IL-6-174G>C基因多态性与南京地区汉族人群冠心病的相关性*

王跃帮,魏红霞,徐志晔,王彦,张葵1,

(1.南京医科大学鼓楼临床医学院，南京 210008；2.南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，南京 210008；3.宿迁市第一人民医院，宿迁 223800；4.常州市第二人民医院，常州 213000)

·临床实验研究·

IL-6-174G>C基因多态性与南京地区汉族人群冠心病的相关性*

王跃帮1,2,3,魏红霞2,徐志晔2,王彦4,张葵1,2

(1.南京医科大学鼓楼临床医学院，南京 210008；2.南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，南京 210008；3.宿迁市第一人民医院，宿迁 223800；4.常州市第二人民医院，常州 213000)

目的探讨IL-6基因启动子区域-174G>C基因多态性与南京汉族人群冠心病(CHD)的关系。方法聚合酶链-限制性片段多态性(PCR-RFLP)检测235例CHD患者和175例体检健康者，分析各组IL-6-174G>C基因多态性，并进行Hardy-Weinberg平衡检验，选取部分DNA样本进行基因测序，以验证其基因型。同时检测各组血脂、Glu、C反应蛋白、糖化血红蛋白的表达水平。结果CHD组和健康人对照组GG、GC、CC基因型频率分别为98.7%、1.3%、0和97.7%、2.3%、0，G、C等位基因频率分别为99.4%、0.6%和98.9%、1.1%，基因型和等位基因频率在两组间的分布差异无统计学意义(P均>0.05)，与健康人对照组相比，CHD组吸烟、SBP、DBP、TG、CHOL、HDL-C、ApoA-I、ApoB、CRP、HbA1c差异均有统计学意义(P均<0.05)，而年龄、性别、Glu差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论IL-6-174G>C基因多态性与南京地区汉族人群CHD没有明显的相关性。

白细胞介素-6；基因多态性；冠状动脉粥样硬化性心脏病

传统的观点认为高血脂和脂蛋白代谢异常是冠心病(CHD)最强风险预测因子，尽管人们注意饮食方式、锻炼及使用抗血小板聚集和降脂药物，但CHD的发病率依然居高不下[1]，炎症因子在动脉粥样硬化、CHD的发生过程中起重要作用，IL-6作为一种重要的炎性细胞因子，通过细胞因子网络促进冠状动脉粥样硬化的发生,而冠状动脉粥样硬化是诱发冠心病的重要危险因素[2-3],多项研究发现，IL-6基因启动子上游区域基因多态性与CHD的发生密切相关，种族和地区的不同，其基因频率和分布亦存在差异[4-6]，本研究旨在分析IL-6-174G>C基因多态性和南京汉族CHD人群之间的关系，为进一步阐述CHD的发病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2017年3-7月南京大学医学院附属鼓楼医院心内科确诊的CHD患者，共计235例，男138例，女97例，年龄(65.0±10.8)岁，其中稳定性心绞痛55例，不稳定性心绞痛148例，急性心肌梗死32例。CHD诊断标准：(1)有胸痛症状；(2)心电图:S-T段异常；(3)心肌酶异常；(4)有冠状动脉搭桥的病史；(5)冠状动脉管腔狭窄大于50%。同时满足条件(1)、(2)、(3)或(4)、(5)中任意一条即可。排除标准：患恶性肿瘤、白血病、肺栓塞、心肌病、主动脉瘤、自身免疫性疾病、心脏瓣膜病以及严重感染者。对照组选择同期体检健康者175例，男107例，女68例，年龄(62.7±11.2)岁。两组人群均无血缘关系，本研究经南京大学医学院附属鼓楼医院医学伦理学委员会批准，研究对象知情同意。

1.2主要仪器和试剂 Thermal Cycler PCR仪(美国ABI公司)，FR-200A全自动紫外分析仪(上海复日科技公司)，糖化血红蛋白仪、DNA电泳仪 (美国Bio-Rad公司)，Beckman Coulter AU5800全自动生化分析仪(美国Beckman公司)；三酰甘油(TG)检测试剂盒(批号：170921，中生北控公司)，总胆固醇(CHOL)检测试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)检测试剂盒(批号：257AFK、405AFI、619AFI，日本协和公司)，载脂蛋白A-I(ApoA-I)试剂盒、载脂蛋白B(Apo-B)检测试剂盒、葡萄糖(Glu)检测试剂盒(批号：17010307、17030704、17042803，宁波美康公司),C反应蛋白(CRP)测定试剂盒(批号：041704，四川迈克公司)，糖化血红蛋白仪检测试剂盒(批号：64070792，美国Bio-Rad公司)，血液基因组DNA提取试剂盒(批号：8480884，德国Qiagen公司)，PCR扩增试剂2×Taq Master Mix(含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、优化的缓冲液和PCR增强剂，批号：0507041)购自近岸蛋白质公司，限制性内切酶sfaNI(批号：1101602，美国NEB公司)。

