体外肿瘤细胞迁移和侵袭定量方法的建立

许雪梅，刘建

体外肿瘤细胞迁移和侵袭定量方法的建立

许雪梅，刘建

侵袭是恶性肿瘤最重要的特征之一。肿瘤细胞由其原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，部分细胞被血液、淋巴液带到另一部位或器官继续生长，形成与原发瘤同样类型的肿瘤，这一过程即为肿瘤的迁移和侵袭[1]。在肿瘤研究中，肿瘤细胞迁移和侵袭实验是研究肿瘤转移相关特性的重要方法[2-3]，也是抗肿瘤药物筛选的常用手段[4-6]。建立合适的肿瘤细胞迁移和侵袭模型，并建立简便、准确的定量方法，对于肿瘤研究具有重要的意义[7]。

传统的定量方法是将迁移或侵袭的细胞用结晶紫染色，在显微镜下对几个代表性视野中的染色细胞进行拍照和计数[8-9]，耗时长、通量低、准确度差。本研究中，我们在传统的模型基础上，建立了一种结晶紫染色后进行醋酸脱色、酶标仪读取吸光度值的定量方法。

1 材料与方法

1.1 材料

人纤维肉瘤细胞 HT-1080、小鼠成纤维细胞 NIH/3T3以及人乳腺癌细胞 MCF-7 均购自美国 ATCC；MEM 和DMEM 细胞培养液、胎牛血清、PBS、matrigel、transwell 细胞培养小室（8 μm 孔径 PET 膜）、T-25 细胞培养瓶、96 孔透明板等均为康宁公司产品；结晶紫染料购自上海碧云天生物技术有限公司；醋酸购自国药集团；SpectraMax M4 多功能酶标仪购自美谷分子仪器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HT-1080 细胞用添加 10% 胎牛血清的MEM 进行常规培养。MCF-7 细胞用添加 10% 胎牛血清及 0.01 mg/ml 的人重组胰岛素的 MEM 进行培养。NIH/3T3细胞用添加 10% 胎牛血清的 DMEM 培养。细胞每隔 2 ～3 天换液，在达到 80% ～ 90% 汇合度时进行传代。

1.2.2 细胞迁移和侵袭实验 matrigel 使用前置于冰上，于 4 ℃ 冰箱融化过夜。所有接触 matrigel 的试剂、耗材、器皿等都置于冰上预冷。将 matrigel 用无血清培养液稀释至 200 μg/ml，上下吹打混匀。取 100 μl 稀释后的 matrigel包被溶液，小心加入到侵袭组的 transwell 细胞培养小室中间。将包被 matrigel 的 transwell 置于 37 ℃ 孵育 1 h 以上。迁移组的小室不用包被 matrigel。HT-1080、NIH/3T3 和MCF-7 细胞用胰酶消化，离心收集，用不含 FBS 的培养液重悬。细胞计数，并用无血清培养液稀释至 5 × 105个/ml。取出包被好 matrigel 的 transwell 小室，吸弃上层残留的液体。迁移组和侵袭组均接种 150 μl 细胞悬液至 transwell 小室内，细胞终密度为 75 000/孔。实验组向下室中加入 800 μl含血清的培养液，对照组中加入 800 μl 不含血清的培养液。每组 4 个复孔。置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养 16 h。培养结束后，取出 transwell 小室，PBS 洗 2 次，用棉签轻轻擦除上室膜上的细胞。将小室置于结晶紫染料中室温染色 10 min，用 PBS 洗涤 2 ～ 3 次，直至洗涤液不再有颜色为止，晾干。

1.2.3 手动计数法定量细胞迁移和侵袭率 显微镜下对迁移和侵袭的细胞进行观察并拍照，随机选取 5 个视野，计数一定面积下结晶紫染色的细胞。将单个视野下计数细胞的平均值除以单个视野的面积，再乘以 transwell 小室的总生长面积，即得到迁移或侵袭的总细胞数。用迁移或侵袭的总细胞数除以接种的初始细胞数，即得到迁移率和侵袭率。

1.2.4 标准曲线的绘制 取 HT-1080、NIH/3T3 和MCF-7 细胞，消化、计数，分别用培养液稀释成一系列密度，接种至 96 孔板中，每个密度 4 个复孔，培养过夜。细胞用结晶紫室温染色 10 min 后，PBS 洗涤 2 ～ 3 次。醋酸用双蒸水稀释至 33%（v/v）。取 200 μl 33% 醋酸加入到 96 孔板中，室温振荡 10 min，使染色的细胞充分脱色。洗脱液用酶标仪读取 590 nm 处吸光度值。原始数据扣除空白组（不含细胞、同样处理）后，与对应的细胞接种数进行线性回归，绘制细胞数和吸光度的标准曲线，并得到针对该细胞系的回归直线方程。

