当归挥发油对自发性高血压大鼠ACE2基因表达的影响

伊 琳 曲 强 纪禄风 石向慧 王立红 顾远晖

(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

当归挥发油对自发性高血压大鼠ACE2基因表达的影响

伊 琳 曲 强1纪禄风 石向慧 王立红 顾远晖1

(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

目的探讨当归挥发油对自发性高血压大鼠(SHR)心肌血肌紧张素转换酶(ACE)2基因表达的影响及作用机制。方法将40只8周龄雄性SHR随机分为模型组，当归挥发油组(低、高)和卡托普利组，并以同周龄的Wistar大鼠作为正常对照组。分别灌胃4 w后，取大鼠心肌组织，HE染色观察心肌组织形态学的变化实时荧光定量PCR法检测ACE2 mRNA 表达量，Western印迹检测ACE2蛋白的表达水平。结果当归可降低SHR血压；HE染色显示，与模型组相比较，当归挥发油各组病变分别有不同程度的减轻；与模型组相比，当归高、低剂量组ACE2 mRNA及蛋白表达水平均明显升高(Plt;0.01)。结论当归挥发油对SHR血压有调节作用，可能通过ACE2基因发挥降压作用。

当归挥发油;高血压;血管紧张素转换酶(ACE)2

肾素-血管紧张素系统(RAS)过度活动是人类原发性高血压的主要发病机制之一。近年研究发现，RAS 中存在一个拮抗血管紧张素转换酶(ACE)/血管紧张素(Ang)Ⅱ/血管紧张素1受体(AT1R) 轴的平衡系统即ACE2/Ang1～7/Mas 受体轴，其中ACE2为关键基因〔1〕，在高血压的发生、发展中起重要作用。当归挥发油是当归的脂溶性成分，包含藁本内酯、正丁烯内酯、当归酮等，其中藁苯内酯含量最高。当归挥发油具有降压作用，本研究将探讨当归对ACE2基因表达的影响。

1 材料和方法

1.1动物选择与分组 40只8周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)(体重180～220 g)，SPF级,购自北京维通利华实验动物有限责任公司〔动物合格证号SCXK(京)2012-0001〕，动物检疫合格证明No.1100562901)。8只正常血压 Wistar 大鼠(体重180～220 g)，雄性，SPF级，购自甘肃中医药大学实验动物中心〔动物合格证号SYXK(甘)2011-0001〕。

1.2药物与试剂选择 当归购自甘肃省岷县，由甘肃中医药大学科研实验中心提取挥发油，采用CO2超临界萃取法；卡托普利分散片(国药准字H41025659)；高效RIPA裂解液，BCA浓度测定试剂盒，聚丙酰胺配胶试剂盒(索莱宝)；Western印迹仪(伯乐美国)，Power Lab ML125/R无创尾动脉血压器(日本)，低温摇床，低温离心机。

1.3给药方法和分组 将SHR和Wistar大鼠在SPF级实验室适应性饲养1 w后，于给药前测定各组大鼠的血压，采用Power Lab ML125/R无创血压测定分析系统测定清醒状态下鼠尾动脉收缩压，连续测定1 w，待各组大鼠适应环境后，将SHR随机分为模型组、卡托普利组、当归低剂量与高剂量组，Wistar 大鼠为对照组，每组8只。给药途径为灌胃。模型组和对照组给予生理盐水，不给任何药物。当归组、卡托普利组根据实验鼠体表面积最终确定给药剂量，当归低、高组分别每日为当归挥发油1.2、10 g/kg，卡托普组每日产卡和普利2.25 mg/kg。每周给药7 d，每天定时给药，连续4 w，随体重变化每周按时调整给药剂量。每周的第七天于同一时间测定血压，每只大鼠每次测定5次，取均值。试验期间，各组大鼠标准饮食，自由饮水。

1.4样本采集 给药4 w后，将动物禁食不禁水12 h，3%水合氯醛(避光)腹腔注射麻醉后于腹主动脉取血8 ml，3 000 r/min 离心 10 min(4℃),分离血清。将大鼠颈椎脱臼处死，开胸取出心肌组织，部分心肌组织立即置于液氮保存；另一部分心肌组织置入10%甲醛溶液中固定、脱水透明及石蜡包埋切片，HE 染色，观察血管组织形态学变化。

