半月板细胞外基质-海藻酸水凝胶的制备及其对半月板细胞的影响

陈明学，郭维民，沈师，王振勇，王泽昊，张增增，李旭，张学亮，荆晓光，刘舒云，郝立波，韩纲，郭全义

半月板细胞外基质-海藻酸水凝胶的制备及其对半月板细胞的影响

陈明学，郭维民，沈师，王振勇，王泽昊，张增增，李旭，张学亮，荆晓光，刘舒云，郝立波，韩纲，郭全义

目的制备脱细胞半月板细胞外基质-海藻酸（AMECM-Alg）水凝胶，并研究 AMECM-Alg 水凝胶对半月板细胞增殖、再分化的影响。

方法联合物理化学方法制备 AMECM，以 AMECM 和海藻酸为原料制备 5 种不同浓度的 AMECM-Alg 水凝胶（0%、0.5%、1%、2% 和 4%）；复合 P3代半月板细胞，通过细胞死活染色、CCK8 实验、DNA 定量评估水凝胶促进细胞增殖的能力，通过胶原、糖胺多糖定量，RT-PCR 评估水凝胶促进细胞再分化的能力。结果死活细胞染色、CCK8 实验和 DNA 定量实验表明AMECM-Alg 水凝胶均能促进细胞的增殖，其中以 2% 浓度组作用最强；胶原和糖胺多糖定量结果表明 AMECM-Alg水凝胶均能促进半月板细胞分泌细胞外基质，其中 2% 浓度组明显优于其他组。RT-PCR 结果显示半月板细胞在 2%浓度组水凝胶中 collagen Ia2、collagen IIa1、SOX9 和aggrecan 基因表达量明显高于其他组。结论AMECM-Alg 水凝胶具有良好的细胞相容性，既能促进细胞增殖，又能促进细胞再分化，其中以 2% 浓度组的作用最强，在未来组织工程半月板生物材料研究方面具有很好的应用前景。

半月板，胫骨； 组织工程； 水凝胶； 细胞外基质； 海藻酸

由于运动外伤、关节疾病、衰老等原因，半月板损伤在临床上相当常见，半月板损伤会引起患者膝关节疼痛、肿胀，从而降低患者的生存能力，影响患者的身心健康[1]。目前针对半月板损伤的治疗手段主要是部分或全部半月板切除[2]，半月板切除虽然能获得短期的症状缓解和功能恢复，但是最终都不可避免地会导致骨性关节炎[3-4]。由于半月板结构特殊，功能复杂，损伤半月板的再生与修复目前仍是充满挑战性的科学难题。组织工程技术的出现为半月板的再生与修复提供了新的思路。组织工程的关键要素主要包括种子细胞、支架材料和生物因子[5-6]。由于半月板细胞是成体细胞，体外扩增过程中不仅增殖速度缓慢，而且会逐渐丧失细胞表型，主要原因是平面培养不能很好地模拟细胞生长的微环境[7]。为此本实验创新性地提出了通过制备脱细胞半月板细胞外基质-海藻酸（AMECM-Alg）水凝胶的设想，试图研究出一种能很好地模拟细胞生长微环境的生物材料，在体外扩增过程中既能促进半月板细胞的增殖，同时又能很好地维持半月板细胞表型，促进半月板细胞的再分化。为此本实验通过制备不同浓度 AMECM-Alg 水凝胶，从维持半月板细胞活性，促进半月板细胞增殖和再分化方面进行评估，选择出最佳浓度的 AMECM-Alg 水凝胶，为组织工程半月板生物材料的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料及动物 新鲜猪半月板购自北京市屠宰场；海藻酸购自阿拉丁公司；离心管、培养瓶、培养皿、96 孔板购自美国 Corning 公司；新西兰大白兔购自解放军总医院实验动物中心。

1.1.2 试剂 氯胺酮注射液购自华北制药集团有限责任公司；DMEM 培养基购自美国 Corning 公司；胎牛血清购自美国 Hyclone 公司；0.25% 胰蛋白酶、胶原酶购自美国 Sigma 公司；青霉素-链霉素双抗购自美国 Gibco 公司；CCK8 试剂盒购自日本同仁公司；DNA 提取试剂盒购自北京Tiangen 公司；DNA 定量试剂盒购自美国 Invitrogen公司；糖胺多糖定量试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司；羟脯氨酸定量试剂盒购自南京建成科技有限公司。

