人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒国家监督抽验质量评价

胡泽斌，曲守方，孙彬裕，杨振，黄杰

人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒国家监督抽验质量评价

胡泽斌，曲守方，孙彬裕，杨振，黄杰

人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，CMV），属疱疹病毒科，乙组疱疹亚科，分子量为 150 × 106D，是直径为 200 nm 的线状双链 DNA 病毒，人是其唯一的宿主。巨细胞病毒的主要感染途径是与被感染病人接触，包括接触被感染病人的唾液、生殖器分泌物、尿液和乳汁，同时也可通过胎盘传播或发生医源性传染[1-3]。CMV 是新生儿先天性致畸的重要病原微生物之一，它对胎儿的危害比风疹病毒要大，最易引起胎儿、新生儿、婴儿的急性、慢性感染和迟发后遗症。原发性孕期感染 CMV 的胎儿 80% 可出现智力低下，视力受损，听力丧失等症状，特别是引起婴儿的巨细胞包涵体病（CI），可致患儿多个系统、多个器官受损，病死率为 10% ～ 20%[4]。我国孕期妇女原发感染 CMV 的比例为 3% ～ 4%，而原发感染导致胎儿受到影响的几率为 50%，我国每年出生上千万婴儿，因此及早检测 CMV 感染对我国优生优育政策的实施具有重要意义[5-7]。

目前国家食品药品监督管理总局批准的人巨细胞病毒IgG 抗体检测试剂盒主要是基于酶联免疫吸附法、化学发光法和免疫层析法，还包括电化学发光法、时间分辨免疫荧光法和多重微珠流式免疫荧光法。该类试剂盒数量繁杂，且生产厂商众多，产品质量参差不齐，为查找巨细胞病毒 IgG 抗体检测试剂盒的监督隐患，全面了解此类产品的质量现状，切实加强对此类产品的监管，根据《食品药品监管总局办公厅关于印发体外诊断试剂抽验工作方案的通知》（食药监办械监[2015]63 号）开展了监督抽验工作。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 M2 SpectraMax 酶标仪购自 Molecular Devices 公司；DEM-3 洗板机购自北京拓普分析仪器有限责任公司；BK-L96C 化学发光免疫分析仪为北京科卫临床诊断试剂有限公司产品；JETLIA-962 发光免疫分析仪为北京源德生物医学工程有限公司产品；Maglumi 2000 Plus 全自动化学发光测定仪为深圳市新产业生物医学工程股份有限公司产品。

1.1.2 参考品 人巨细胞病毒 IgG 抗体国家参考品（批号：36004-201101）由 19 份样品组成，分别是：10 份阳性参考品 P1-P10；5 份阴性参考品 N1-N5；1 份重复性参考品 R 和 3 份最低检测限参考品 L1-L3，由中国食品药品检定研究院提供；企业参考品均由各自企业提供。

1.1.3 样品 按照国家监督抽验工作统筹安排，各省（或市、区）食品药品监管部门组织实施其行政区域内的诊断试剂的抽样、样品寄送和信息录入等工作。本次抽验共收到巨细胞病毒 IgG 抗体检测试剂盒 15 批次，涉及 15 家生产企业，全部为国产试剂。试剂盒全部抽自生产企业。15 批次试剂盒中，酶联免疫法 11 批次，化学发光法 4 批次；符合抽样规定的试剂盒 15 批次，退样 0 批次，抽样产品信息详细数据见表 1。

1.2 方法

法定检验：依据企业产品注册标准，采用注册标准中所规定的企业参考品或国家参考品对各自试剂盒进行检验，检验项目包括阳性符合率、阴性符合率、检出限和重复性，4 个项目全部符合标准规定判定为合格，如有任意项判定不合格，本次抽验综合结论为不合格。各项目要求参见各自的产品注册标准。实验操作严格按各待测的试剂盒说明书进行。如果企业产品注册标准中规定使用企业参考品或国家参考品进行检测，则根据国家参考品的检测结果进行是否合格的判定。

探索性研究：依据 YY/T1236-2014《巨细胞病毒IgG/IgM 抗体检测试剂（盒）》的行业标准，采用人巨细胞病毒 IgG 抗体国家参考品（批号：36004-201101）对各试剂盒进行检验，检验项目和判定标准同法定检验。各项目要求如：待检试剂盒检测 10 份阳性参考品，应不得出现假阴性（准确性/阳性符合率）；检测 5 份阴性参考品，应不得出现假阳性（特异性/阴性符合率）；3 份最低检测限参考品，应均能检出（检测限/检出限/灵敏度）；批内精密度变异系数（CV%）不大于 15.0%（重复性/精密性）。实验操作严格按各待测试剂盒的说明书进行。