1.2.5 光吸收法定量细胞迁移和侵袭率 将结晶紫染色后的 transwell 小室置于 24 孔板中，每孔加入 400 μl 33%醋酸溶液，室温振荡 10 min，充分洗脱与细胞结合的结晶紫。转移 200 μl 洗脱液至 96 孔透明板中，用酶标仪读取590 nm 处的吸光度值。将迁移和侵袭实验组的吸光度值减去空白组后，根据标准曲线的回归直线方程换算成细胞数，再乘以稀释倍数 2，得到迁移或侵袭的总细胞数。用迁移或侵袭的总细胞数除以接种的初始细胞数，即得到迁移率和侵袭率。

2 结果

2.1 不同细胞的迁移和侵袭特性

3 种不同的细胞株 HT-1080、NIH/3T3 和 MCF-7 进行细胞迁移和侵袭实验，结晶紫染色后显微镜下观察结果如图 1 所示。在 10% FBS 的诱导下，HT-1080 细胞能够降解 matrigel 并穿透膜上的孔进入到 transwell 下室，具有很强的侵袭能力。NIH/3T3 细胞在无 matrigel 时能够迁移到下室，而在有 matrigel 作为屏障时不能穿透，表明该细胞具有很强的迁移能力，但侵袭能力弱。MCF-7 在有无matrigel 时均不能穿透到下室，表明该细胞迁移力很弱。在没有 FBS 诱导时，3 种细胞均不迁移或侵袭。空白组上的黑色小点为显微镜下观察到的 transwell 上的微孔。

图 1 显微镜下 HT-1080、NIH/3T3 和 MCF-7 细胞的迁移和侵袭染色结果（比例尺：200 μm）

图 2 手动计数法选取的一个随机视野

2.2 手动计数法定量细胞迁移和侵袭率

本次实验采用的 transwell 小室的生长面积为 0.33 cm2。计数所选取的视野为边长 200 μm 的正方形，单个视野的面积为 0.0004 cm2，如图 2 所示的白色线框所选范围。当细胞数量较多时，计数工作量大，同时细胞和细胞之间形成交叉重叠，计数时较难分辨。手动计数通过将单个视野的细胞数换算成一个 transwell 小室的总细胞数后，除以接种细胞数，得到细胞迁移率和侵袭率，如图 3 所示，结果与显微镜下观察到的迁移和侵袭染色结果所反映的不同细胞迁移和侵袭特性一致。

图 3 手动计数法的 HT-1080（A）、NIH/3T3（B）和 MCF-7（C）细胞迁移率和侵袭率（***P ＜ 0.001）

2.3 结晶紫标准曲线

通过不同细胞数对应的醋酸洗脱液OD590nm数值，进行线性回归，绘制得到标准曲线（图 4）。HT-1080 细胞的回归方程：y = 1.207 × 10-5x + 0.007287（r2= 0.9925）；NIH/3T3 细胞的回归方程：y = 0.8613 × 10-5x - 0.00307（r2= 0.9989）；MCF-7 细胞的回归方程：y = 0.9383 × 10-5x -0.004072（r2= 0.9943）。

2.4 光吸收法定量细胞迁移和侵袭率

HT-1080、NIH/3T3 和 MCF-7 迁移和侵袭细胞，结晶紫染色后脱色，醋酸洗脱液呈现出与细胞染色结果一致的蓝紫色（图 5），而细胞上不再显现颜色。洗脱液测定 590 nm吸光度值，扣除空白组后，将吸光度值根据对应细胞的线性回归方程换算成细胞数。由于 24 孔板侵袭实验洗脱液体积是 96 孔板标准曲线洗脱液的两倍，细胞数乘以稀释倍数2，即得到迁移或侵袭的总细胞数，再除以接种的起始细胞数，即得到细胞迁移率和侵袭率（图 6），结果与手动计数法的结果及显微镜下观察结果一致。

图 4 HT-1080（A）、NIH/3T3（B）和 MCF-7（C）细胞结晶紫染色标准曲线

图 5 迁移和侵袭细胞结晶紫染色的醋酸洗脱液

图 6 结晶紫洗脱液光吸收法的 HT-1080（A）、NIH/3T3（B）和 MCF-7（C）细胞迁移率和侵袭率（***P ＜ 0.001，**P ＜ 0.005）

2.5 迁移和侵袭定量实验流程的建立

图 7 细胞侵袭实验结晶紫光吸收法定量流程

采用 transwell 细胞培养小室成功地建立了一种新的基于结晶紫光吸收的迁移和侵袭定量实验流程（图 7）。transwell 包被（不包被）matrigel 之后，用无血清培养液接种细胞至上室，在下室中用 10% FBS 诱导。无 matrigel 包被时，迁移性的细胞穿透 transwell 上的多孔膜进入下室；有 matrigel 包被时，侵袭性的细胞降解 matrigel 后进入下室。下室细胞用结晶紫染色后，可采用传统手动计数的方法进行定量，也可采用醋酸对染色细胞进行脱色，洗脱液用酶标仪读取 590 nm 处的吸光度值，即可对迁移和侵袭的细胞进行定量。

3 讨论

在肿瘤侵袭机制研究以及抗肿瘤药物筛选中，细胞迁移和侵袭实验都是应用非常广泛的体外模型。迁移是指细胞在迁移信号或物质浓度梯度的作用下从一个位置到另一个位置的运动。而侵袭则需要细胞首先通过酶促降解细胞外基质而通过这一屏障[10]。