1.1.3 仪器 低温高速离心机为德国 Thermo 公司产品；CO2培养箱为德国 Heraeus 公司产品；JSM-6700F 型扫描电镜为日本 JEOL 公司产品；BH-2 型倒置显微镜、IX 70 型荧光显微镜为日本Olympus 公司产品；TCS SP8 共聚焦显微镜为德国Leica 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 AMECM 的制备 脱细胞半月板细胞外基质的制备方法参照我们实验室前期发表的文献[8]。

1.2.2 AMECM-Alg 水凝胶的制备 将制备好的AMECM 置于孔板内进行冷冻干燥，然后运用干法粉碎法粉碎成 AMECM 粉末，用筛孔为 50 和100 μm 的不锈钢筛，制备直径 50 ～ 100 μm 的AMECM 粉末，将不同浓度（0%、0.5%、1%、2%和 4%）的 AMECM 粉末和 2% 的海藻酸混合制备 5 种不同浓度（0%、0.5%、1%、2% 和 4%）的 AMECM-Alg 水凝胶。

1.2.3 兔半月板细胞的扩增 无菌条件下取 3 ～4 周龄新西兰大白兔膝关节半月板，去除半月板外侧部分，PBS 反复漂洗 3 遍后，剪成组织微粒，加入 0.15% II 型胶原酶，37 ℃ 下磁力搅拌消化40 min，待至组织块被完全消化后加入含体积分数 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液终止消化，1500 r/min 离心 5 min，弃去上清液，加入培养液吹打混匀，接种至培养瓶后，置于 37 ℃、体积分数为 5% CO2细胞培养箱中。每 3 天更换培养液。待生长至 90% 融合时传代，使用 0.25% 胰酶进行消化传代培养，取 P3代细胞备用。

1.2.4 扫描电镜检测 将制备好的不同浓度的AMECM-Alg 水凝胶冷冻干燥，喷金后，直接进行扫描电镜观察。

1.2.5 死活细胞染色 将 2 × 105个 P3代的兔半月板细胞接种于 5 种不同浓度的 AMECM-Alg水凝胶，置于 37 ℃、5% CO2培养箱孵育 7 d 后；无菌 PBS 溶液漂洗 3 次后加入二乙酸荧光素（FDA）孵育 5 min，去除 FDA 后 PBS 漂洗3 次，碘化丙啶（PI）孵育 5 min，去除 PI 后 PBS再次清洗 3 次，然后进行共聚焦显微镜观察。

1.2.6 细胞增殖实验 用 CCK8 法测定不同浓度的 AMECM-Alg 水凝胶对半月板细胞增殖能力的影响。首先将不同浓度的 AMECM-Alg 水凝胶分别复合 104个半月板细胞，将 5 μl 的水凝胶细胞复合物加入模具中用 CaCl2交联，每组制备5 个样本，交联后于 96 孔板内添加 100 μl 培养液体，37 ℃、5% CO2培养箱内生长培养 1、4、7、14 d 后，分别加入 10 μl CCK8 试剂，37 ℃、5% CO2培养箱内孵育 2.5 h 后用酶标仪测量 450 nm处的 OD 值。

1.2.7 DNA 定量分析 对 5 种不同浓度的AMECM-Alg 水凝胶分别于 1、4、7、14 d 进行DNA 含量进行测定，并判断间接半月板细胞的增殖情况，具体实验步骤按照 DNA 提取试剂盒和DNA 定量试剂盒说明进行。

1.2.8 胶原含量测定 羟脯氨酸在胶原蛋白中约占 13.4%，在弹性蛋白中极少，不存在其他蛋白中，因此羟脯氨酸的量能反映胶原的含量。将 2 × 105个半月板细胞种植在不同浓度的 AMECM-Alg 水凝胶体外培养 1、4、7、14 d，于不同时间点取材（每组 5 个样本），采用羟脯氨酸法测定不同组别中的胶原含量，具体实验步骤依据羟脯氨酸测试盒说明进行。半月板细胞分泌胶原含量为 1、4、7、14 d 不同组别的胶原总含量减去 0 d 相应组别的胶原初始含量。

