海安谱实验科技股份有限公司产品。

1.1.2 主要药品试剂 阿维菌素(abamectin)，伊维菌素(ivermectin)，多拉菌素(doramectin)，甲氨基阿维菌素(emamectin benzoate)均为美国Sigma-Alorich公司产品；甲醇(色谱纯)为天津康巢生物医药有限公司产品；乙腈(色谱纯)为天津市津东天正精细化学试剂厂生产；三氟乙酸酐(分析纯)为成都市科龙化工试剂厂生产；1-甲基咪唑(色谱纯)为美国Sigma-Alorich公司产品；纯净水为娃哈哈公司产品；0.22 μm滤膜为天津市科亿隆实验设备有限公司产品；衍生化试剂的配制，衍生化试剂A为1-甲基咪唑/乙腈=1/1；衍生化试剂B为三氟乙酸酐/乙腈=1/1，现用现配。(三氟乙酸酐使用前需过0.22 μm滤膜)

1.1.3 色谱条件 Eclipse plus C18色谱柱(3.5 μm，4.6 mm×100 mm)；流动相甲醇：水(95∶5)，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，荧光检测器激发波长365 nm，发射波长475 nm，进样量20 μL。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制 储备液：分别称取阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、甲氨基阿维菌素标准品100 mg，加入同一个10 mL容量瓶，少量甲醇溶解，甲醇定容至10 mL，配制成浓度为10 mg/mL的阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、甲氨基阿维菌素标准品混合溶液。

工作液：将阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、甲氨基阿维菌素储备液稀释，配制成浓度为0.1、0.2、0.5、1、2 μg/mL工作液。

1.2.2 标准曲线 分别取0.1、0.2、0.5、1、2 μg/mL阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、甲氨基阿维菌素混合工作液40 μL，氮气吹干，衍生化，液相色谱分离，荧光检测器测定，以阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、甲氨基阿维菌素的色谱峰面积对应其浓度作线性回归，分别得到阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、甲氨基阿维菌素的标准曲线。

1.2.3 样品前处理 准确称取2 g搅碎的牛肉样品于15 mL离心管，加入5 mL 乙腈，涡旋振荡2 min，10 000 r/min离心5 min，将上清液移入另一个15 mL离心管，于样品中再加入5 mL乙腈，涡旋振荡2 min，10 000 r/min离心5 min，合并上清液。50 ℃将上清液吹至2 mL，加入QuEChERS，涡旋振荡2 min，10 000 r/min离心5 min，取上清，过0.22 μm滤膜，吹干，备用。

1.2.4 衍生化 将吹干的样品加入衍生化试剂A，涡旋振荡1 min，再加入衍生化试剂B，涡旋振荡1 min，待液相色谱分析。

1.2.5 回收率及变异系数测定 设2、10、40 μg/kg三个添加水平，于2 g空白牛肉中添加0.1、0.5、2 μg/mL阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、甲氨基阿维菌素标准品混合工作液40 μL，常温振荡1 h，使组织浓度分别为2、10、40 μg/kg，按照方法1.2.3～1.2.4处理添加样品，液相色谱分析，对照标准曲线，计算回收率，同一天重复5次，计算日内变异系数；连续测3 d，计算日间变异系数。

2 结果

2.1 线性试验

阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、甲氨基阿维菌素的线性方程见表1。由表1可见，4种药物在0.1 μg/mL～2 μg/mL浓度范围内线性良好。

表1 标准曲线方程及相关系数

2.2 方法灵敏度

空白牛肉样品和添加2 μg/kg阿维菌素类药物后检测结果见图1。由图1可见，阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、甲氨基阿维菌素4个目标峰分离良好，并且在目标峰附近，无其他杂峰出现。按信噪比S/N=3为依据，将添加浓度2 μg/kg定为本方法的检测限。

2.3 方法的添加回收率和精密度

在牛肉中添加不同浓度的标准品，同一天做5个重复样品，计算日内变异系数；连续做3 d，计算日间变异系数。平均回收率、日内变异系数及日间变异系数见表2；标准品和10 μg/kg样品添加对照图见图2。从检测数据可以看出，检测方法的平均回收率为77.3%～97.2%，日内变异系数为2.05%～4.91%，日间变异系数为0.27%～6.10%。由图2可见，该方法比较稳定，可以作为动物组织中阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、甲氨基阿维菌素残留检测方法使用，也为药品测定及毒理学研究提供检测依据。

3 讨论

本试验采用QuEChERS净化，HPLC检测牛肉中阿维菌素类药物残留，下面从净化方法、液相色谱检测方法及检测结果三个方面进行讨论。

3.1 固相微萃取

QuEChERS是基于分散固相萃取建立起来的净化方法，多应用于农残检测。在农作物检测中，农残多汁，萃取净化中，无水MgSO4、NaCl主要用以除去萃取环境中的水分。PSA(乙二胺-N-丙基)可以除去有机酸和少量的色素(如叶绿素等)；C18能够清除许多脂肪等非极性干扰物质。