1.3样本采集 分别采集CHD患者住院第1天和体检健康者体检时晨起空腹(禁食8～12 h)静脉血2管各3 mL，其中1管为含分离胶的促凝管，2 500×g离心15 min，血清样本置-20 ℃保存，用于测定生化指标；另1管经EDTA-K2抗凝，用于提取全血基因组DNA和糖化血红蛋白检测，检测均于当日完成,DNA样本置-20 ℃保存。

1.4生化指标测定 TG检测采用甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶法(参考范围：0.56～1.7 mmol/L)，HDL-C检测采用化学修饰酶法(参考范围：0.94～2.00 mol/L)，ApoA-I、ApoB和CRP检测采用免疫比浊法(参考范围分别为：1.00～1.60 g/L、0.6～1.20 g/L、≤8.0 mg/L),LDL-C检测采用选择性可融化法(参考范围：1.89～3.10 mol/L)，CHOL检测采用酶法(参考范围：2.9～5.72 mmol/L)，Glu检测采用己糖激酶法(参考范围：3.89～6.11 mmol/L)，HbA1c检测采用高效液相色谱法(参考范围：4.2%～6.0%)。各指标检测严格按照实验室标准操作规程的相关要求执行，实验结果根据各项目参考范围与westgard质控规则综合分析。

1.5全血基因组DNA模板制备 按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书操作要求提取全血基因组DNA，经紫外分光光度计检测，选取吸光度(A260/280 nm)在1.8～2.0之间的样本用于后续试验，样本置-20 ℃保存。

1.6聚合酶链-限制性片段长度多态性方法检测IL-6-174G>C基因多态性 根据IL-6在GeneBank中序列号(AF048692.1)，参考文献[7],用Primer Premier 5.0软件设计引物，上游引物序列：5′-ATGCCAAAGTGCTGAGTCACTA-3′,下游引物序列:5′-TCGAGGGCAGAATGAGCCTC-3′，产物片段大小为308 bp，Tm 56 ℃。引物由上海捷瑞公司合成。PCR反应体系为50 μL,包括2×Taq Master Mix 25 μL，模板DNA(约100 ng) 2 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，经DEPC处理的ddH2O 21 μL。PCR循环参数:94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。扩增产物鉴定和酶切分析:取5 μL PCR产物直接经15 g/L琼脂糖凝胶(120 V,15 min)电泳，用于验证引物特异性和预估PCR产物浓度；酶切反应总体系为50 μL，包括PCR产物10 μL，DEPC处理的ddH2O 34 μL, 10×NE buffer 5 μL，限制性内切酶SfaN I 1 μL。37 ℃水浴酶切60 min，酶切产物经30 g/L琼脂糖凝胶(120 V，20 min)电泳，以DL 1000 DNA Maker为标准，FR-200A紫外分析仪照相，根据酶切条带分布判断IL-6-174G>C基因多性:经酶切后GG野生型为2条带，GC杂合型为3条带，CC突变型为1条带。分别选取GG型和GC型的PCR产物各2份，送安徽通用公司进行基因测序。

2 结果

2.1各组临床资料比较 与健康人对照组相比,CHD组吸烟、SBP、DBP、TG、CHOL、HDL-C、HDL-C、ApoA-I、ApoB、CRP、HbA1c差异均有统计学意义(P<0.05)，而年龄、性别、Glu差异无统计学意义(P>0.05)。两组研究对象基本情况见表1。

表1 各组一般临床资料的比较

注：与健康人对照组比较，*，P<0.05。

2.2基因型结果 CHD组IL-6-174G>C位点PCR扩增产物片段约为308 bp，经限制性内切酶SfaNI酶切，GG野生型出现2条带，大小分别为203 bp、105 bp；GC杂合突变型出现3条带，大小分别为308 bp、203 bp、105 bp，CC纯合突变型仅为1条带，大小为308 bp，本研究未见CC型。PCR及酶切电泳结果见图1。GG型和GC型测序结果见图2。

注：M，DL 1000 maker；1,2,7，PCR产物,3,4，GC型；5,6为GG型。

图1 PCR产物及酶切电泳图

注：A,IL-6-174 GG型；B，IL-6-174 GC型;箭头示碱基突变位点。

图2 PCR产物部分测序结果

2.3基因型和等位基因频率比较 本研究人群IL-6-174G>C基因多态性仅见GG和GC型，未见CC型，GG型和GC型在CHD组和对照组频率分布为98.7%、1.3%和97.7%、2.3%，G、C等位基因的频率分别为97.7%和98.9%、1.1%、2.3%。各基因型和等位基因频率在两组间的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 基因型和等位基因频率分布

3 讨论

研究表明，IL-6浓度与CHD的严重程度密切相关，且受基因水平的调控，IL-6-174G>C多态性位点可能影响其表达[5]。本研究结果显示，年龄、性别在CHD组和健康人对照组间差异无统计学意义(P>0.05)，吸烟在两组间差异有统计学义(P<0.05)，CHD患者的TG、CRP、HbA1c和收缩压、舒张压与健康人对照组相比明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，而HDL-C、LDL-C、CHOL、ApoA-I、ApoB较健康人对照组明显减低，差异有统计学意义(P<0.05)。高Glu和高LDL-C是CHD的传统危险因素，在本研究中LDL-C血清浓度水平低于健康人对照组，Glu在两组间差异无统计学意义(P>0.05)，其原因可能是纳入本研究的患者存在CHD和糖尿病病史，长期服用降血脂和血糖等药物，他汀类等降脂药能明显降低血清TC、LDL-C、ApoB水平[6]。高血压是CHD的重要致病因素，导致血管硬化，促进斑块形成，本研究中CHD组收缩压为(137.43±18.70)mmHg，明显高于健康人对照组(P<0.05)。CRP是炎症反应因子，在本研究中CHD组CRP水平明显高于健康人对照组(P<0.05)，表明炎症因子可能促进CHD的发生。