1.2.9 糖胺多糖含量测定 将 2 × 105个半月板细胞种植在不同浓度的 AMECM-Alg 水凝胶体外培养 1、4、7、14 d，于不同时间点取材（每组 5 个样本），采用二甲基亚甲基蓝（DMMB）比色法测定糖胺多糖的含量，具体实验步骤依据糖胺多糖总含量二甲基亚甲基蓝比色法定量检测试剂盒说明进行。半月板细胞分泌糖胺多糖含量为 1、4、7、14 d 不同组别的糖胺多糖总含量减去 0 d 相应组别的糖胺多糖初始含量。

1.2.10 特异性基因 RT-PCR 检测 将 2 × 105个半月板细胞种植在不同浓度的 AMECM-Alg 水凝胶体外培养 14 d，然后使用 TRIzol 提取水凝胶细胞复合物中的 RNA，反转录获取 cDNA，RT-PCR的反应体系（特异性引物）见表 1，该反应体系首先 95 ℃ 预变性 2 min；95 ℃ 变性 15 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，共循环 40 次。选择GAPDH 作为内标，以平面培养的 P3代半月板细胞为对照样本，使用 2-△△CT的方法进行标准化计算，计算出各样品的目的基因相对定量结果，即可获得目的基因 mRNA 转录水平的差异。

表 1 RT-PCR 检测目的基因引物序列Table 1 Primer sequences of target genes used for RT-PCR

1.3 统计学处理

所有计量资料均以±s表示，采用SPSS17.0 统计软件，运用单因素方差分析，P＜ 0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AMECM-Alg 水凝胶的大体观察和扫描电镜观察

图 1A ～ E 为 5 种不同浓度的 AMECM-Alg水凝胶大体观，经 CaCl2交联后 AMECM-Alg 水凝胶呈凝胶状，随着 AMECM 浓度的增加，水凝胶由透明逐渐变为浑浊。扫描电镜观察显示（图 1F～ J），随着 AMECM 浓度的增加，水凝胶的三维空间结构变得更加致密，孔径逐渐减小。

图 1 5 种不同浓度的 AMECM-Alg 水凝胶大体观（A ～ E）和扫描电镜图（F ～ J）Figure 1 Gross observation (A - E) and SEM micrograph (F - J) of five different AMECM-Alg hydrogel scaffolds

2.2 细胞死活染色结果

体外培养 7 d 时，共聚焦荧光显微镜下观察，半月板细胞能均匀分布于 AMECM-Alg 水凝胶；不同浓度的 AMECM-Alg 水凝胶均可见存活的半月板细胞（绿色荧光点），如图 2A、D、G、J、M所示，均未见明显的死亡的半月板细胞（红色荧光点），如图 2B、E、H、K、N 所示，提示 AMECM-Alg水凝胶具有良好的细胞相容性；其中 2% 浓度组保持最高的细胞活性，可见大量增殖的半月板细胞，细胞数量明显多于其他组，提示 2% AMECM-Alg水凝胶更利于维持半月板细胞的活性，促进细胞的增殖。

2.3 细胞增殖实验结果

将 P3代的半月板细胞种植于不同浓度的AMECM-Alg 水凝胶中体外培养 1、4、7、14 d 后CCK8 法检测OD值，结果（图 3）显示，随着培养时间的推移，不同浓度的 AMECM-Alg 水凝胶的细胞数量均呈现不同程度的递增趋势；提示AMECM-Alg 水凝胶具有良好的细胞相容性，有利于细胞的增殖；其中第 4、7 和 14 天时，可见 2%浓度组细胞增殖率明显高于其他组，有显著性统计学差异（P＜ 0.05），表明 2% AMECM-Alg 水凝胶较其他浓度的水凝胶能更好促进半月板细胞的增殖。

图 2 半月板细胞在不同浓度 AMECM-Alg 水凝胶中体外培养 7 d 的细胞死活染色结果（比例尺：200 μm）Figure 2 Live/dead cell staining of the meniscal cells/AMECM-Alg hydrogel constructs culturing in vitro for 7 d (Scale： 200 μm)

2.4 DNA 含量测定结果

将 P3代的半月板细胞种植于不同浓度的AMECM-Alg 水凝胶中体外培养 1、4、7、14 d；DNA 含量测定结果显示（图 4），不同浓度的AMECM-Alg 水凝胶随着培养时间的推移，DNA含量均逐渐增加，提示半月板细胞在不同浓度的AMECM-Alg 水凝胶中均能不断增殖；其中 2% 浓度组在不同时间点 DNA 含量均高于其他组，有显著性统计学差异（P＜ 0.05），验证了 2% AMECM-Alg水凝胶能更好促进半月板细胞的增殖。