1.甲氨基阿维菌素；2.阿维菌素；3.多拉菌素；4.伊维菌素1.Emamectin benzoate; 2.Abamectin; 3.Doramectin; 4.Ivermectin

药物名称Samples添加浓度/(μg·kg-1)Spikinglevel日内Intraday平均回收率/%Meanrecovery变异系数/%Coefficientofvariation日间Interday平均回收率/%Meanrecovery变异系数/%Coefficientofvariation阿维菌素Abamectin287.787.24.910.511080.079.13.461.644071.771.82.220.44伊维菌素Ivermectin297.397.22.930.271086.986.13.211.044076.176.52.911.28多拉菌素Doramectin293.393.34.280.861089.088.42.580.714079.279.32.050.53甲氨基阿维菌素Emamectinbenzoate291.792.34.130.511085.386.23.400.934079.277.82.831.50

与农药残留不同，动物组织中水分含量少，且含有大量蛋白质和脂肪，所以净化过程需要考虑去除蛋白质和脂肪，本试验中对QuEChERS各种吸附剂粉末的用量进行调整，减少了MgSO4、NaCl的含量，增加了C18的量，50 mg MgSO4，50 mg PSA、150 mg C18。通过调整，当添加浓度为2、10、40 μg/kg时，阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、甲氨基阿维菌素4种药物的回收率在77.3%～97.2%之间。

较用固相萃取C18柱做前处理[6]，使用QuEChERS做前处理，其有机试剂的用量大大减少，且操作步骤简单，用时少，同时也保证了试验的顺利进行。

3.2 检测限、回收率和变异系数

本试验采用液相色谱-荧光检测阿维菌素类药物的残留，检测限为2 μg/kg，我国要求伊维菌素和多拉菌素的最高残留限量为牛肉中不超过10 mg/kg[4]，完全满足国家对阿维菌素类药物残留检测的要求。张伟等[12]采用液相色谱-紫外检测器检测水中阿维菌素的残留，检测限为100 μg/L。质谱检测该类物质的检测限低，且能检测更多物质[13-14]，但是质谱价位高，一般为液相色谱的5～10倍，在基层应用较少。免疫分析法分析样品步骤简单，快速，但是假阳性较高，且检测范围小。采用间接竞争酶联免疫法只能检测阿维菌素和伊维菌素两种药物[15]。

采用5 mL乙腈提取，回收率为55%左右，采用10 mL乙腈提取，回收率为60%左右，两次采用5 mL乙腈提取，合并提取液，回收率在70%以上。因此，本试验采用5 mL乙腈两次提取的方法，提高回收率，同时也节省了有机试剂的使用。

1.甲氨基阿维菌素; 2.阿维菌素; 3.多拉菌素; 4.伊维菌素1.Emamectin benzoate; 2.Abamectin; 3.Doramectin; 4.Ivermectin

3.3 色谱条件优化

文献多用乙腈作为液相色谱的流动相[7]。本试验采用甲醇和乙腈分别作为流动相，结果表明甲醇和乙腈均能很好的分离4种物质，考虑到乙腈毒性较大，本实验采用了甲醇∶水(95∶5)作为流动相。

本研究比较了250 mm的C18色谱柱和100 mm 的C18色谱柱，发现在现有液相色谱条件下，100 mm的C18柱就可以达到4种物质的完全分离，峰型左右对称，分离时间比250 mm色谱柱短。因此，本试验采用了100 mm的C18色谱柱分离上述4种物质。

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DeterminationofAvermectinsResiduesinBeefbyQuEChERS-HighPerformanceLiquidChromatography

ZHANG Wei,SHU Jun-xi,ZHENG Yan,LI Cun

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin,300384,China)

A multiresidue detection method was developed for the determination of abamectin,ivermectin,doramectin,emamectin benzoate in beef using QuEChERS-High performance liquid chromatography.The homogenized samples were extracted by acetonitrile twice,cleaned up by QuEChERS,and then dried by nitrogen.After being derivatised by 1-methylimidazole and trifluoroacetic anhydride in acetonitrile,the samples were determined by high performance chromatography with fluorescence detection(excitation wavelength is 365 nm,emission wavelength is 475 nm).In the range of 0.1 μg/mL-2 μg/mL,the calibration curves of abamectin,ivermectin,doramectin and emamectin benzoate showed good linearity,with the correlation coefficients being higher than 0.999.The limits of detection were 2 μg/kg (S/N=3).At the spiked levels of 2,10,40 μg/kg,the average recoveries were in the range of 77.3%-97.2%,with the intraday relative standard deviations ranging from 2.05 to 4.91% (n=5) and the daytime relative standard deviations ranging from 0.27 to 1.64% (n=3).The procedure provided a simple,sensitive,reliable and safe method for routine residual analysis.

avermectins; QuEChERS; high performance liquid chromatography; multiresidue analysis

2017-07-03

天津市高等学校科技发展基金(20130623)；国家自然科学基金项目(31372482)

张 伟(1979-)，女，硕士，实验师，主要从事兽医药理学与毒理学研究与应用。*

O657.72；TQ572.48

A

1007-5038(2017)11-0056-05