羊布鲁菌陕西分离株OMP19基因的克隆、序列分析及原核表达

吴浩阳，何亚鹏，付明哲，孙 裴，许信刚*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036)

羊布鲁菌陕西分离株OMP19基因的克隆、序列分析及原核表达

吴浩阳1,2，何亚鹏1，付明哲1，孙 裴2*，许信刚1*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036)

对羊布鲁菌(Brucella)陕西分离株OMP19基因进行克隆、序列分析及原核表达。 利用GenBank中收录的布鲁菌(KT229642.1)OMP19基因序列，设计合成引物，应用PCR技术扩增OMP19基因，并将OMP19基因连接到原核表达载体pET-28a中，构建重组质粒pET28a-OMP19，转化到BL21感受态细胞进行诱导表达，通过SDS-PAGE和Western blot法分析。 结果克隆了羊布鲁菌陕西分离株OMP19全基因序列，核苷酸序列分析表明,陕西分离株OMP19基因与国内外已报道的羊布鲁菌核苷酸同源性超过98%，氨基酸同源性超过98%。OMP19重组菌经诱导表达约为19 ku的重组蛋白，该蛋白能与本实验室鉴定保存的阳性血清特异性结合，反应原性良好。为羊布鲁菌陕西分离株分子生物学特性研究提供资料，为进一步进行基因工程疫苗研制及ELISA试剂盒抗体检测提供了基础。

布鲁菌；OMP19基因；克隆；序列分析；原核表达

布鲁菌病是人畜共患病，病原为革兰阴性的短小杆菌，布鲁菌能够引起怀孕母畜流产，降低母畜的繁殖率，而且还能够引起慢性感染，诸如人的波浪热、关节炎，公畜的睾丸炎等[1]。布鲁菌属有6个种，20个生物型，其中羊、牛和猪布鲁菌能引起大多数动物和人类疾病，羊布鲁菌被认为是致病性最强的菌种，人类接触带菌动物或食用病畜及其乳制品，均可被感染[2]。在动物中，针对布鲁菌感染的免疫通常通过使用布鲁菌弱毒平滑菌株如B.abortusS19，B.reutensisRev.1和非平滑菌株B.abortusRB51[3]来对动物进行免疫保护。然而，近年来减毒活疫苗也能够在免疫妊娠母畜动物中引起流产，引起人类致病，诱导动物产生抗生素抗性和诱导动物体内产生抗LPS O侧链的特异性抗体[4]，进而给使用血清学来区分自然感染和疫苗感染动物带来困难。

OMP19主要对布鲁菌外膜的结构有影响，它可以作为布鲁菌外膜蛋白和多粘菌素之间的桥梁。Tibor A E等[5-7]通过对布鲁菌OMP19缺失株的生物特性进行研究，表明OMP19基因的缺失改变了布鲁菌外膜的结构，并且降低了布鲁菌的毒力。国外研究者也证实了OMP19不仅高度保守且有较高的抗原性，并能够与自然感染状态的羊血清而不与自然感染的牛血清发生特异性结合，因此可以作为血清学诊断、确定布鲁菌分型的抗原。本试验成功克隆了布鲁菌陕西分离株OMP19基因，并进行了序列分析和OMP19基因原核表达，为进一步研制更为有效的疫苗及抗体检测ELISA试剂盒奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、质粒和细胞株 布鲁菌陕西分离株(Shanxi)由西北农林科技大学动物医学院兽医微生物实验室分离鉴定并保存；pEASY-T1 Cloning Kit、感受态细胞Trans5a、BL21为北京全式金生物技术有限公司产品；pET-28a质粒由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒、Blue plus Ⅱ Protein Marker购自天根生化科技有限公司；BamHⅠ，XhoⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶购于MBI公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗羊IgG抗体购于CST生物技术有限公司；2×EsTaqMasterMix、DM2000 plus DNA Marker购于北京康为世纪生物科技有限公司；广谱蛋白Marker、BacteriaGen DNA Kit购自北京全式金生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 血清 由本实验室检测保存布鲁菌阳性血清。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 查询GenBank中收录的布鲁菌OMP19的全基因序列(KT229642.1)，利用Primer 5.0 设计OMP19的特异性引物(OMP19F/OMP19R)，上游引物5′- GGATCCATGCCAATAACAAAAGCAAG-3′(下划线为BamHⅠ酶切位点)；下游引物5′- CTCGAGTCATTGCGACCGCGTCAC-3′(下划线为XhoⅠ酶切位点)，扩增长度为534 bp片段，引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2 细菌基因组DNA提取 布鲁菌DNA用天根生化科技有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取。

