听觉功能生物学修复和重建的研究进展

李文妍 李华伟

(1复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科,2耳鼻喉科研究院,上海 200031)

专家简介李华伟,教授,博士生导师,973项目首席科学家,长江学者特聘教授及国家杰出青年基金获得者,教育部创新团队带头人,国家卫生计生委突出贡献中青年专家,上海市领军人才和优秀学术带头人。现任复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科研究院院长,耳鼻喉科主任,上海市医学会耳鼻咽喉头颈外科分会副主任委员。致力于感音神经性聋、周围性眩晕发病机制和治疗的研究。擅长耳和侧颅底显微外科,将“精准医疗”的理念引入人工耳蜗植入的围手术期评估和手术治疗中,在各型中耳炎、耳硬化症、听骨链畸形导致的传导性聋的手术治疗以及感音神经性聋的人工耳蜗的植入手术方面均积累了丰富的经验,开创了经迷路上间隙保留听骨链的面神经全程减压手术。

作为学科带头人,带领复旦大学附属眼耳鼻喉科医院听觉及言语疾病科的成员,每年完成耳显微外科手术超过4 000例,已经成为目前世界范围内业务量最大及设施最全的听觉医学专科;围绕着听觉损伤保护及再生、遗传性聋诊断及发病机制、人工耳蜗优化及临床技术和耳显微外科临床技术研究等领域开展了一系列深入的研究工作,建立起了一支扎实的听力学研究队伍。听觉医学团队获得了2011年复旦大学优秀创新团队称号、上海市领先专业“重中之重”资助,培养出一批出色的青年研究人员。以第一作者或通信作者在NatMed、ProcNatlAcadSciUSA、EMBOMolMed以及JNeurosci等国际著名杂志上发表SCI收录的论著80余篇,并获国家科技进步二等奖,教育部高等学校自然科学一等奖,上海市科学技术一等奖,中华医学科技奖等,先后主持国家杰青基金、国自然科学基金面上项目、重点项目、重大国际合作项目,以及科技部国家重点研发计划项目、973项目等多项国家级和省部级课题。

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听觉功能生物学修复和重建的研究进展

李文妍1,2李华伟1,2△

(1复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科,2耳鼻喉科研究院,上海 200031)

感音神经性耳聋是最常见的感官障碍疾病,在严重影响患者的生活质量的同时也带来了沉重的家庭和社会负担。尽管助听器和人工耳蜗植入在一定程度帮助患者实现听觉功能的部分恢复,但是远未达到重建自然听力的效果。因此通过生物学的方式修复耳蜗感觉上皮的遗传缺陷以及促进毛细胞损伤之后的功能再生是实现听觉重建的理想途径。本文从感音神经性耳聋基因治疗和毛细胞再生两个方面综述了听觉功能生物学重建的研究进展。

感音神经性耳聋; 基因治疗; 毛细胞再生; 听力重建

耳蜗是我们能够感知到自然界丰富美妙声音的重要感知器官,精细复杂的耳蜗结构为不同频率和响度声音的感知提供了解剖和生理基础。在耳蜗的感觉上皮中,终末感受细胞毛细胞和支持细胞相间排列形成高度特化的耳蜗Corti器,也正是这种结构和细胞组成异质性和高耗能的特点,耳蜗毛细胞极易受到遗传缺陷、耳毒性药物、噪音和外伤等因素的损害,导致感音神经性耳聋[1]。

2013年WHO的统计数据显示,全球听力障碍的人数为3.6亿人,在我国听力残疾是仅次于肢体残疾的第二大致残疾病。听力障碍给患者在言语发育和社会交往方面带来了极大的困难,同时也导致了严重的社会问题和经济问题。目前针对感音神经性耳聋的治疗依赖于能够放大外界声源的助听器设备和植入电极直接刺激听觉神经的人工耳蜗设备,虽然这些治疗措施能够帮助患者实现部分听觉功能的恢复,但是远未达到重建自然听力的效果。

相对于鱼类、禽类等非哺乳动物而言,哺乳动物耳蜗毛细胞损伤之后不能够再生,将导致不可逆的听觉功能障碍。因此探索毛细胞损伤机制,修复耳蜗感觉上皮的功能缺陷以及促进毛细胞损伤之后的功能再生是实现听觉重建的理想途径,也是耳科学领域的医生和研究者们关注的焦点。