2.5 胶原含量测定实验结果

将 P3代的半月板细胞种植于不同浓度的AMECM-Alg 水凝胶中体外培养 1、4、7、14 d 后羟脯氨酸法测定胶原含量，结果显示（图 5），随着培养时间的延长，不同组的 AMECM-Alg 水凝胶中细胞分泌的胶原含量均不断增加，提示AMECM-Alg 水凝胶有利于促进半月板细胞分泌胶原；其中在 1、4、7、14 d 时，2% AMECM-Alg水凝胶组所分泌的胶原含量均显著高于对照组，有显著性统计学差异（P＜ 0.05）；提示 2% AMECM-Alg水凝胶能更好促进半月板细胞分泌胶原。

图 3 CCK8 考察不同浓度的 AMECM-Alg 水凝胶对半月板细胞增殖的影响（*表示同一时间点与其他各组之间的比较 P ＜ 0.05）Figure 3 CCK8 test the effects of five different AMECM-Alg hydrogel scaffolds on meniscal cell proliferation (*P ＜ 0.05 versus other groups at the same time point)

图 4 半月板细胞在 5 种不同浓度 AMECM-Alg 水凝胶中体外培养 1、4、7、14 d 的 DNA 定量结果Figure 4 DNA quantitative analysis results of meniscal cells/AMECM-Alg hydrogel constructs culturing in vitro for 1, 4, 7 and 14 d

2.6 糖胺多糖含量测定实验结果

图 5 半月板细胞在 5 种不同浓度 AMECM-Alg 水凝胶中体外培养 1、4、7、14 d 的胶原定量结果（*表示同一时间点与其他各组之间的比较 P ＜ 0.05）Figure 5 Collagen quantitative analysis results of meniscal cells/AMECM-Alg hydrogel constructs culturing in vitro for 1, 4, 7 and 14 d (*P ＜ 0.05 versus other groups at the same time point)

图 6 半月板细胞在 5 种不同浓度 AMECM-Alg 水凝胶中体外培养 1、4、7、14 d 的糖胺多糖定量结果（*表示同一时间点与其他各组之间的比较 P ＜ 0.05）Figure 6 GAG quantitative analysis results of meniscal cells/AMECM-Alg hydrogel constructs culturing in vitro for 1, 4, 7 and 14 d (*P ＜ 0.05 versus other groups at the same time point)

将 P3代的半月板细胞种植于不同浓度的AMECM-Alg 水凝胶中体外培养 1、4、7、14 d 后DMMB 法测定含量，结果（图 6）显示，随着时间的推移，不同浓度组的 AMECM-Alg 水凝胶所分泌的糖胺多糖含量均呈现递增的趋势，提示不同浓度的 AMECM-Alg 水凝胶有利于细胞分泌糖胺多糖；其中 2% AMECM-Alg 水凝胶组所分泌的含量在不同时间点均显著高于对照组，有显著性统计学差异（P＜ 0.05），表明 2% AMECM-Alg 水凝胶能更好促进半月板细胞分泌糖胺多糖。

图 7 半月板细胞在不同浓度 AMECM-Alg 水凝胶中体外培养 14 d 的 collagen Ia2（A）、collagen IIa1（B）、SOX9（C）、aggrecan（D）的 mRNA 表达水平（*表示同一时间点与其他各组之间的比较 P ＜ 0.05）Figure 7 Collagen Ia2 (A), collagen IIa1 (B), SOX9 (C), aggrecan (D) mRNA expression levels of the meniscal cells seeded on five different AMECM-Alg hydrogel scaffolds for 14 d (*P ＜ 0.05 versus other groups at the same time point)

2.7 特异性基因表达的 RT-PCR 检测

通过 RT-PCR 检测半月板细胞在不同浓度AMECM-Alg 水凝胶 collagen Ia2、collagen IIa1、SOX9、aggrecan 的 mRNA 表达水平。结果（图 7）表明，在体外培养 14 d 后；半月板细胞在AMECM-Alg 水凝胶中 collagen Ia2、collagen IIa1、SOX9、aggrecan 的 mRNA 表达水平都明显高于平面培养的 P3代半月板细胞（P＜ 0.05），提示AMECM-Alg 水凝胶有利于维持细胞表型，促进半月板细胞再分化；其中半月板细胞在 2% AMECM-Alg水凝胶组中 collagen Ia2、collagen IIa1、SOX9、aggrecan 的 mRNA 表达水平都高于其他浓度组，有显著性差异（P＜ 0.05），提示 2% AMECM-Alg水凝胶能更好促进半月板细胞维持细胞表型和促进再分化，同时也解释了半月板细胞在 2% AMECM-Alg 水凝胶组中分泌的胶原和糖胺多糖含量明显高于其他浓度组。