康宁 transwell 小室是一种常用的研究肿瘤细胞迁移和侵袭的工具[11]。Transwell 小室上的多孔膜将细胞生长的空间分成两个部分，膜上面的空间称为上室，膜下面称为下室。将细胞接种到上室内，由于多孔膜的通透性，在下室培养液中的营养成分会诱导上室细胞穿过多孔膜进入下室，从而可以很方便地研究细胞的迁移。而侵袭可通过在transwell 上包被一层康宁 matrigel 进行。Matrigel 是从小鼠肉瘤中提取的可溶性基质蛋白，可以模拟细胞侵袭中的细胞外基质屏障[12-13]。细胞需要首先分泌基质金属蛋白酶来消化屏障，然后才能通过多孔膜运动到下室，这一过程即为侵袭。在迁移和侵袭实验中，细胞接种密度、诱导物浓度、迁移和侵袭时间、屏障浓度等是实验中至关重要的因素，需根据不同的实验进行优化[14]。

本研究采用 3 种不同类型的细胞验证了实验的有效性。低迁移性的 MCF-7 细胞表明无自发性的细胞迁移发生；低侵袭性的 NIH/3T3 细胞验证了 matrigel 模拟组织屏障阻止侵袭的有效性；侵袭性的 HT-1080 细胞验证了侵袭实验的有效性。

细胞结晶紫染色是广泛应用于迁移和侵袭的检测方法，该方法的定量通常是在显微镜下对几个代表性的视野中被染色的细胞进行拍照和计数，但手工计数耗时长、通量低、工作量大，随机选取的几个视野不能准确地反映所有的情况，同时细胞密度大时的交叉重叠会造成计数的不准确，使得该方法的应用受到限制。

在本研究的细胞迁移和侵袭实验中，我们在传统的结晶紫染色后，采用 33% 醋酸将细胞结合的结晶紫染料洗脱下来，通过测量洗脱液的吸光度值，可以对细胞迁移和侵袭进行定量。结合细胞数-吸光度值标准曲线，可以计算出细胞迁移和侵袭的百分率。该方法可以很方便地在常规结晶紫染色后进行，将细胞的手动计数转换成均质溶液吸光度值的测量，消除了人为判断的不准确性，免除了繁琐乏味的手工计数步骤，简便易行，结果与手工计数方法具有一致性，是一种有效的细胞迁移和侵袭实验的定量方法。

[1] Yamaguchi H, Wyckoff J, Condeelis J. Cell migration in tumors. Curr Opin Cell Biol, 2005, 17(5)：559-564.

[2] Mierke CT. Role of the endothelium during tumor cell metastasis： is the endothelium a barrier or a promoter for cell invasion and metastasis? J Biophys, 2008, 2008：183516.

[3] Roussos ET, Condeelis JS, Patsialou A. Chemotaxis in cancer. Nat Rev Cancer, 2011, 11(8)：573-587.

[4] Shian SG, Kao YR, Wu FY, et al. Inhibition of invasion and angiogenesis by zinc-chelating agent disulfiram. Mol Pharmacol, 2003, 64(5)：1076-1084.

[5] Selvendiran K, Ahmed S, Dayton A, et al. HO-3867, a synthetic compound, inhibits migration and invasion of ovarian carcinoma cells through downregulation of fatty acid synthase and focal adhesion kinase. Mol Cancer Res, 2010, 8(9)：1188-1197.

[6] Eccles SA, Box C, Court W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnol Annu Rev, 2005, 11(5)：391-421.

[7] Kim Y, Williams KC, Gavin CT, et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc, 2016, 11(5)：937-948.

[8] Albini A, Benelli R. The chemoinvasion assay： a method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nat Protoc, 2007, 2(3)：504-511.

[9] Liu L, Mao J, Wang Q, et al. In vitro anticancer activities of osthole against renal cell carcinoma cells. Biomed Pharmacother, 2017, 94：1020-1027.

[10] Kramer N, Walzl A, Unger C, et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res, 2013, 752(1)：10-24.

[11] Marshall J. Transwell® invasion assays. Methods Mol Biol, 2011, 769(2)：97-110.

[12] Kleinman HK, Martin GR. Matrigel： basement membrane with biological activity. Semin Cancer Biol, 2005, 15(5)：378-386.

[13] Benton G, Kleinman HK, George J, et al. Multiple uses of basement membrane-like matrix (BME/Matrigel) in vitro and in vivo with cancer cells. Int J Cancer, 2011, 128(8)：1751-1757.

[14] Sherman H, Pardo P, Upton T. Optimization considerations for chemotaxis or invasion tests using Corning® Transwell® osmotic supports. Chin Med Biotechnol, 2015, 10(3)：277-279. (in Chinese) Sherman H, Pardo P, Upton T. 使用Corning® Transwell® 渗透支持物进行趋化性或侵袭试验的优化考虑. 中国医药生物技术, 2015, 10(3)：277-279.

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.013

201206 上海，康宁生命科学亚洲技术中心

刘建，Email：liuj11@corning.com

2017-08-30