2 结果

2.1 法定检验

按照企业产品注册标准进行检测，如果企业产品注册标准中规定了使用企业参考品或国家参考品，则依据国家参考品的检验结果判定是否合格。本次抽验 15 批次试剂中有13 批次的注册标准要求使用企业参考品，这 13 批次巨细胞病毒 IgG 抗体检测试剂盒检测合格，其余 2 批次的注册标准是依据国家参考品的检验结果进行判定的，2 批次试剂不合格。本次法定检验的合格率为 86.7%（13/15）；2 批次试剂不合格试剂中，一家试剂盒的不合格项目是“国家阴性参考品符合率”不符合规定（有部分参考品检出阳性），以及“国家阳性参考品符合率”也不符合规定（有部分参考品检出阴性）；另一家试剂盒的不合格项目是“国家阴性参考品符合率”不符合规定（有部分参考品检出阳性）。

表 1 抽样的人巨细胞病毒（HCMV）IgG 抗体检测试剂盒

2.2 探索性研究

使用巨细胞病毒 IgG 抗体国家参考品，按照巨细胞病毒 IgG 抗体检测试剂（盒）行业标准 YY/T1236-2014 对15 个厂家的 15 个批次的试剂盒进行检测，所有项目均合格的试剂有 10 批次，合格率仅为 66.7%（10/15），不合格的产品有 5 个厂家的 5 批次，不合格率达到了 33.3%。探索性研究不合格项目的具体情况见表 2。

表 2 抽样试剂盒进行探索性研究结果不合格项列表

3 讨论

巨细胞病毒 IgG 抗体检测试剂属于三类高风险的体外诊断试剂，在临床应用中其准确性（阳性符合率）、特异性（阴性符合率）、检测限（灵敏度）、重复性都是该类试剂盒的质量控制关键指标。准确性或阳性符合率、特异性或阴性符合率项目，是在进行性能评价时，检测出的阴阳性结果与实际结果的一致性程度，反映了试剂的基本特性。检测限或灵敏度是重要的分析性能之一，反映试剂可检测的最低分析浓度。重复性是对样品做多次测定，通过这些测定值的精密度，得到试剂测定能力是否具有重现性。

中国食品药品检定研究院在 2011 年研制了巨细胞病毒 IgG 抗体国家参考品[8]（批号：36004-201101），我院起草的《巨细胞病毒 IgG/IgM 抗体检测试剂（盒）》的行业标准，已在 2014 年 6 月份通过国家食品药品监督管理总局批准并颁布，标准编号为：YY/T 1236-2014。该标准于 2015年 7 月 1 日正式实施，适用于定性检测人体血清/血浆中巨细胞病毒 IgG/IgM 抗体检测试剂（盒）（酶联免疫法）、巨细胞病毒 IgG/IgM 抗体检测试剂（盒）（化学发光法）、巨细胞病毒 IgG/IgM 抗体检测试剂（盒）（免疫荧光法）、巨细胞病毒 IgG/IgM 抗体检测试剂（盒）（免疫印迹法）等，其技术条款的设计基本上也是参考国家参考品的情况，包括外观、准确性（阳性符合率）、特异性（阴性符合率）、重复性（精密度）、检测限。

通常在无行业标准和国家参考品情况下，企业产品注册检验只能采用企业标准和企业参考品进行检验；如果有行业标准和国家参考品，则检测机构应主动采用它们进行注册检验，通过一把尺子来评判试剂质量更为公正和公平。但是由于此产品的国家参考品及行业标准迟于大部分企业标准，故大部分企业在产品注册检验时并未采用国家参考品进行检验[9]。

此次监督抽验，采用企业参考品检测，试剂合格率达100.0%（15/15），而采用国家参考品检测，合格率下降了33.3%，仅为 66.7%（10/15）。这就意味着企业参考品控制产品质量的有效性值得商榷。通常，企业参考品信息通过提供资料证明，检测机构无法核实企业参考品是否属实，因此按照企业注册产品标准进行检验，在判断产品合格存在着一定的风险。

