孕酮对β淀粉样蛋白致伤神经干细胞存活及其Caspase-3表达的影响

肖韩艳 冯 莹 徐甜颖 张本卓 袁春华 毕鹏翔

(牡丹江医学院第二附属医院神经内科，黑龙江 牡丹江 157011)

孕酮对β淀粉样蛋白致伤神经干细胞存活及其Caspase-3表达的影响

肖韩艳 冯 莹 徐甜颖 张本卓 袁春华 毕鹏翔1

(牡丹江医学院第二附属医院神经内科，黑龙江 牡丹江 157011)

目的研究孕酮(PROG)对β淀粉样蛋白(Aβ)1～40致伤的海马神经干细胞增殖及其Caspase-3表达的影响。方法应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测不同浓度PROG对Aβ1～40致伤神经干细胞增殖能力的影响，Western印迹法检测PROG干预后Aβ1～40致伤的神经干细胞Caspase-3活性的变化及对致伤神经干细胞凋亡的影响。结果PROG能剂量依赖地对抗Aβ1～40致伤后引起的大鼠海马神经干细胞存活率降低。结论1 pmol/L及10 pmol/L PROG在48 h时对Aβ1～40致伤的海马神经干细胞增殖保护作用最强，10 pmol/L浓度PROG在7 d时对Aβ1～40致伤的海马神经干细胞凋亡保护作用最强。

孕酮;β-淀粉样蛋白;神经干细胞;神经毒性;阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(AD)的发病机制不完全明确，目前有多种假说提示其可能的发病原因，其中β淀粉样蛋白(Aβ)瀑布假说是较公认的〔1〕。该假说提示Aβ的生成及清除失衡是导致神经元变性及痴呆发生的始动因素〔2〕。本实验建立了Aβ1～40致伤的AD干细胞模型给予浓度梯度孕酮(PROG)，研究不同浓度PROG对AD干细胞模型存活及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1动物、主要试剂及仪器 雄性Wistar大鼠，由佳木斯大学动物中心提供；四甲基偶氮唑蓝(MTT，上海艾研生物科技有限公司)、Aβ1～40(Biosouxee公司)；二抗(进口分装)；Nestin(北京博奥森生物技术有限公司)；二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(北京中山生物技术有限公司)；β-actin多克隆抗体(Santa Cruz公司)；酶标计数仪 E1X800(BioTEK公司)；IBE2003倒置荧光显微镜(重庆光学仪器厂)。

1.2方法 取出生72 h内Wistar大鼠海马组织加入培养液(DMEM/F12 1∶1，2%B27，bFGF 20 μg/L，表皮生长因子20 μg/L)5 ml，每8天传代；行Nestin细胞免疫化学检测，Nestin 阳性细胞为神经干细胞。取第3代神经干细胞悬液，接种于96孔板，分别加入PROG终浓度为：0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 pmol/L组，孵育30 min后加入Aβ1～405 μmol/L，并设立空白对照组(培养基中加入等量的培养液)和AD模型组(Aβ1～405 μmol/L加入传代3次后的神经干细胞中)。上述各组孵育0、12、24、48、72 h、7 d各时间点行MTT法检测，在0 h、1 d、2 d、3 d、7 d、14 d、21 d时间点行Western印迹检测。

1.3MTT法 加入MTT溶液，使其培养液中的终浓度为5 mg/ml，继续培养4 h，将96孔板内的培养基弃去加入溶解液二甲基亚砜(DMSO)200 μl振荡10 min使其充分溶解结晶产物在酶标仪上以波长490 nm检测每孔的OD值。每组设3个孔，实验重复3次，取平均值。

1.4Western印迹检测海马神经干细胞Caspase-3的表达 倒去96孔板中的培养液，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗一次，每孔加入细胞裂解液100 μl，冰上孵育20 min，将细胞裂解物刮下、移入 EP 管中，4℃ 12 000 r/min离心5 min，吸取上清液转移入EP管，用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白质浓度，加入上样缓冲液，配胶，上样，电泳，半干转膜，封闭，羊抗鼠Caspase-3多克隆抗体(1∶800)4℃孵育过夜，PBS-T洗膜4次，每次15 min，加二抗(1∶2 000)，摇匀，室温孵育1.5 h，PBS-T洗膜4次，每次15 min，电化学发光(ECL)，感光胶片记录，Image J 软件分析。

1.5统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t检验及单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组细胞存活率比较 随着PROG浓度的增加，在490 nm处的吸光度也增加，反映细胞相应数目的增加，并有一定的剂量依赖性。PROG在不同时间点均可促进神经干细胞增殖，与空白对照组及其他浓度组相比，在48 h时1.00 pmol/L和10.00 pmol/L PROG促进神经干细胞增殖作用最强，但二者无明显差别(Pgt;0.05)。见表1。