3 讨论

半月板损伤是最常见的膝关节内损伤之一，由于半月板结构特殊，功能复杂，半月板损伤后临床治疗相对困难。组织工程技术有望成为彻底解决半月板损伤的最佳方法，支架材料的选择目前仍是限制半月板再生修复的难题之一。我们前期研究发现AMECM 在平面扩增时能维持半月板细胞表型，促进半月板细胞的增殖和细胞外基质的分泌[9]。藻酸盐是已得到美国国家食品药物管理局（FDA）批准的天然生物材料，目前主要应用于伤口覆盖材料、药物缓释载体、食品添加剂等领域；海藻酸钠水凝胶是目前常用的三维细胞培养支架材料之一，不仅生物相容性好，免疫原性低，同时还具有一定的力学性能，为细胞增殖和分化提高良好的环境支撑[10-12]。为此我们提出联合利用 AMECM 和海藻酸钠两种天然材料作为组织工程半月板的支架材料的设想，试图更好地模拟半月板细胞生长的天然微环境，有利于维持半月板细胞的活性，促进半月板细胞增殖，维持半月板细胞表型，促进细胞再分化。

扫描电镜结果显示不同浓度的 AMECM-Alg水凝胶三维空间结构差别较大，随着 AMECM 浓度的增加，水凝胶的三维结构变得更加致密，三维孔径变得更小。细胞死活染色表明半月板细胞在不同浓度的 AMECM-Alg 水凝胶均保持较高的活性，提示 AMECM-Alg 水凝胶具有较好的细胞相容性，这可能与两种材料均来源于天然的生物材料直接相关。CCK8 增殖实验和 DNA 定量实验结果证实了 AMECM-Alg 水凝胶能够促进细胞的增殖，其中 2% 浓度组作用最强，这可能与水凝胶中含有 AMECM 有关，我们前期实验结果证实，AMECM 中含有胶原和糖胺多糖等多种活性成分能有效地促进半月板细胞的增殖，所以在 0% 到2% 浓度组中，随着 AMECM 浓度的增加，促进半月板细胞增殖的能力越强，而 4% 组促进半月板细胞增殖能力的下降可能与致密的三维空间结构和较小的三维孔径有关，Rowland 等[13]曾报道，较低的孔径和孔隙率不利于细胞的增殖。

胶原和糖胺多糖定量结果表明 AMECM-Alg水凝胶均能够促进半月板细胞分泌胶原和糖胺多糖，这提示 AMECM-Alg 水凝胶能很好地模拟半月板细胞生长的微环境，促进细胞外基质的分泌。其中在 0% 到 2% 浓度组中，随着 AMECM 浓度的增加，分泌的胶原含量也随之增加，提示AMECM 对于促进细胞外基质的分泌发挥着重要作用。而 4% 浓度组的胶原和分泌量有所下降，可能是由于致密的空间结构不利于细胞更好地增殖，进而导致细胞外基质分泌量相应地下降。RT-PCR结果表明 AMECM-Alg 水凝胶有利于维持半月板细胞表型，促进半月板细胞再分化，也证实了 2%浓度的 AMECM-Alg 水凝胶相对于其他浓度组能很好地模拟半月板细胞生长的微环境，促进特异基因的高表达。

AMECM-Alg 水凝胶由两种纯天然生物材料制备而成，具有良好的三维空间结构，能够促进半月板细胞的增殖，维持细胞的表型，促进细胞的再分化以及进一步促进细胞外基质的分泌，是一种理想的组织工程半月板生物材料。然而 AMECM-Alg水凝胶生物力学性能较差，若能与 3D 打印技术结合，将会在未来组织工程半月板修复中具有很好的应用前景。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(6):505-512

第二届中美肿瘤精准医学高峰论坛在天津举行

2017年11月1-3日，第二届中美肿瘤精准医学高峰论坛在天津举行。中国工程院院士郝希山和美国国家医学院院士、哈佛大学医学院 Raju Kucherlapati 共同担任大会主席，中国医药生物技术协会副理事长李少丽出席会议并致辞，吴朝 晖秘书长出席会议。

