程控降温法与二步法对胎盘间充质干细胞冻存效果的影响

章毅，陈侃俊，李萍，李冉，陈亮，陆薇，伍婷，金魏名

程控降温法与二步法对胎盘间充质干细胞冻存效果的影响

章毅*，陈侃俊*，李萍，李冉，陈亮，陆薇，伍婷，金魏名

目的观察对比程控降温法与二步法对胎盘间充质干细胞深低温冻存效果的影响。

方法分别采用程控降温法和二步法对 3 个批次的pMSCs 进行液氮冻存，3 个月后进行复苏，测定细胞存活率、活细胞数，观察体外培养 1 ～ 4 d 时的细胞形态，CCK8法进行细胞增殖检测，同时用流式细胞术鉴定细胞表面标记抗原，用油红 O 染色、茜素红 S 染色和 Masson 染色进行细胞三向分化能力鉴定。

结果程控降温法对比二步法冻存的细胞活率在冻存前、复苏后均无显著差异（P＞ 0.05）。倒置显微镜观察细胞形态，均在 24 h 时贴壁，呈短梭形，96 h 时细胞密度达到 95%左右，均匀铺满视野。增殖测定结果显示，培养第 3 ～ 5 天为两组细胞的对数生长期，第 5 天时增殖倍数达到最高，分别为第 1 天的 6.44 倍和 6.29 倍，经过短暂的平台期后进入衰亡期，增殖趋势一致；但分别在第 4 天（P＜ 0.01）、第 6 天（P＜ 0.05）和第 7 天（P＜ 0.05）时，程控降温法冻存的细胞存活率极显著或显著高于二步法冻存的细胞。两种方法冻存细胞的表面标志性抗原 CD73、CD90、CD105阳性细胞数百分比分别为 99.85%、99.87%、96.45% 和99.73%、99.73%、96.17%。诱导 14 d 后两组 pMSCs 均出现明显的成脂、成软骨、成骨细胞特性。

结论采用程控降温法或二步法冻存 pMSCs 均能很好地维持细胞活力及生物特性，在条件允许情况下宜采用程控降温法，以获得增殖能力更好的种子细胞。

低温保存； 胎盘间充质干细胞； 程控降温法； 二步法

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我增殖能力和多向分化潜能的干细胞类型，最早从骨髓中分离得到，后来发现在脂肪、肝脏、皮肤、软骨、外周血等多种组织中也有少量存在。最新研究表明，MSCs 具有促进移植造血干细胞归巢、预防移植物抗宿主病、调节免疫功能、促进损伤组织修复等作用，被认为是再生医学和组织工程领域重要的种子细胞和最具开发潜力的治疗工具。胎盘间充质干细胞（placenta derived mesenchymal stem cells，pMSCs）不仅具有间充质干细胞的功能特性，相比于其他来源，还具有含量丰富、获取过程为非侵袭性操作、低免疫原性、实现胎盘生物资源再利用等优点，是目前用于科学研究和临床应用最广泛的间充质干细胞类型之一。随着人们对 MSCs 研究的不断拓展和深入，种子细胞的质量变得尤为重要。低温冻存作为 pMSCs 保存的重要手段，其对冻存细胞活力、生物学特性等质量参数和细胞数量的影响将直接关系后续研究及临床药物开发的有效开展。本文以胎盘间充质干细胞为研究对象，采用程控降温法和二步法对其进行为期 3 个月的深低温冻存，观察两种冻存方法对 pMSCs 增殖能力、生物学特性和分化潜能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 独立采集 3 个批次胎盘，源于足月产健康新生儿，经产妇或家属签署知情同意书后获得，符合国家相关法律和伦理委员会规定。成脂、成软骨、成骨诱导试剂盒以及 FBS、DMEM为美国 Gibco 公司产品；CCK8 试剂盒为上海碧云天生物技术有限公司产品；MSC Phenotyping Kit（CD105-PE、CD90-FITC、CD73-APC、CD14-/CD19-/CD34-/CD45-PerCP）为德国 Miltenyi Biotec 公司产品；油红 O 染液、Masson 染液、茜素红 S 染液为南京建成公司产品；0.4% 台盼蓝、DMSO 为美国 Sigma 公司产品。