感音神经性耳聋的基因治疗

感音神经性耳聋的基因治疗概况 感音神经性耳聋是最常见的感官和功能缺陷性疾病,其中2/3的语前聋由遗传因素引起,而95%以上的遗传性耳聋是受一对等位基因控制的单基因遗传病,一直是遗传学研究和基因治疗的重点。相对于其他组织器官而言,耳蜗感觉上皮位于坚固的内耳骨性结构中,存在天然的血-迷路屏障,为基因治疗提供了一个相对封闭的干预空间,能最大限度地减少基因治疗载体向周围的扩散,降低对周围组织和全身其他系统的影响,为感音神经性耳聋的基因治疗提供了便利。

在感音神经性耳聋基因治疗策略的制定过程中,需要考虑到突变基因致病机制、靶细胞以及基因载体等多方面的因素[2]。特定的突变基因将影响内耳特定的细胞类型,在细胞结构和功能层面上影响正常的感音功能,因此充分研究耳蜗感觉上皮中各细胞成分的生物学特点,目标基因在耳蜗中的时空表达特点和致病机制,对于基因治疗策略的选择(基因替代、基因沉默和基因编辑),基因治疗靶细胞的确定,基因治疗载体、内耳径路以及治疗时间窗的选择都具有重要意义。

感音神经性耳聋基因治疗靶细胞 目前的研究表明50%的遗传性感音神经性耳聋是由于毛细胞表达基因的突变所导致[3],在毛细胞顶端成簇状排列的纤毛结构中存在机械传导通道,该通道能够将机械运动转化成电化学活动,是毛细胞实现感音功能的重要组成部分,当编码机械传导通道结构蛋白基因发生突变,将干扰机械信号向电信号的传导过程,导致感音神经性耳聋,是耳蜗感觉上皮中最脆弱、最容易受到遗传因素影响的部分[3]。支持细胞是内耳感觉上皮中另外一个重要的组成成分,为毛细胞提供机械支撑,同时发挥稳定内耳微环境的重要作用,支持细胞和支持细胞之间形成缝隙链接,这种缝隙链接通道主要由Connexin蛋白家族成员Connexin26和Connexin 30所组成,其中编码Connexin26的Gjb2基因突变是导致人类感音神经性耳聋的最常见的遗传突变[4]。此外,血管纹是位于耳蜗中阶外侧的结构成分,主要由边缘细胞、中间细胞、基底细胞和毛细血管内皮细胞构成,对于产生和维持耳蜗中阶的高钾环境和内淋巴电位具有重要的作用[5]。因此毛细胞、支持细胞和血管纹细胞都可能成为基因治疗的靶标,在基因治疗策略的制定过程中,需要针对不同的靶细胞选择相应的内耳径路和基因载体。

感音神经性耳聋基因治疗径路与载体 内耳径路主要包括经圆窗或卵圆窗注射的外淋巴径路,以及经耳蜗打孔或内淋巴囊注射的内淋巴径路两种,具体径路的选择依赖于靶细胞的类型和载体的特点。基因治疗载体包括病毒载体和非病毒载体,其中病毒载体包括慢病毒、腺病毒和腺相关病毒载体,由于不同的病毒载体转染的细胞类型、效率以及表达的时间窗有很大的差别,病毒载体的选择对于治疗效果有很大的影响。我们在前期的研究过程中分别比较了新生小鼠和成年鼠中阶内淋巴径路注射12种不同血清型的腺相关病毒和慢性毒对耳蜗感觉上皮不同细胞亚群的感染效率和外源性基因的表达水平,结果发现在新生鼠阶段经耳蜗中阶注射病毒能够有效地感染耳蜗感觉上皮的各型细胞(不同的血清型感染的细胞类型有差异)而不会影响其正常的听觉功能[6-7]。在成年鼠阶段中阶注射各型腺相关病毒感染的细胞类型与新生鼠阶段类似,感染的部位与注射的部位有关,同时注射会导致注射耳外毛细胞的死亡和听觉功能的丧失[6]。Luk H.Vandenberghe课题组将最新合成的AAV载体Anc80L65通过圆窗膜注射入内耳,获得了极高的内外毛细胞转染效率(达90%),同时不会损伤毛细胞的结构和功能,为以毛细胞修复为目的的基因治疗提供了良好的载体[8]。此外还有非病毒载体如阳离子脂质体等,尽管目前相关的研究应用仍然不多,但鉴于这些合成材料的生物安全性和缺乏免疫原性的特点,在某些特定的情况下仍有可能被广泛应用,产生优于病毒载体的效果[2]。