1.5实时荧光定量PCR检测ACE2 mRNA的表达量 按 Trizol试剂盒说明书抽取组织总RNA，按 RT-PCR 试剂盒说明书配置逆转录反应体系合成 cDNA，然后进入PCR 扩增体系，反应条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃，50 s；50个循环；72℃ 8 min；观察扩增曲线和溶解曲线，溶解曲线以单峰为佳,以β-actin 为内参基因，采用2-ΔΔCt法，按照相对表达量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=实验组 ΔCt-对照组 ΔCt，ΔCt=目的基因 Ct平均值-β-actin Ct平均值，分析各组基因的相对表达水平。

1.6Western印迹检测ACE2蛋白表达水平 各组大鼠处死后，PBS水冲洗后，取心肌组织200 mg，加500高效裂解液(含1%PSMF)冰上裂解20 min，4℃离心后得上清为总蛋白，95℃水浴锅煮10 min，同时采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，根据蛋白浓度计算上样量，随后进行免疫印迹检测。以GAPDH作为内参照，进行半定量分析，比值表示其相对含量。

1.7统计学方法 采用SPSS20.0软件，两组间比较采用t检验，多组间比较采用ANOVA方差分析，并行两两比较。

2 结 果

2.1各组用药前后血压的变化 模型组收缩压显著高于对照组(Plt;0.01);连续灌服当归挥发油，当归组(高、低)血压明显低于模型组(Plt;0.01)，卡托普利组血压低于模型组(Plt;0.01)，当归各组(高、低)内未见明显差异(Plt;0.01)。见图1。

2.2HE染色结果 心肌组织病理切片结果显示，模型组与对照组相比，心肌纤维增粗，排列较紊乱，横纹结构模糊，毛细血管比例相对减少。与模型组比较，卡托普利组肌纤维排列比较均匀，且肌纤维变细；与模型组比较，当归挥发油高剂量组横纹肌结构清晰，心肌纤维排列更加均匀且肌纤维变细。见图2。

与对照组相比：1)Plt;0.01；与模型组相比：2)Plt;0.01图1 当归挥发油对鼠尾动脉压的影响

图2 心肌组织病理切片(HE，×400)

2.3各组ACE2 mRNA表达水平比较 与模型组相比，当归挥发油低剂量组ACE2 mRNA与高剂量组表达水平均升高(Plt;0.01)。

2.4Western印迹检测ACE2蛋白表达水平 与模型组相比，ACE2蛋白表达水平在当归挥发油各组均升高(Plt;0.01)，见图3。

1～5：对照组、模型组、卡托普利组、当归挥发油低剂量组、当归挥发油高剂量组图3 Western印迹电泳结果

3 讨 论

在世界范围内，心血管疾病(CAD)位于所有疾病死亡之首位，在所有心血管疾病中，原发性高血压是最主要的危险因素。同时高血压的知晓率、治疗率、控制率均不满意，对高血压的防治仍面临严重的挑战。有关高血压发病机制的研究一直在深入进行中，原发性高血压是遗传因素和环境因素共同作用所致的复杂性疾病，其中遗传因素在EH的发病机制中的影响占30%～50%。新近研究表明，miRNA、DNA甲基化，组蛋白修饰及基因组结构变异等都有可能参与血压调节和高血压的发生〔2〕。ACE2基因位于染色体Xp22，2002 年加拿大学者 Crackower等〔3〕报道ACE2 基因定位于 X 染色体上，是高血压的候选基因之一〔4〕。Yagil等〔5〕基于对ACE2的认识首先提出了有关RAS调节血压的“两臂学说”，其中一个臂依赖于ACE的活性与AngⅡ产生，另一个臂则依赖于ACE2的活性与Ang(1～7)的生成，二者相互拮抗，共同参与血压的调节，ACE2最重要的生物学效应是降解AngⅡ生成Ang(1～7)，其中ACE2催化AngⅡ生成Ang(1～7)的效率是催化AngI生成Ang(1～9)效率的400倍。一方面，ACE2通过对AngⅡ的降解来限制它的血管收缩功能，另一方面，通过Ang(1～7)的生成拮抗AngⅡ的作用，Ang(1～7)具有扩张血管及抗纤维化的功能〔6〕。组织中ACE/ACE2的平衡失调将导致血压的改变，ACE2表达上调阻止血压升高，ACE2表达缺失导致血压升高〔7，8〕。金海燕等〔9〕的研究也发现自发高血压大鼠心脏 ACE2 基因及蛋白水平明显减低可同时伴随血压的升高。因此，RAS系统中ACE/AngⅡ/AT1R与 ACE2/Ang(1～7)/MasR轴的作用相互拮抗，后者作为内生性的反调控用途拮抗前者功能，当两者的生理不平衡达到一定程度时，就会导致一些心血管疾病如高血压的发生。当归是甘肃的道地药材，也是中药治疗高血压使用频率最高的药物之一〔10〕。现代医学通过对当归提取物发现，当归提取物通过对RASS系统、离子通道、血管神经等对高血压的发生发展起到一定的作用。本次研究再次证实当归具有降压的作用，当归挥发油对心肌组织有保护作用，当归挥发油可能会增强ACE2的活性，作用于ACE2/Ang(1～7)/MasR轴，抑制血管的收缩，拮抗ACE的作用而发挥降压的作用，下一步研究中将进一步探讨当归对ACE2/Ang(1～7)/MasR轴中其他因素的影响及对相关信号通路的作用，以明确当归对ACE2/Ang(1～7)/MasR的干预作用。

