抗凝剂对动物布鲁菌病虎红平板凝集试验的影响

张智鹏

(汉中市动物疾病预防控制中心，陕西汉中 723000)

抗凝剂对动物布鲁菌病虎红平板凝集试验的影响

张智鹏

(汉中市动物疾病预防控制中心，陕西汉中 723000)

为探讨含抗凝剂样品对动物布鲁菌病虎红平板凝集试验的影响，采集猪、牛、羊等不同动物的血液各10份，经柠檬酸钠、EDTA、肝素钠等抗凝剂处理后与对应的自然凝固、立即离心获得的样品分别进行虎红平板凝集试验和试管凝集试验，比较两种试验结果的差异。结果显示，经抗凝剂处理后的血浆样品虎红平板凝集试验结果均为阳性，试管凝集试验均为阴性，而自然凝固的血清样品两个试验结果均为阴性，不同处理方式造成的虎红平板凝集试验结果差异现象不受动物种类的影响。抗凝剂对虎红平板凝集试验影响非常显著，对试管凝集试验无影响。因此，临床上用虎红平板凝集试验进行动物布鲁菌病筛查时，不能使用含有抗凝剂的血液样品，否则会出现严重的非特异性凝集现象。

布鲁菌病；抗凝剂；虎红平板凝集试验；试管凝集试验

布鲁菌病(Brucellosis)简称布病，是由布鲁菌引起的人畜共患传染病[1-2]，不仅可造成易感动物流产、不孕、关节炎、睾丸炎等，降低种畜利用价值，并长期带菌，成为危险的传染源，还可通过直接或间接接触向人际间传播，引起人关节和肌肉疼痛、肝脾肿大、睾丸炎、附睾炎、孕妇流产、不孕等症状，严重者可丧失劳动能力[3-5]。世界动物卫生组织(OIE)将布鲁菌病列为必须 的传染病，我国将其列为二类动物疫病。

虎红平板凝集试验(RBPT)和试管凝集试验(SAT)是布病监测及诊断使用最广泛的两种检验方法[6]，被列入我国《动物布鲁菌病诊断技术》[7],成为法定的检验方法。在实际检测过程中，虎红平板凝集试验常作为动物布病的田间筛查，结果阳性的样品再用试管凝集试验进行定性确诊[8-9]。许多试验结果表明，虎红平板凝集试验和试管凝集试验结果符合率超过90%[10-11]，而虎红平板凝集试验具有用时短、操作简便、灵敏度高等特点，被许多动物疫病监测机构用于布病样品的初筛。汉中市动物疾病预防控制中心兽医实验室连续多年开展猪、牛、羊等动物布病的监测、净化工作，在检测中发现，使用抗凝剂的样品会出现严重的非特异性凝集现象，所有样品均呈现凝集状态，而试管凝集试验结果又全为阴性。为掌握其凝集机理，避免误诊和提高布病监测工作效率，笔者开展了抗凝剂对布病虎红平板凝集试验影响的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 汉中市动物疾病预防控制中心兽医实验室布病检测阴性样品20份，其中牛、羊样品各10份；采集猪、牛、羊全血各10份，每份血样10 mL，平均分成5组，即每组有猪、牛、羊血样各10份，每份2 mL。每个畜种每份全血的3组血样分别按要求加入柠檬酸钠、肝素钠和乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2) 3种抗凝剂，充分混匀，3 000 r/min，离心10 min，取上清液编号备用；第四组血样通过静置、自然凝固、离心等过程制备血清，编号顺序同抗凝血样品；第五组血样在采集后立即离心，吸取上清液编号备用，编号顺序同抗凝血样品。

1.1.2 试剂 布鲁菌病虎红平板凝集试验抗原(批号20150705)、布鲁菌病试管凝集试验抗原(20150703)，青岛异邦生物工程有限公司产品；柠檬酸钠、EDTA-Na2，天津市致远化学试剂公司产品；肝素钠，上海埃彼化学试剂有限公司产品；抗凝剂的配制及使用：分别配制柠檬酸钠、肝素钠和EDTA-Na2抗凝剂，柠檬酸钠3 g，柠檬酸1 g，葡萄糖2.5 g，加水至100 mL，抗凝剂与血液比例为1∶9；肝素钠用超纯水配成1 mg/mL水溶液，抗凝剂与血液比例为1∶10； EDTA盐配成150 mg/mL的水溶液，每5 mL血液加0.04 mL EDTA-Na2溶液。

1.1.3 仪器、耗材 离心机，恒温培养箱，加样器，一次性真空采血器、载玻片。

1.2 方法

虎红平板凝集试验(RBPT)和试管凝集试验(SAT)操作步骤及判定标准按照《动物布鲁菌病诊断技术》(GB/T18646-2002)进行 。

1.2.1 虎红平板凝集试验 将配制的抗凝剂溶液按规定的剂量加入到已知阴性血清中，进行虎红平板凝集试验，观察试验结果。

1.2.2 抗凝剂对不同畜种布鲁菌病检测结果的影响 不同畜种的加抗凝剂样品分别进行虎红平板凝集试验和试管凝集试验，比较抗凝剂对不同畜种布病检测结果的影响。

1.2.3 加抗凝剂样品与对应的自然凝固样品 加抗凝剂样品与对应的自然凝固样品进行虎红平板凝集试验和试管凝集试验，比较两种样品检测结果的差异。

1.2.4 加抗凝剂样品与对应的立即离心样品 加抗凝剂样品与对应的立即离心样品进行虎红平板凝集试验和试管凝集试验，比较两种样品检测结果的差异。

2 结果

2.1 阴性血清样品中加抗凝剂对RBPT的影响

在已知血清中加入规定剂量的抗凝剂，20份血清样品的检测结果仍为阴性(表1)，结果没有发生变化，说明抗凝剂不能改变抗体特性或成为非特异性抗体与布病虎红试剂发生凝集反应的桥梁。

表1 阴性血清中直接加抗凝剂的RBPT试验结果

注：N.牛血清；Y.羊血清。

Note：N.Cattle serum;Y.Goat serum.