此外，本研究用PCR-RFLP技术检测IL-6-174G>C多态性，结果显示IL-6-174G>C基因分布符合Hardy-Weinberg遗传定律，具有群体代表性，南京地区汉族人群IL-6-174位点以G等位基因为主，主要为GG型，GC型少见，未见CC型，其GG、GC、CC基因型频率分别为98．3%、1．7%、0(CHD组)和98．9%、1．1%、0(健康人对照组)，GG(野生型)基因型频率明显高于GC(杂合突变型)基因型频率，从表2可知，IL-6-174G>C基因型GG、GC以及等位基因G、C在两组间分布差异均无统计学意义(P>0.05),说明IL-6-174G>C基因多态性与南京地区汉族人群CHD之间并不存在相关性，本研究结果与买尼沙买买提等[7]和Bhanushali等[8]的研究结果较为一致。Elsaid等[9]对108例埃及CHD患者研究发现携带IL-6-174 G等位基因的个体的发病风险是携带C等位基因的3.95倍，Satti 等[10]对162名巴基斯坦人研究中发现，携带IL-6-174C等位基因的个体风险比IL-6-174 G基因的明显增高，OR值为3.4。两研究结果均高于本研究，原因可能与选择人群的种族和地域有关。CHD是多基因遗传疾病，易受基因和环境多重影响，基因频率因为种族、环境和地区不同等位基因的分布频率亦不同[11]，本实验结果表明，在CHD组IL-6基因启动子-174G等位基因占99.4%，C等位基因占0.6%，突变率小于1%，无纯合突变，与健康人对照组比较无明显差别(P>0.05)，亦表明IL-6-174G>C位点的基因多态性与南京地区汉族人群CHD的发生无明显的关系。然而本实验由于受到种族、病例数量和地域的限制，未能够进一步分析IL-6-174G>C以及其他相关基因多态性和其他种族、地区CHD人群之间的关系。

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2017-05-24)

(本文编辑：许晓蒙)

Associationofinterleukin-6gene-174G>CpolymorphismanwithcoronaryheartdiseaseofChineseHanpopulationinNanjingarea

WANGYue-bang1,2,3,WEIHong-xia2,XUZhi-ye2,WANGYan4,ZHANGKui1,2

(1.DrumTowerClinicalMedicineofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210008,Jiangsu; 2.ClinicalLaboratory,theAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing21008,Jiangsu; 3.TheFirstHospitalofSuqianCity,Suqian223800,Jiangsu; 4.TheSecondPeople'sHospitalofChangzhou,Changzhou213000,Jiangsu,China)

ObjectiveTo investigate the relationship of -174G>C polymorphism of interleukin 6 (IL-6) gene promoter region upstream-with coronary heart disease (CHD) of Chinese Han population in Nanjing area.MethodsThe polymorphism ofIL-6-174G>C gene was confirmed in 235 patients with CHD and 175 healthy individuals by PCR-RFLP, and Hardy-Weinberg equilibrium was tested. DNA samples were selected for sequencing to verify their genotype. The concentration of blood sugar, lipid, C reaction protein (CRP) and glycosylated hemoglobin (HbA1c) in the samples were measured simultaneously.ResultsThe genotype distributions of GG, GC and CC were 98.7%, 1.3% and 0 in CHD group and 97.7%, 2.3% and 0 in control group, respectively. The frequencies of G and C alleles were 99.4%, 0.6% and 98.9%, 1.1% in the two groups. There were no statistical significance for frequencies of genotype and alleles between the two groups (allP>0.05). Compared with the control group, the differences of smoking, systolic blood pressure (SBP), diastolic blood pressure (DBP), triglyceride (TG), cholesterol (CHOL), low-density lipoproteins-cholesterol (LDL-C), high-density lipoproteins-cholesterol (HDL-C), apolipoprotein A-I (ApoA-I), ApoB, CRP and HbA1c were statistically significant (allP<0.05), while age, sex and blood glucose were not statistically significant (allP>0.05).ConclusionIL-6-174 G>C gene polymorphism should not remarkably correlated with CHD in Chinese Han population in Nanjing area.

interleukin-6；coronary heart disease；gene polymorphism

10.13602/j.cnki.jcls.2017.11.13

南京市医学科技发展一般项目(YKK15083)。

王跃帮，1984年生，男，主管技师，大学本科，研究方向: 炎症因子与心血管疾病的关系。

张葵，教授，硕士研究生导师，E-mail:13505151066@163.com。

R541.4

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