1.1.2 仪器 CryoMed 7453 型程控降温仪购自美国 Thermo 公司；MVE 1879P-190AF-GB-BB 型气相液氮罐购自美国 MVE 公司；自动细胞计数仪购自美国 Invitrogen 公司；FACS Calibur 流式细胞仪购自美国 BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 pMSCs 的分离培养 无菌条件下剪取胎盘绒毛膜组织，剪成约 3 mm3的碎块，加入 II 型胶原酶 37 ℃ 恒温消化 1.5 h，室温 2000 r/min 离心 10 min，加入含 10% FBS 的 DMEM 培养基重悬细胞，置于 37 ℃、5% CO2恒温培养箱内进行培养，在倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长情况，待细胞融合度达到 80% ～ 90% 时，0.25% 胰酶消化传代，接种密度为 5 × 104个/ml，每 2 天为细胞全量换液，每 3 ～ 4 天传代 1 次，倒置显微镜下观察 pMSCs 形态并拍照记录。

1.2.2 pMSCs 的冻存 冻存液由 10% DMSO、30% FBS 和 60% DMEM 按体积比组成，现配现用。取 P4代 pMSCs，待其细胞融合度达到 80% ～90% 时，胰酶消化，室温 1500 r/min 离心 5 min，用冻存液重悬后加入冻存管，冻存细胞密度为（1 ～ 5）× 106个/ml，经程控法或二步法对细胞进行冻存。

程控降温法的冻存程序为：以 1 ℃/min 的速率从 4 ℃ 降温至 0 ℃，维持 5 min，再以 1 ℃/min的速率降温至 -30 ℃，接着以 5 ℃/min 的速率降温至 -80 ℃，最后直接置于 -196 ℃ 气相液氮罐中保存。二步法冻存程序为：将细胞直接转至-80 ℃ 冰箱保存 12 h，然后置于气相液氮罐中保存。同一胎盘样本的两个冻存组各含 6 管 pMSCs，取 3 个批次胎盘重复实验。

1.2.3 pMSCs 的复苏 细胞冻存 3 个月后，从液氮中取出，于 37 ℃ 预热的恒温水浴中来回晃动，1 min 中内完成解冻，用 75% 酒精棉球擦拭冻存管外壁，将细胞转移到 15 ml 离心管中，加入10 ml 培养基，混匀，室温 1500 r/min 离心 5 min，弃上清，加入 3 ml 培养基重悬细胞，取 10 μl 与台盼蓝染液 1∶1 混匀后计数。细胞回收率（%）=（复苏总细胞数/冻存总细胞数）× 100%；冻存活率（%）=（冻存活细胞数/冻存总细胞数）× 100%；复苏活率（%）=（复苏活细胞数/复苏总细胞数）× 100%。

1.2.4 pMSCs 表面抗原检测 取复苏 pMSCs，用 PBS 调整细胞密度为 5 × 106个/ml，取 1 ml细胞分别加入鼠抗人单克隆标记抗体 CD90-FITC、CD105-PE、CD73-APC、CD14-/CD19-/CD34-/CD45-PerCP，以鼠抗人的 IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP、IgG2a-PerCP 作为同型对照，室温避光孵育 30 min，流式细胞仪上样检测。

1.2.5 pMSCs 三向分化检测 取复苏并传代培养的 P5代对数生长期 pMSCs，以5 × 104个/ml密度接种于 6 孔板中，置于 37 ℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养，待细胞融合度达到60% ～ 70% 时，弃去原培养基，分别更换为成脂、成软骨和成骨诱导分化培养基，每 3 天换液。诱导 14 d 后，分别用油红 O 染液、Masson 染液、茜素红 S 染液染色，倒置相差显微镜下观察pMSCs 的成脂、成软骨、成骨分化水平。

1.2.6 细胞增殖检测 取复苏 pMSCs，以 2.5 × 104个/ml 密度接种于 96 孔细胞培养板中，每个冻存管细胞设置 6 个复孔，在 37 ℃、5% CO2细胞培养箱中连续培养 8 d，每 24 小时加入 10 μl CCK8 工作液，37 ℃ 孵育 2 h，酶标仪检测 450 nm处吸光值。