1.2.3 OMP19基因扩增 以提取的布鲁菌基因组DNA为模板，50 μL PCR反应体系：2×ESTaqMastermix 25 μL，上、下游引物各1 μL，模板5 μL，ddH2O 18 μL。PCR反应条件：95℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。胶回收OMP19目的片段，连接至pEASY-T1载体并转化感受态细胞培养并PCR鉴定，提取阳性质粒并命名为pEASY-T1-OMP19。

1.2.4 原核表达载体pET-OMP19的构建 同时用BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切pEASY-T1-OMP19及pET-28a空质粒，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并胶回收酶切目的片段产物。将胶回收的OMP19目的片段与胶回收的pET-28a质粒的目的片段用T4连接酶于16℃连接过夜。将连接产物转化Trans5α感受态细胞中，挑取单菌落分别进行PCR和双酶切鉴定后，提取阳性质粒送金斯瑞(南京)测序，测序正确的重组质粒命名为pET-OMP19。

1.2.5 OMP19的基因序列分析及编码蛋白的结构预测 利用NCBI BLAST功能将OMP19测序结果与GenBank已收录的布鲁菌基因组DNA(JQ865996.1、KP101384.1、KT229642.1、L27997.1)序列进行比对。利用Internet在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测OMP19编码蛋白的信号肽和跨膜区(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)。利用DNA Star软件预测分析蛋白的亲水性、抗原指数和表面分布可能性。

1.2.6 重组OMP19蛋白的诱导表达及表达条件的优化 将测序鉴定为阳性的重组质粒pET-OMP19和pET-28a空载体分别转化BL21表达感受态细胞，挑取单菌落，37 ℃、200 r/min过夜培养，按1% 转接6 mL新鲜LB培养基后，培养至对数期(约3 h～3.5 h)，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，诱导5 h后，收集1.5 mL菌液的菌体，100 μL PBS洗涤1次后用100 μL PBS重悬，超声裂解30 min。加入20 μL 6×Loading buffer混匀，煮沸8 min，10 000 r/min离心10 min，取15 μL上清进行SDS-PAGE。其他条件不变，摸索不同IPTG终浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)和不同诱导时间(3 h～6 h)对重组蛋白表达的影响，重组蛋白表达的条件进行优化。

1.2.7 重组蛋白OMP19表达形式分析 在1.2.6的优化诱导条件下，诱导表达OMP19蛋白，分别取菌液上清，超声菌体裂解上清和菌体裂解沉淀进行SDS-PAGE，分析蛋白表达形式。

1.2.8 OMP19蛋白的Western blot分析 将OMP19表达产物进行SDS-PAGE后，150 mA恒流转膜2 h,置于50 g/L脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h后，以1∶500倍稀释的布鲁菌阳性血清4℃孵育过夜。洗脱液振荡洗膜，每次10 min共洗涤3次。加入1∶10 000倍稀释的HRP(辣根过氧化物酶)标记的鼠抗羊IgG抗体,室温孵育1 h，振荡洗膜，每次10 min共洗涤3次。最后显色反应液孵育PVDF膜，暗室压片曝光。同时设立阴性对照。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

以提取的布鲁菌基因组DNA为模板，根据设计的引物扩增到了534 bp的OMP19基因片段，与预期片段大小相符(图1)。

M.DNA标准DL 2 000；1.OMP19扩增产物

M.DNA Marker DL 2 000；1.Amplified products of OMP19

图1 OMP19基因的扩增

Fig.1 Amplification of OMP19 gene by PCR

2.2 原核重组质粒的鉴定

重组质粒pET-OMP19经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切、琼脂糖凝胶电泳后出现534 bp的目的条带和5 369 bp的载体条带，目的条带与PCR鉴定一致，表明重组pET-OMP19质粒构建正确(图2)。