2.2各组Caspase-3表达比较 各组孵育各时间点(0 h、1 d、2 d、3 d、7 d、14 d、21 d)后，与空白对照组相比，Caspase-3 活性表达逐渐增加(Plt;0.05)，且在2 d达到高峰(Plt;0.01)。与AD模型组相比，PROG组在各时间点均可降低 Caspase-3 的表达(Plt;0.05)，特别在7 d这个时间点更加明显(Plt;0.01)，且随PROG浓度增加Caspase-3下降越明显，10.00 pmol/L下降最明显，100.00 pmol/L反而轻度上升。而空白对照组在0 h、1 d、2 d、3 d、7 d、14 d、21 d Caspase-3活性未发生明显改变(Pgt;0.05)。

表1 不同浓度PROG对Aβ1～40致伤神经干细胞存活率的影响值,n=3)

与空白对照组比较：1)Plt;0.05；与AD模型组比较：2)Plt;0.05；与其他浓度其他时间点比较：3)Plt;0.05，下表同

表2 不同浓度PROG对Aβ1～40致伤海马神经干细胞Caspase-3表达的影响

3 讨 论

干细胞是具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞〔3〕。神经干细胞具有自更新能力，可以稳定增殖。本实验的空白对照组也证实了这点。Aβ聚集是AD发病的中心环节，代谢异常引起Aβ寡聚体沉积形成斑块〔4〕，导致继发炎症反应、引起氧化损伤神经细胞功能，出现神经元纤维缠结(NFTs)、轴突损伤和突触丢失等级联反应〔5〕，最终导致神经元凋亡诱发临床出现痴呆症状。Aβ是AD患者中枢神经系统免疫炎性级联反应的激活因素，异常沉积Aβ为免疫原、激活脑内胶质细胞、释放炎症介质，通过免疫炎症应答对神经元产生毒性作用〔6〕，损伤神经细胞。另外，神经系统慢性炎性反应加剧Aβ的产生和沉积，形成恶性循环和级联放大系统〔7〕。同时炎症介质及各种神经毒性物质抑制AD患者内源性神经干细胞的增殖，影响内源性神经干细胞对损伤组织的修复。

细胞凋亡是维持体内环境的稳定及机体防御功能和正常生长发育所必需的。Caspase-3是细胞凋亡的特征性标志之一。本实验提示在正常神经干细胞的发生过程中也存在凋亡，细胞凋亡参与了AD患者神经元退行性病变的过程。而PROG可以保护Aβ致伤的神经干细胞、抑制其凋亡。可能机制是PROG可降低核因子-κB及其在靶基因的表达、控制炎症作用放大、下调多种酶的基因表达、进而抑制细胞凋亡的发生。Caspase-3、Bax和AKT蛋白在创伤后被激活，这些酶类启动细胞凋亡程序〔8〕，PROG可以降低这些物质的表达，同时阻止细胞色素C激活Caspase-3，并上调抗凋亡蛋白Bcl-2等的表达。PROG可以上调创伤后抗凋亡蛋白细胞外信号调节激酶(ERK)的表达水平〔9〕。PROG可减轻氧自由基对细胞膜的破坏、抑制脂质过氧化反应。本实验验证了PROG可以下调Aβ致伤的海马神经干细胞的凋亡进程。

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3Dorn DC,Dorn A.Stem cell autotomy and niche interaction in different systems〔J〕.World J Stem Cells,2015;7(6):922-44.

4Desai P,Shete H,Adnaik R,etal.Therapeutic targets and delivery challenges for Alzheimer's disease〔J〕.World J Pharmacol,2015;4(3):236-64.

5廖 媛,官志忠.阿尔茨海默病发病机制中炎性反应的研究进展〔J〕.中国老年学杂志,2011;31(2):351-4.

6王 琦,周海霞.阿尔茨海默病中β淀粉样蛋白对星形胶质细胞的作用〔J〕.中国老年学杂志,2011;31(18):3643-6.

7董贤慧,柴锡庆.阿尔茨海默病发病机制研究进展〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(20):5906-12.

8李 林,张 兰.中药治疗阿尔茨海默病的作用特点〔J〕.生物化学与生物物理进展,2012;39(8):816-28.

9Eagon PK.Alcoholic liver injury:influence of gender and hormones〔J〕.World J Gastroenterol,2010;6(11):1377-84.

〔2016-11-04修回〕

(编辑 曹梦园)

R741.02

A

1005-9202(2017)22-5551-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.028

黑龙江省中医科研项目(2HY16-019)；牡丹江医学院科学技术研究项目ZS201521

1 牡丹江医学院附属红旗医院神经内科

毕鹏翔(1980-)，男，硕士，副主任医师，主要从事神经系统疾病研究。

肖韩艳(1981-)，女，硕士，主治医师，讲师，主要从事神经病学研究。