1.3 统计学处理

采用 FlowJo 7.6.1 软件分析流式检测结果，用GraphPad Prism 6.0 软件进行作图、统计学分析，组间比较采用 one-way ANOVA，所得计量数据用x±s 表示。当 P ＜ 0.05 时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 pMSCs 复苏活率及形态

台盼蓝染色法测定冻存前、复苏后 pMSCs 活细胞数与细胞活率。结果显示，程控降温法冻存组细胞冻存前活率均值为 98.8%，复苏活率均值为98.5%，降低了 0.3%，但无显著差异（P ＞ 0.05）；二步法冻存组细胞冻存前活率为 97.5%，复苏活率均值为 97%，降低了 0.5%，也无显著差异（P ＞0.05）；同时两个冻存组细胞的冻存前、复苏后细胞活率无显著差异（P ＞ 0.05），表明程控降温法和二步法均能较好地维持 pMSCs 在冻存期间的细胞活力（表 1）。

倒置相差显微镜下观察程控降温法或二步法冻存的 pMSCs 复苏后的细胞状态，观察到接种24 h 后，细胞开始贴壁生长，形态为典型的成纤维细胞样，中间散落有透亮圆形杂细胞，培养 2 ～ 3 d处于细胞增长期，并于第 4 天时汇合成单细胞层铺满全皿，为长梭形，细胞排列紧密，成旋涡状或放射状生长。两种方法冻存的 pMSCs 经复苏培养，细胞形态较好（图 1）。

表 1 pMSCs 冻存前后的细胞活率Table 1 Survival rates of pMSCs before cryopreservation and after thawing

图 1 冻存方法对 pMSCs 形态的影响（细胞复苏后培养：A：24 h；B：48 h；C：72 h；D：96 h）Figure 1 Effects of cryopreservation methods on pMSCs morphology (cells were thawed and cultured for A： 24 h; B： 48 h; C： 72 h; D： 96 h)

2.2 CCK8 法检测 pMSCs 增殖

图 2 pMSCs 复苏培养的增殖检测结果（*P ＜ 0.05，***P ＜0.001）Figure 2 The proliferation of pMSCs after thawed detected by CCK8 method (*P ＜ 0.05, ***P ＜ 0.001)

表 2 pMSCs 相对增殖倍数分析Table 2 Analysis of the relative proliferation folds of pMSCs

进一步进行 CCK8 细胞增殖检测，结果（图 2和表 2）显示，程控降温法冻存组细胞复苏后培养第 2 ～ 5 天，其吸光值分别为培养 24 h 时的1.64、3.07、4.20 和 6.44 倍，二步法冻存组细胞培养第 2 ～ 5 天的吸光值分别为 24 h 时的 1.46、2.83、3.60 和 6.29 倍，其对数生长期均出现在培养第 3 ～ 5 天之间，第 5 天时细胞增殖达到最大；之后，经过短暂的平台期，于第 6 天时进入衰亡期，6 ～ 8 d 时程控降温冻存组和二步法冻存组细胞的吸光值分别降低为 24 h 时的 5.70、3.48、2.93倍和 5.24、2.97、2.70 倍，两组细胞增殖趋势一致。但是，在培养第 4 天时，程控降温冻存组细胞OD值极显著高于二步法冻存组细胞（P＜ 0.001），第 6、7 天时，OD值差异也具有显著性（P＜ 0.05）。提示程控降温法和二步法冻存的 pMSCs，其复苏后细胞增殖趋势及峰极值相一致，但程控降温法相较于二步法可令细胞较早进入对数生长期，同时推迟细胞衰亡的发生。

2.3 pMSCs 表面抗原鉴定

间充质干细胞表型抗原标志物流式细胞术检测结果发现，经程控降温法冻存 pMSCs 复苏后表面标记物 CD14+/CD19+/CD34+/CD45+细胞数为0.01%，间充质干细胞相关抗原 CD73、CD90、CD105 阳性细胞数表达率分别为 99.85%、99.87%、96.45%（图 3）；同时二步法冻存 pMSCs复苏后表面标记物 CD14+/CD19+/CD34+/CD45+细胞数百分比为 0.03%，CD73、CD90、CD105 阳性细胞数表达率分别为 99.73%、99.73%、96.17%（图 4），均高于间充质干细胞标志性抗原表达的判别标准。表明程控降温法或二步法冻存均能很好地维持 pMSCs 的生物学特性。