M.DNA标准DL 2 000；1.pET-OMP19经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切；2.OMP19 PCR鉴定

M.DNA Marker DL 2 000；1.pET-OMP19 digested withBamHⅠandXhoⅠ；2.Identification of pET-OMP19 by PCR

图2重组表达质粒的双酶切鉴定

Fig.2 Enzyme digestion identification of recombinant plasmid

2.3 OMP19序列分析及进化树分析

NCBI BLAST后发现，OMP19测序结果与GenBank已收录的布鲁菌基因组DNA序列(JQ865996.1、KP101384.1、KT229642.1、L27997.1)OMP19基因相似性在98%以上，证明了布鲁菌的OMP19基因较为保守。利用Internet在线软件预测OMP19氨基酸序列，结果表明该氨基酸序列没有信号肽(图3)和跨膜区(图4)。用DNA Star分析OMP19多肽氨基酸序列的抗原指数、亲水性和表面分布可能性，结果如图5，并且进行了核苷酸遗传进化分析，绘制系统进化树(图6)，结果显示布鲁菌陕西分离株OMP19基因与KP101384.1、KT229642.1位于一个小分支，表明亲缘关系最近。

图3 信号肽预测

图4 跨膜区预测

图5 OMP19蛋白序列的亲水性、抗原指数和表面分布可能性分析

2.4 重组蛋白OMP19诱导表达条件的优化

其他条件不变,以IPTG浓度为1 mmol/L为定量，在不同诱导时间(3、4、5、6 h)下，结果显示在诱导6 h后，重组蛋白OMP19表达量显著增加(图7),使用不同浓度的IPTG诱导重组蛋白的表达，结果显示IPTG浓度对重组蛋白OMP19表达量影响不大(图8)。

2.5 重组蛋白表达形式的分析

在上述最佳诱导表达条件下，分别取菌液上清、超声裂解菌体上清和超声裂解菌体沉淀进行SDS-PAGE，结果显示重组OMP19蛋白主要存在于沉淀中，表明该蛋白主要以包涵体形式存在(图9)。

2.6 重组OMP19蛋白Western blot分析

Western blot结果显示，OMP19重组蛋白能与羊布鲁菌阳性血清发生特异性反应并且出现特异性条带，而阴性对照重组菌不与阳性血清发生反应(图10)。

图6 OMP19核苷酸序列系统进化树

M.蛋白分子质量标准 ；1.未诱导pET-OMP19 ；2～5.分别诱导3，4，5，6 h的pET-OMP19

M.Protein molecular weight Marker ；1.Uninduced cells containing pET-OMP19；2-5.Cells containing pET-OMP19 induced for 3,4,5 and 6 h，respectively

图7不同诱导时间对重组蛋白诱导表达的影响

Fig.7 Effects of different induction time on expressions of OMP19 fusion protein

M.蛋白分子质量标准 ；1～5.分别用终浓度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG诱导pET-OMP19

M.Protein molecular weight Marker；1-5.Cells containing pET-OMP19 induced with 0.2，0.4，0.6，0.8 and 1.0 mmol/L IPTG，respectively

图8 IPTG不同浓度对重组蛋白诱导表达的影响

Fig.8 Effects of different IPTG concebtrations on expressions of OMP19 fusion protein