感音神经性耳聋的基因治疗进展 目前尽管感音神经性耳聋的基因治疗仍未进入临床试验阶段,但是在实验室已经产生了一些令人振奋的研究成果:2012年Lawrence R.Lustig课题组利用AAV1-Vglut3转染耳蜗毛细胞实现了Vglut3基因缺陷性小鼠的听觉功能恢复,是哺乳动物毛细胞基因治疗的第一个成功案例[9]。我们课题组与美国埃默瑞大学合作研究项目中,利用编码钾离子通道亚基KCNQ1基因敲除小鼠模拟人类重度先天性耳聋的Jervell and Lange-Nielsen (JLN)综合征,并在P0-P2小鼠的耳蜗中阶注射AAV-Kcnq1载体,成功挽救了转基因小鼠耳蜗的结构和听觉功能,是第一个针对耳蜗血管纹基因治疗的成功案例[9]。2015年Jeffery Holt的课题组利用跨膜通道蛋白1(TMC1)基因敲除小鼠和点突变小鼠(Beethoven小鼠)模型模拟人类的DFNB7/11和DFNA36遗传性耳聋,并利用AAV2/1-Cba-TMC1成功感染耳蜗内毛细胞并有效表达TMC1,改善了小鼠的听觉功能[10]。此外最新的研究表明,利用Anc80L65合成的AAV病毒载体,能够显著提高Usher综合征1C型模型小鼠的听力和前庭功能状态,甚至达到野生小鼠的水平[11]。

上述成功的基因治疗案例主要是针对突变基因功能的缺失或者不足而采取的基因替代治疗策略,而在遗传性聋的发病机制中,90%以上的迟发型聋是显性遗传的单基因突变导致的,其中约一半以上突变的致病机制是突变等位基因表达产物的显性负效应。因此,通过减少突变等位基因表达量的基因治疗策略,有可能减少异常的表达产物的累积,从而促进听觉功能的恢复。

基于CRISPR/Cas9的人工核酸酶基因组定点编辑技术,为基因治疗过程中特定的基因组序列的敲除或碱基的改变提供了理想的工具。我们课题组成员前期参与的研究工作中,利用阳离子脂质体成功地将Cas9-sgRNA复合物导入小鼠内耳中,在20%的毛细胞中实现了Cas介导的基因修饰,对该系统的深入研究将为基因治疗提供新的方法和工具[12]。

目前的研究成果显著推进了本领域基因治疗的研究,并为进一步的临床研究奠定了扎实的基础,在此基础上利用大型哺乳动物的实验研究,将为临床治疗的安全性和有效性提供良好的参考标准。

耳蜗毛细胞的功能再生包括遗传缺陷在内的各种损伤因素终将导致耳蜗毛细胞不可逆的损伤和缺失,是感音神经性耳聋的主要因素,因此促进毛细胞再生,重建耳蜗感觉上皮结构和功能的完整性,被认为是听觉功能恢复的理想途径[1]。研究认为在胚胎发育的过程中,支持细胞和毛细胞来源于相同的前体细胞亚群,新生鼠耳蜗中纯化的支持细胞在体外培养的过程中能够增殖并分化为毛细胞,因此支持细胞被认为是毛细胞再生的理想细胞来源[13]。毛细胞再生的方式主要有两种,一种是受损细胞周围的支持细胞向毛细胞的直接转分化,但这种再生方式必然伴随着支持细胞数目的减少和耳蜗Corti器结构的改变;另一种是支持细胞重新进入细胞周期,增殖后部分转分化为毛细胞,在再生毛细胞的同时能够维持支持细胞数目的稳定,对于听觉功能的恢复具有重要的意义。

支持细胞向毛细胞的直接转分化 Atoh1是决定毛细胞命运的关键转录因子[14],在小鼠胚胎发育过程中以及新生鼠阶段的支持细胞中高表达Atoh1能够促进支持细胞向毛细胞的直接转分化[15]。尽管有研究表明在成年豚鼠的耳蜗中高表达Atoh1能够促进耳蜗毛细胞的再生和听觉功能的恢复[16],但随后大量的研究表明无法重复出类似的实验结果[17-18],认为该过程仅仅涉及受损毛细胞的修复,并不存在功能意义上的毛细胞再生[19]。最新的研究表明,联合P27Kip1基因敲除和高表达Atoh1,以及同时上调Gata1/Pou4f3与Atoh1,均能够促使成年小鼠耳蜗支持细胞向毛细胞的直接转分化,为利用Atoh1激活成年鼠毛细胞再生提供了新的研究思路[20]。