国家参考品“阴性参考品符合率”项目不符合规定即假阳性，假阳性产生原因可能是：①样本中存在干扰物质造成，如 RF 因子等；②其他类型抗体如 IgM、不同亚型的IgG 以及同种属病原体的交叉反应等；③分析性能研究中正常参考人群的选择出现偏差，其阈值设定不合理；④生产工艺存在缺陷，比如原材料抗体筛选不严格，亲和力以及抗体反应性、特异性未充分验证，包被和封闭等工艺需要改进等，标记抗体的浓度筛选需要改进等；⑤包被抗原的因素：如果包被的基因工程抗原为融合蛋白，包含有表达载体的一些序列，有可能与血清中其他物质发生反应产生假阳性。另外抗原的纯度对特异性也有影响，目前抗原多是经过大规模表达后需要经过破碎细胞、盐析、粒子交换等分离纯化步骤才能达到一定纯度。如抗原中混有其他杂蛋白，血清中的抗体可能与这些杂蛋白反应产生假阳性。国家参考品“阳性参考品符合率”项目不符合规定即是漏检/假阴性结果，假阴性产生的主要原因可能是：①分析性能研究中正常参考人群的选择出现偏差，其阈值设定不合理，设定阈值较高，使弱阳性样本检测为阴性；②肝素或者 EDTA 等抗凝处理对样本的影响，EDTA、酶抑制剂可以抑制辣根过氧化物酶的活性，造成假阴性。重复性参考品实际为阳性样本，出现假阴性的原因同“阳性参考品符合率项目不符合规定的原因”，CV值偏高不符合规定可能由于企业生产工艺的某些环节如分装、混匀步骤不很稳定，造成同一批次的试剂盒的均一性较差。

此次抽验还发现企业提供的资料存在以下问题：①缺项问题。由于各企业产品注册标准不一样，各检测机构对于该产品标准的理解不一样，因此在检测项目的要求方面也不一样。例如，有 1 家企业在产品注册标准中没有检测限的要求而只有分析灵敏度检测，即测定零点校准品 20 次，然后测定分析灵敏度。我们认为该试剂盒是定性试剂盒，不适合通过做分析灵敏度体现检测限，所以建议在企业参考品中提供相应的检测限参考品。②注册标准要求与说明书不一致。有 1 家企业在产品执行标准中将“OD 值”明确要求如下：“试剂盒中的校正液检测 OD 值应在规定范围。阴性校正液 OD 不高于 0.250，临界校正液 OD 值为 0.600 ～1.300，阳性校正液 1#的 OD 值应在临界校正液和阳性校正液 2#之间，阳性校正液 2#的 OD 值不低于 1.300”，但是说明书中仅仅在“检验结果的解释”中提到“阴性对照的检测结果须为阴性，阳性对照的检测结果须为阳性，阳性校正液 1#的 OD 值须介于临界校正液与阳性校正液2#之间，否则检测结果不可靠，不应出具检测报告”。显然技术对 OD 值的要求明显严格于说明书，那么到底哪个是实验成立的前提呢？OD 值界定的意义何在？③说明书表述不尽规范。有 2 家在说明书的“检验方法”中预留空白孔/空白对照，读值时单波长测定 OD 值，但是并没有说明空白孔调零；另有 4 家在说明书中未说明应该在实验终止后多长时间内读取 OD 值；还有 1 家企业说明书中的检验方法未写明阳性对照及临界对照是加单孔还是复孔，但计算实例中是按照复孔求平均值。

实行医疗器械监督抽验是器械执法的一项重要技术活动，其目的是确保人民群众用械质量安全、可靠、有效；有利于促进企业整改达标，完善管理，提高产品质量，其意义在于提高全社会对医疗器械质量实行科学监督抽验重要性的认识。本次监督抽验设计的抽样企业数量不多，也没有进口企业，而且仅仅从生产企业这一个环节进行了抽样，建议今后加大抽验力度，完善和优化抽验模式，使抽验结果更能反映产品的真实质量状况。针对本次监督抽验中发现的问题，笔者建议将体外诊断试剂监督抽验工作持续深入进行下去，持续监测产品的性能，深入分析产品问题原因，继续探讨使用国家参考品作为统一的判定标准，督促企业不断改进产品质量，为公众用械安全保驾护航。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.014

国家自然科学基金（81472396）

100050 北京，中国食品药品检定研究院体外诊断试剂检定所

黄杰，Email：jhuang5522@126.com

2017-08-17