3 讨论

布鲁菌病不但具有分布范围特别广、强烈传染性、严重危害的特点，而且严重威胁人类健康和畜牧业生产，造成了巨大的经济损失。因此，对布鲁菌病的诊断、防控、净化和疫苗研究一直在世界范围内受到重视。不同种间的布鲁菌基因型具有高度的同源性，但毒力、生物学特性、临床症状及流行特征等却存在着各样差异，这即给布鲁菌病诊断和疫苗的研究提供了有利条件但同时也带来了很大的限制，在整个世界范围内目前还没有一种简便、快捷、准确的检测方法，而且现有疫苗不能够达到预防的效果。因此，有必要继续对布鲁菌病检测方法和疫苗的研制进行深入和创新性的探讨与研究。布鲁菌的外膜蛋白(OMPs)，即是结构蛋白和功能蛋白，也是重要的抗原和毒力因子[8]，对维持布鲁菌细胞膜的完整性至关重要[9]。Simborio H L等[10]的报道，表明在牛布鲁菌抗体的ELISA检测方面多种OMP抗原混合可能更优于单一OMP抗原。

M.蛋白分子质量标准；1.菌液上清；2.菌体裂解沉淀；3.菌体裂解上清

M.Protein molecular weight Marker；1.Supernatant of lysogeny broth；2.Soluble lysates；3.Insoluble lysates

图9 OMP19重组蛋白表达形式分析

Fig.9 Expression forms of OMP19 fusion protein

M.蛋白分子质量标准；1.pET-28a对照菌; 2.OMP19重组蛋白

M.Protein molecular weight Marker；1.pET-28a control; 2.OMP19 fusion protein

图10 OMP19重组蛋白的Western blot结果

Fig.10 Western blot analysis of OMP19 fusion protein

本研究成功的克隆布鲁菌陕西分离株OMP19的全长基因并原核表达了OMP19蛋白。本研究与王娜等[11]建立的布鲁菌OMP19原核表达重组蛋白的大小一致，均为19 ku，而且还与NCBI上登录的其他布鲁菌毒株的OMP19基因进行核苷酸序列比对分析，结果显示，该分离株与其他毒株的核苷酸序列相似性超过98%，其中与NCBI收录布鲁菌序列号KT229642.1分离株毒株同源性最高，核苷酸同源达100%，表明布鲁菌的OMP19基因较为保守。利用在线生物软件预测布鲁菌OMP19蛋白序列，分析OMP19蛋白没有信号肽序列和跨膜结构域。本试验在大肠埃希菌中表达了陕西分离布鲁菌株OMP19蛋白，为诊断布鲁菌的研究、研制基因工程疫苗以及抗布鲁菌OMP19单克隆抗体的制备提供了物质基础。

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Cloning,SequenceAnalysisandProkaryoticExpressionofOMP19GeneofGoatBrucellainShaanxiProvince

WU Hao-yang1,2,HE Ya-peng1,FU Ming-zhe1,SUN Pei2,XU Xin-gang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui,230036,China)

Cloning,sequence analysis and prokaryotic expression of OMP19 gene ofBrucellaShaanxi isolate were carried out.OMP19 gene was amplified by PCR using the OMP19 gene sequence ofBrucella(KT229642.1) in GenBank.The OMP19 gene was ligated into the prokaryotic expression vector pET-28a and the recombinant plasmid was successfully constructed.PET28a-OMP19 was transformed into BL21 competent cells to induce expression.SDS-PAGE and Western blot analysis were used for detecting the expression.The OMP19 gene of Shaanxi isolate was successfully cloned.The nucleotide sequence of OMP19 gene of Shaanxi isolate was found to be over 98% similarity to that reported in China and abroad.The amino acid similarity was more than 98%.OMP19 recombinant protein was induced to express about 19 ku recombinant protein,the protein can be identified with positive serum,showing good specificity and reactivity.This study provided the data for the study on the molecular biological characteristics ofBrucellaisolates in Shaanxi province,and provided the basis for further genetic engineering vaccine development and antibody detection by ELISA kits.

Brucella; OMP19 gene; cloning; sequence analysis; prokaryotic expression

2017-01-14

陕西省农业科技创新与攻关项目(2016NY-092)；陕西省科技统筹创新工程计划项目(2016KTZDNY02-05)；杨凌示范区农业科技示范推广项目(TS-2016-13；2017-TS-23)

吴浩阳(1991-)，男，河南洛阳人，硕士，主要从事动物传染病诊断与防治研究。*

S852.614

A

1007-5038(2017)11-0028-05