1De Mello WC.Local renin angiotensin aldosterone systems and cardiovascular diseases〔J〕.Med Clin North Am,2017;101(1):117-27.

2朱鼎良.遗传因素在原发性高血压发病中的新进展〔J〕.中国循环杂志,2012;27(2):81-2.

3Crackower MA,Sarao R,Oudit GY,etal.Angiotensin-converting enzyme 2 is an essential regulator of heart function〔J〕.Nature,2002;417(6891):822-8.

4Donoghue M,Hsieh F,Baronas E,etal.A novel angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase(ACE2)converts angiotensin Ⅰ to angiotensin 1-9〔J〕.Circ Res,2000;87(5):E1-9.

5Yagil Y,Yagil C.Hypothesis ACE2 modulates blood pressure in the mammalian organism〔J〕.Hypertension,2003;41(4):871-3.

6Tallant EA,Clark MA.Molecular mechanisms of inhibition of vascular growth by angiotensin-(1-7)〔J〕.Hypertension,2003;42(4):574-9.

7Ocaranza MP,Michea L,Chiong M,etal.Dissociating angiotensin 1-9 anticardiovascular remodeling effects from those on blood pressure〔J〕.J Hypertens,2014;32(8):1719-21.

8Ocaranza MP,Moya J,Barrientos V,etal.Angiotensin-(1-9)reverses experimental hypertension and cardiovascular damage by inhibition of the angiotensin converting enzyme/Ang Ⅱ axis〔J〕.J Hypertens,2014;32(4):771-83.

9金海燕，宋 蓓，钟久昌. ACE2 基因:高血压防治新的靶点〔J/CD〕.中华临床医师杂志:电子版，2011;5(11):5062-5.

10蔡永敏,王守富,黄谦峰,等.原发性高血压中药现代应用频次研究〔J〕.世界科学技术-中医药现代化,2014;10(3):603.

〔2016-11-15修回〕

(编辑 李相军)

TheeffectsofAngelicaonACE2geneinspontaneouslyhypertensiverats

YILin,QUQiang,JILu-Feng,etal.

GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,Gansu,China

ObjectiveTo study the influence of Angelica sinensis (oliv.) Diels on ACE2 gene in spontaneously hypertensive rats (SHR).MethodsAll the rats were divided into Angelica , model , captopril groups, weekly-old Wistar rats as normal control group, The systolic blood pressure(SBP) of the tail in different groups before and after treatment were measured .After 4 weeks, cardiac tissue of the rats were taken out, HE stain was used to observe the pathological changes of cardiac tissue, the mRNA level of ACE2 was detected by RT-PCR，the protein expression of ACE2 was tested by Western blot.ResultsAngelica reduced SBP in SHRs. Myocardial fibers of Angelica group were thinned and organized with sharply defined stripes structure. The ACE2 mRNA and protein expressions were significant increased in Angelica group (Plt;0.01).ConclusionsThe essential oil of Angelica sinensis could reduce the blood pressure through up-regulating the expression of ACE2.

Angelica; Hypertension; ACE2

R2-031

A

1005-9202(2017)22-5507-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.010

国家自然科学基金(No.81460669)；甘肃省中医药管理局项目批准号(GZK-2016-40)；甘肃省自然科学基金(No.1310RJZA084)

1 甘肃省人民医院

顾远晖(1969-)，男，主任医师，主要从事肿瘤相关的临床与基础研究。

伊 琳(1971-)，女，副教授，博士，主要从事高血压遗传学、中西医结合心血管疾病研究。