图 3 程控降温法冻存的 pMSCs 流式鉴定结果Figure 3 Characterization of programmed freezing pMSCs phenotype through flow cytometry

2.4 pMSCs 三向分化鉴定

pMSCs 成脂诱导 14 d，油红 O 染色结果显示程控降温法冻存组细胞和二步法冻存组细胞的胞浆周围均有大小不等的脂滴形成，并被染成红色，随着诱导时间的延长，细胞形态从短梭形趋向椭球形转变，同时诱导成脂肪细胞的数目增多，脂滴颗粒变大；pMSCs 成骨诱导 14 d，细胞体积增加，茜素红 S 染色结果显示，两组细胞均出现大量橘色沉淀颗粒，有明显的“矿化”结节，表现出成骨细胞特点；pMSCs 成软骨诱导 14 d，观察到细胞呈贴壁扁平伸展，由长梭形变成多边多角形态，经 Masson 染色后两组细胞胶原纤维呈现蓝紫色，具有软骨细胞样特点（图 5）。两组细胞在成脂、成骨和成软骨分化能力上没有表现出显著的差异。

3 讨论

随着再生医学全领域的快速发展，越来越多研究表明间充质干细胞在狼疮性肾炎[1]、小儿脑性瘫痪[2]、脊髓损伤[3]、急性心肌梗死[4]、心力衰竭[5]等重大疾病的治疗手段和药物开发方面存在巨大潜力，临床研究也已在全球范围内陆续开展，MSCs成为继胚胎干细胞、造血干细胞后的又一大研究热点，并带动其上游种子细胞库的发展。细胞冻存是保存细胞的重要手段，冻存方法是否有效和安全直接影响 MSCs 种子细胞质量，进而影响下游功能性研究的开展和临床药物的开发[6]。

图 4 二步法冻存的 pMSCs 流式鉴定结果Figure 4 Characterization of stepwise freezing pMSCs phenotype through flow cytometry

图 5 冻存方法对 pMSCs 成脂、成骨、成软骨细胞分化的影响Figure 5 Effects of cryopreservation methods on adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation capacities of pMSCs

Pilar 等[7]对比了程控降温法（降温速率1 ℃/min）和二步法冻存对脐血造血干细胞的影响，结果显示，复苏后其有核细胞数、CD34+、CFUs、细胞存活率没有显著差异，都适用于脐血库造血干细胞的冻存，但程控降温法能更好地监控冻存过程温度变化，实现标准化冻存。而 Ichino 和Ishikawa[8]研究发现，程控降温法冻存淋巴细胞的复苏活率显著高于二步法冻存，且不影响细胞功能特性。这提示不同种类的细胞，对冻存方法、冻存条件有着不同的要求。本文采用改良的 DMSO、FBS和 DMEM 联合作为细胞深低温冻存保护剂，DMEM 的加入既可为冻存细胞提供酸碱缓冲和营养物质，又可避免高比例 FBS 引起潜在的干细胞分化，已被证明适用于骨髓间充质干细胞的二步法冻存[9]。目前，关于程控降温法与二步法冻存胎盘间充质干细胞的效果对比还鲜有报道。