精准医学是医学科技发展的最前沿、最受关注的热点，是肿瘤治疗发展的新方向。在天津市政府的大力支持下，2016年9月22-24日在天津成功举办了“第一届中美肿瘤精准医学高峰论坛”，会议得到了国内外高度评价和赞赏，中美各方学术组织一致希望将此高峰论坛打造成肿瘤精准医学领域具有重要影响力的品牌年会。

如今，通过双方的积极努力，第二届中美肿瘤精准医学高峰论坛对肿瘤精准医学临床应用的难点、要点及前景进行了深入探讨，为相关专家和行业领导者搭建了分享学术成果和交流经验的国际化平台，起到促进交流、加强合作、推动中国精准医学快速发展和进步的作用。

同时，会议期间还举办了“肿瘤精准分子诊断及大数据分析在临床医学中的应用”培训班。Raju Kucherlapati 院士等国内外著名专家进行大会报告，并就中国精准医学的现状与未来等热点问题进行深入的专题讨论。

会议期间，参会的国内外著名专家亲临天津国际精准肿瘤中心并为医院的战略性目标和发展规划提供了咨询和建议，同时也为天津市及京津冀的医疗健康事业的发展提出建设性意见，为精准医学的可持续发展提供动力源泉。

The preparation of AMECM-Alg hydrogel scaffolds and theirs effect on meniscal fibrochondrocytes

CHEN Ming-xue, GUO Wei-min, SHEN Shi, WANG Zhen-yong, WANG Ze-hao, ZHANG Zeng-zeng, LI Xu, ZHANG Xue-liang, JING Xiao-guang, LIU Shu-yun, HAO Li-bo, HAN Gang, GUO Quan-yi

ObjectiveTo manufacture accellular meniscus extracellular matrix-alginate (AMECM-Alg) hydrogel scaffolds and investigate their biological effect on the cell viability, proliferation, and re-differentiation of the meniscal fibrochondrocytes.

MethodsCombined physical and chemical methods were used to prepare accellular meniscus extracellular matrix. Five concentrations of AMECM-Alg hydrogel were manufactured by AMECM and alginate with different ratios (0%, 0.5%, 1%, 2%, 4%). The microstructrue of AMECM-Alg hydrogel was investigated by scanning electron microscopy (SEM). Passaged meniscus fibrochondrocytes were seeded in the five different hydrogel scaffolds, and then cultured for 1, 4, 7 and 14 d. Live/dead staining was used to evaluate the cell viability. The cell proliferation on different hydrogel scaffolds was studied by CCK8 test and DNA quantification. Re-differentiation of the passaged meniscal fibrochondrocytes was determined by biochemical assays for GAG and collagen as well as RT-PCR.

ResultsSEM results showed that the porosity of the hydrogel scaffolds became smaller as the AMECM concentration increased. Live/dead staining results indicated that meniscal fibrochondrocytes could maintain good viability in the different hydrogel scaffolds. The results of CCK8 test and DNA quantification revealed that AMECM-Alg hydrogels could promote cell proliferation, with 2% group having the strongest effect. GAG and collagen content assessment results demonstrated that AMECM-Alg hydrogels enhanced collagen and GAGs production, with 2% group inducing the greatest effect. RT-PCR results revealed that AMECM-Alg hydrogels up-regulated the expression of collagen Ia2, collagen IIa1, SOX9, aggrecan, with 2% group exhibiting the robustest effect.

ConclusionAMECM-Alg hydrogel provides a suitable microenvironment for seed cells which may maintain cell viability and promote the cell proliferation and re-differentiation, with 2% group having the strongest effect. In conclusion, 2% AMECM-Alg hydrogel scaffold is a promising candidate biomaterial for meniscus tissue engineering.

Menisci, tibial; Tissue engineering; Hydrogel; Extracellular matrix; Alginate

Author Affiliation:Institute of Orthopaedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

GUO Quan-yi, Email： doctorguo@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.003

国家自然科学基金（81472092）；国家高技术研究发展计划（863 计划）（2015AA020303）；国家重点研发计划（2017YFC1104102、2017YFC 1103404）；北京市科技专项（Z161100005016059）；北京市自然科学基金（7172203）

100853 北京，中国人民解放军总医院骨科研究所

郭全义，Email：doctorguo_301@163.com

2017-09-05

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2017, 12(6):505-512