2.2 不同畜种加抗凝剂样品的RBPT、SAT试验结果

不同的畜种在全血中加入抗凝剂，处理后的样品试验结果一致(表2)。RBPT全部呈现凝集状态，而SAT结果均不凝集。说明在全血中加入抗凝剂后对不同畜种影响无差异，但都能导致RBPT出现非特异性凝集，对SAT结果无影响。

2.3 加抗凝剂样品与自然凝固样品的RBPT、SAT试验结果

两种样品试验结果SAT均不凝集，加抗凝剂样品的RBPT全部凝集，而自然凝固样品的RBPT不凝集(表3)。说明加入抗凝剂后改变了样品的特性，成分中出现使RBPT结果由不凝集变成凝集的因素，这个因素对SAT没有影响。

表2 不同畜种加抗凝剂样品检测结果

注：Z.猪血清; N.牛血清; Y.羊血清。

Note：Z.Pig serum; N.Cattle serum; Y.Goat serum.

2.4 加抗凝剂样品与立即离心样品的RBPT、SAT试验结果

两种样品的试验结果均一致，RBPT都凝集，而SAT都不凝集(表4)，说明两种处理方式的样品都具有导致RBPT试验凝集的成分。

表3 加抗凝剂样品与自然凝固样品检测结果

注：Z.猪血清; N.牛血清; Y.羊血清。

Note：Z.Pig serum; N.Cattle serum; Y.Goat serum.

3 讨论

根据《动物布鲁菌病诊断技术》和布鲁菌病虎红平板凝集抗原使用说明书的规定，RBPT所用的样品应为血清，并要求血清新鲜，无明显蛋白凝块。在实际检测中发现，部分动物疫病预防控制机构及养殖场技术人员由于采血技术不熟练，血清分离不规范，导致血清量少，出现溶血现象的样品份数多，有效样品数少。为按时完成采样、检测任务，就会采用血液中添加抗凝剂或采血后立即离心等方法以获得外观表现好、数量多的样品。通过血液的成分分析，经这两种方式处理后的样品，是除去血细胞和血小板后剩余的血浆，即试验操作人员把血浆代替血清用于RBPT试验。血浆样品在其他动物疫病检测中还没有发现明显的非特异性反应，但可造成RBPT出现显著的假阳性结果，影响试验结果判定，也大大增加了进一步确诊的工作量。

表4 加抗凝剂样品与立即离心品检测结果

注：Z.猪血清; N.牛血清; Y.羊血清。

Note：Z.Pig serum; N.Cattle serum; Y.Goat serum.

试验结果表明，抗凝剂并不能直接引起RBPT非特异性凝集反应，血浆和血清的不同成分造成了RBPT的假阳性结果。这与蒙文娟[12]试验结果一致。血浆与血清的最大区别是血浆中含有纤维蛋白原，而血清中没有。试剂方面，布病RBPT抗原是将抗原性良好的布鲁菌，接种适宜培养基培养，收获菌体，经加热灭活、离心后用虎红染液染色，悬浮于乳酸缓冲液中制成。虎红又叫孟加拉红，是四氯四碘荧光素，在乳酸缓冲液中带负电荷，可与带正电荷的血浆纤维蛋白原结合，形成了肉眼可见的非特异性超分子显色反应[13]。这就是抗凝剂干扰布病RBPT检测结果的原因。

布鲁菌病的检测方法有许多种，但各有优缺点，有的方法操作简便，敏感性高，但特异性低，准确率差；有的方法特异性强、准确率高，但对仪器设备要求高，操作繁杂，不易掌握，检测时间长。在实际检测过程中，我们既要考虑检测方法的特点，又要结合实验室条件，选择两种或两种以上的方法配合使用，相互验证，提高检测结果的准确性。

综上所述，在布鲁菌检测过程中，应加强兽医人员采样技术培训，熟练掌握采血技能，按照要求采集、处理、保存样品，坚决杜绝含有抗凝剂的样品用于RBPT检测，确保布病诊断、检测工作的顺利开展。

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EffectofAnticoagulantsonAgglutinationTestofTigerRedPlateinAnimalBrucellosis

ZHANG Zhi-peng

(HanzhongAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Hanzhong,Shaanxi,723000,China)

To investigate the effect of anticoagulant-containing samples on the agglutination test of Rose Bengal plate test(RBPT) in animal brucellosis,10 pig,cattle,goat blood samples were collected.After the treatment with sodium citrate,EDTA-Na2,heparin sodium and other anticoagulants,the samples were obtained by centrifugation with the corresponding natural coagulation and centrifugal samples.The differences between the two test results were compared.After the anticoagulant treatment,the results of RBPT agglutination test were positive,the standard tube agglutination test(STA) agglutination test was negative,and the natural coagulation serum samples of the two test results were negative.The differenttreatment methods did not affect the various animal species by RBPT.The anticoagulant had a significant effect on the RBPT,and had no effect on the STA test.The blood samples containing anticoagulants could not be used when screening with tiger red plate agglutination test.Otherwise,severe non-specific agglutination may occur.

Brucellosis; anticoagulant; RBPT; SAT

2017-05-29

张智鹏(1977-)，男，陕西城固人，高级兽医师，主要从事动物疫病防控工作。

S852.614;S854.43

A

1007-5038(2017)11-0132-05