由于深低温冻存本身可能诱导细胞凋亡，因此冻存期间细胞活力和活细胞数量的变化对于评价冻存效果具有基础性意义[10]。本文对比分析程控降温法与二步法对 pMSCs 冻存效果的差异，结果显示，两种冻存方法下细胞在冻存前后活细胞数量均有一定损失，但复苏后细胞活率与冻存前细胞活率无显著差异，这可能是由于冻存细胞复苏、冻融与检测过程中细胞自然损失造成的。总体上，两种冻存方法对深低温保存期间细胞活力的影响较小。根据国际细胞治疗通用标准规定，MSCs 应表达CD105、CD73 和 CD90，同时低表达或不表达CD45 和 CD34，CD14 或 CD11b，CD79α 或CD19，贴壁生长，体外标准培养体系下可分化为成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞[11]。本研究中，两组 pMSCs 的表面标志抗原表达均高于 MSCs 判定标准，同时，经过诱导可成功分化为成脂、成骨和成软骨细胞，提示两种冻存方法均能很好地维持冻存细胞的完整性及生物特性。尽管复苏活率、形态学观察结果差异不显著，但是相对较低的复苏活率依然可能影响培养过程中贴壁能力强的细胞比率，有利于提高细胞复苏后的克隆形成能力[12]。另外，组织或细胞的深低温冻存在很大程度上受到冷却速率的影响，过慢或过快的冷却速率都不利于生物系统的冻存效果。冷却速率过低时，较高的溶质浓度更易引起细胞脱水造成细胞损伤；当冷却速率过高时，细胞内快速形成冰晶也可能带给细胞致命性损伤[13]。另一个影响冻存效果的重要因素是各温度阶段的维持时间和温度骤降的良好控制。当温度维持时间过短时，冷冻保护剂难以渗透进细胞膜，反之，冷冻保护剂又会产生细胞毒性[14]。这或许可以解释本文程控降温法冻存组细胞在对数生长期和衰亡早期的细胞存活率显著高于二步法冻存的细胞的原因，前者通过精确控制温度维持时长、降温速率，有利于冷冻保护剂更好地发挥细胞保护作用，这一区别在特定的增殖过程展现出来。

综上，采用常规的程控降温法或二步法冻存pMSCs，均能获得高复苏活率、高纯度、三向分化能力强的纤维样贴壁细胞，但程控降温法获得的pMSCs 增殖能力更佳，这可能是由于程控条件下细胞的冷却速率和保持时间等更符合细胞休眠程序，减少了冰晶形成及溶剂效应对细胞的潜在损伤。尽管深低温冻存是目前常用且公认的适用于保持各种细胞的形态和功能特性的细胞保存方法，但复苏细胞的临床应用效果依然受到冻存过程中多项因素的影响，如冻存速率、降温阶段的维持时长、冻存温度、冷冻保护剂的选择等[15-16]。因此，未来还需要有针对性地改进间充质干细胞冻存程序，调整优化细胞降温及冻存条件，并进一步对比不同冻存方法及冻存程序下 pMSCs 的临床应用效果，以期获得最优的 pMSCs 种子细胞，推动间充质干细胞及细胞治疗相关技术的发展。

[1] Deng D, Zhang P, Guo Y, et al. A randomised double-blind, placebo-controlled trial of allogeneic umbilical cord-derived mesenchymal stem cell for lupus nephritis. Ann Rheum Dis, 2017, 76(8)：1436-1439.

[2] Liu X, Fu X, Dai G, et al. Comparative analysis of curative effect of bone marrow mesenchymal stem cell and bone marrow mononuclear cell transplantation for spastic cerebral palsy. J Transl Med, 2017, 15(1)：48.

[3] Tan JW, Wang KY, Liao GJ, et al. Neuroprotective effect of methylprednisolone combined with placenta-derived mesenchymal stem cell in rabbit model of spinal cord injury. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(8)：8976-8982.

[4] Citro L, Naidu S, Hassan F, et al. Comparison of human induced pluripotent stem-cell derived cardiomyocytes with human mesenchymal stem cells following acute myocardial infarction. PLoS One, 2014, 9(12)：e116281.

[5] Zhao L, Liu X, Zhang Y, et al. Enhanced cell survival and paracrine effects of mesenchymal stem cells overexpressing hepatocyte growth factor promote cardioprotection in myocardial infarction. Exp Cell Res, 2016, 344(1)：30-39.

[6] Galmes A, Gutierrez A, Sampol A, et al. Long-term hematological reconstitution and clinical evaluation of autologous peripheral blood stem cell transplantation after cryopreservation of cells with 5% and 10% dimethylsulfoxide at -80 degrees C in a mechanical freezer. Haematologica, 2007, 92(7)：986-989.

[7] Pilar S, Larrea L, Soler MA, et al. Programmed versus non-programmed freezing of umbilical cord blood. Haematologica, 2000, 85(8)：890-891.

[8] Ichino Y, Ishikawa T. Effects of cryopreservation on human lymphocyte functions： comparison of programmed freezing method by a direct control system with a mechanical freezing method. J Immunol Methods, 1985, 77(2)：283-290.