Notch信号通路在内耳的发育过程中发挥着重要的作用,在内耳发育的早期,Notch信号的持续活化对于前感觉上皮的决定具有重要的作用,在耳囊中高表达NICD能够促使异位感觉上皮的形成[21]。在内耳发育的后期——毛细胞分化的过程中,Notch信号通路的活化能够抑制毛细胞周围细胞向毛细胞的分化,从而形成耳蜗感觉上皮中毛细胞和支持细胞相间排列的独特的马赛克样结构,被称之为“侧向抑制作用”[22]。大量的研究表明,在内耳的发育过程中通过小分子药物(DAPT)或者敲除Notch信号通路的关键基因来抑制Notch信号通路,能够促进支持细胞向毛细胞的直接转分化,产生大量的异位毛细胞[23]。在成年鼠噪音性耳聋模型中也发现,利用Notch信号通路的小分子抑制剂,能够促进支持细胞向毛细胞的直接转分化,促进听觉功能的部分恢复[24]。

毛细胞的增殖再生 2003年我们在国际上首次报道了成年鼠内耳感觉上皮中存在干细胞,在体外培养的过程中能够增殖,并定向诱导为内耳的功能细胞。这一发现为激活内耳细胞增殖和促进毛细胞再生提供了崭新的研究方向和视角[25]。随后大量的研究试图揭示内耳干细胞的生物学特性和调控机制。2012年来自美国两个独立实验室的研究者分别证实具有Wnt活性的Lgr5+支持细胞具有强的增殖和分化潜能,Lgr5被认为是内耳干细胞的特异性标记[26-28]。利用转基因小鼠的体内实验研究结果显示,在Lgr5+的内耳干细胞中上调Wnt 信号通路的关键转录因子β-catenin能够促进Lgr5+内耳干细胞的增殖,小部分增殖细胞能够进一步转分化为毛细胞,实现毛细胞的增殖再生[29]。

我们近期的研究结果表明,抑制Notch信号通路在促进支持细胞向毛细胞直接转分化的同时,会激活Lgr5+细胞的增殖并转分化为毛细胞,实现毛细胞的增殖再生,在这个过程中伴随着Wnt信号通路的活化。我们的研究结果表明 Notch信号通路位于Wnt信号通路的上游,对Wnt信号通路活化所介导的支持细胞增殖具有抑制作用,在国际上首次提出Notch信号通路在维持内耳感觉上皮细胞数目中的重要作用[30]。

此外我们还发现无论是上调Wnt信号通路还是抑制Notch信号通路,所产生的毛细胞增殖再生的区域主要位于耳蜗的顶圈,此外增殖支持细胞向毛细胞转分化的比率仍然很低。但耳蜗的底圈——对应高频感音区域是最容易受到各种因素损伤的部位,因此促进耳蜗中、底圈的毛细胞增殖再生,同时提高增殖支持细胞向毛细胞分化的比率对于临床上促进听觉功能的恢复具有重要的意义。

我们在之前研究的基础上采用了多基因联合调控细胞重编程的技术,利用转基因小鼠在上调Wnt信号通路的同时抑制Notch信号通路,同时高表达毛细胞命运决定的重要转录因子Atoh1,显著提高了支持细胞增殖的程度和范围,同时增殖支持细胞向毛细胞转分化的比率也有了大幅度提高[31]。

但是同时我们也注意到,上述调控措施均不能促进成年鼠耳蜗毛细胞的增殖再生,而促进成年毛细胞的再生才是感音神经性耳聋治疗的核心。因此利用成年哺乳动物研究促进毛细胞增殖再生的生物学策略,探索成年毛细胞再生的调控措施,研发相应的治疗措施,是未来毛细胞再生研究的热点,同时也是难点问题。

综上所述,基于基因治疗的听觉功能修复和激活毛细胞再生的听觉功能重建都是目前促进听觉康复的研究热点,研究的不断深入将加深我们对于感音神经性耳聋发病机制的认识,促进我们探索更加安全有效的听觉功能生物学重建策略。

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Advancesinthebiologicalrestorationofthehearing

LI Wen-yan1,2, LI Hua-wei1,2△

(1DepartmentofOtolaryngology,2InstituteofOtolaryngology,Eyeamp;ENTHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China)

Sensorineural deafness is the most common disorders of senses,which severely impact the life quality and bring heavy burden to the family as well as the society.Current state-of-art treatments focus on sound amplification and implanted electrodes that stimulate the auditory nerve.These strategies offer partial recovery of function for a limited patient population but do not come close to restoring natural hearing.Clearly,there is strong need for development of biological treatments for the hearing restoration through correcting the genetic defects or regenerating the new hair cells on the damaged cochlear sensory epithelium.We reviewed the advances in the biological restoration of the hearing,including the gene therapy and the hair cell regeneration aspects.

sensorineural deafness; gene therapy; hair cell regeneration; hearing restoration

R764.43

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.06.011

△Corresponding author E-mail:hwli@shmu.edu.cn

2017-10-01;编辑:张秀峰)