[9] Luo Y, Yu Q, Ding W, et al. Effect of cryopreservation on the biological characteristics of adult bone marrow mesenchymal stem cells. Chin J Pathophysiology, 2006, 22(2)：384-387. (in Chinese)罗依, 余勤, 丁伟, 等. 低温冻存对成人骨髓间质干细胞生物学特性的影响. 中国病理生理杂志, 2006, 22(2)：384-387.

[10] Schmidt-Mende J, Hellström-Lindberg E, Joseph B, et al. Freezing induces artificial cleavage of apoptosis-related proteins in human bone marrow cells. J Immunol Methods, 2000, 245(1-2)：91-94.

[11] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 2006, 8(4)：315-317.

[12] Shivakumar SB, Bharti D, Subbarao RB, et al. DMSO- and serum-free cryopreservation of wharton's jelly tissue isolated from human umbilical cord. J Cell Biochem, 2016, 117(10)：2397-2412.

[13] Mazur P, Leibo SP, Chu EH. A two-factor hypothesis of freezing injury. Evidence from Chinese hamster tissue-culture cells. Exp Cell Res, 1972, 71(2)：345-355.

[14] Fong CY, Subramanian A, Biswas A, et al. Derivation efficiency, cell proliferation, freeze-thaw survival, stem-cell properties and differentiation of human Wharton's jelly stem cells. Reprod Biomed Online, 2010, 21(3)：391-401.

[15] Castillo Alvarez A, Morier Días L, Pérez Forcada V, et al. Effect of various factors during cryopreservation on the morphology and viability of several poikilothermic cell lines. Rev Cubana Med Trop, 1990, 42(2)：188-196.

[16] Worsham DN, Reems JA, Szczepiorkowski ZM, et al. Clinical methods of cryopreservation for donor lymphocyte infusions vary in their ability to preserve functional T-cell subpopulations. Transfusion, 2017, 57(6)：1555-1565.

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(6):513-519

Effects of cryopreservation methods on human pMSCs: programmed versus stepwise freezing

ZHANG Yi, CHEN Kan-jun, LI Ping, LI Ran, CHEN Liang, LU Wei, WU Ting, JIN Wei-ming

ObjectiveTo evaluate the effects of programmed or stepwise freezing on human placental mesenchymal stem cells (pMSCs).MethodsProgrammed or stepwise freezing was applied to three batches of pMSCs cryopreservation at -196 ℃ for three months. Cell viability and proliferation were measured through Trypan blue staining and CCK8 assay after being thawed and seeded, respectively. We further determined the characteristic antigenic markers of mesenchymal stem cells by flow cytometry. The adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation capacities of pMSCs were also tested by Oil red O, Alizarin red S and Masson staining, respectively.ResultsThere was no significant difference with respect to the cell viability between programmed and stepwise freezing of pMSCs before or after being thawed (P＞ 0.05). Both groups of pMSCs adhered after 24 h culture, and reached about 95% density after 96 h. The pMSCs proliferation was in a logarithmic phase between 3 to 5 d cell culture and then reached to a declined phase. Cell viability of pMSCs cryopreserved by programmed freezing was significant higher than that by stepwise freezing at 4 d (P＜ 0.01), 6 d (P＜0.05) and 7 d (P＜ 0.05) culture. Moreover, both methods preserved the expression of antigenic markers and differentiating capacity of pMSCs.ConclusionThe cell viability and biological characteristics of pMSCs can be maintained well by programmed method or stepwise cryopreservation. It is worth mentioning that the programmed cryopreservation method should be used to obtain the seed cells with better proliferation ability under permissible conditions.

Cryopreservation; Placental mesenchymal stem cells; Programmed freezing; Stepwise freezing

Author Affiliation:Shanghai Cord Blood Bank/Shanghai Stem Cell Technology Co., Ltd./China Stem Cell Group Co., Ltd., Shanghai 200051, China

WU Ting, Email： wuting@shanghaicordblood.org

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.004

上海市自然科学基金（16ZR1429200）；上海市科委研发平台专项（16DZ2293000）；上海市嘉定区科委工程技术研究中心项目；上海市企事业专利工作试点单位项目；上海张江国家自主创新示范区专项发展资金重大项目（ZJ2017-ZD-010）

200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院

伍婷，Email：wuting@shanghaicordblood.org

2017-08-21

*同为第一作者

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2017, 12(6):513-519