整合素连接激酶经磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路促进胃癌细胞增殖和迁移

刘文宗 何 谱 邵明亮 张 巍

(石家庄市第五医院胸腹外科，河北 石家庄 050021)

整合素连接激酶经磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路促进胃癌细胞增殖和迁移

刘文宗 何 谱 邵明亮1张 巍2

(石家庄市第五医院胸腹外科，河北 石家庄 050021)

目的探讨整合素连接激酶(ILK)对胃癌细胞增殖、侵袭的影响及相关机制。方法利用基因转染建立过表达ILK基因的HGC-27及KATO Ⅲ胃癌细胞株；细胞计数试剂(CCK)8和Transwell实验研究上调ILK基因表达对HGC-27及KATO Ⅲ细胞增殖和迁移能力的作用；Western 印迹实验检测上调ILK基因表达是否可影响HGC-27及KATOⅢ细胞Akt及p-Akt蛋白的表达。结果上调ILK基因表达可显著促进HGC-27及KATO Ⅲ细胞的增殖和迁移能力；上调ILK基因表达可明显上调HGC-27及KATO Ⅲ细胞p-Akt蛋白水平。结论ILK经磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路参与及影响胃癌细胞的致癌潜能。

胃癌；整合素连接激酶；磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路

胃癌是人类消化系统最常见的恶性肿瘤，其在所有恶性肿瘤中的发病及病死率高居第二位，仅次于肺癌〔1〕。我国是胃癌的高发区，据研究表明，仅2015年我国胃癌发病率及死亡率就分别高达679.1/10 万和498.0/10 万〔2〕。临床医治胃癌的主要手段是外科手术结合放、化疗的综合疗法，但随着人们对胃癌发病机制的不断探索，化疗联合分子靶向治疗已逐步应用于胃癌的临床治疗并取得良好疗效〔3,4〕。整合素连接激酶(ILK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其可经多条信号转导途径影响及参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等生物行为〔5～7〕。本实验通过构建上调ILK基因表达的胃癌细胞株，研究该基因对胃癌细胞恶性表型的影响及其相关机制，从而为胃癌临床诊断确立新的分子标记物，并可为胃癌治疗提供全新的分子靶点。

1 材料与方法

1.1实验用细胞及主要材料 RPMI1640 培养基(Hyclone，美国)，胎牛血清(NQBB，美国)，人胃癌细胞HGC-27及KATO Ⅲ(中国科学院细胞库，中国)，Transwell小室(Corning，美国)，兔抗ILK多克隆抗体、鼠抗增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体、兔抗蛋白激酶(PK)B单克隆抗体及兔抗磷酸化PK(p-PK)B多克隆抗体(Santa Cruz，美国)，鼠抗β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠及山羊抗兔IgG(博士德，中国)；细胞计数试剂-8(CCK-8，博士德，中国)。

1.2细胞转染实验 分别将HGC-27及KATO Ⅲ细胞培养于24孔板各孔中(1.5×105个/孔)，细胞所用培养基为含5%热灭活胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640；待细胞培养至24 h，移除培养基，加入含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640完全培养基，并向各孔中分别加入0.5 ml ILK质粒和空质粒病毒转染液；待上述细胞培养72 h后，向培养基中加入嘌呤霉素(终浓度为5 ng/μl)进行筛选；于筛选后7 d，行Wstern印迹实验以评价转染效率。

1.3细胞增殖实验 将ILK质粒和空质粒转染的HGC-27和KATOⅢ细胞按4×103个/孔均匀铺于96孔板各孔，细胞所用培养基为100 μl RPMI1640完全培养基；待细胞培养至24、48、72和96 h，向每孔中加入10 μl CCK-8试剂，然后将孔板放入37℃培养箱中孵育2 h；用酶标仪测得450 nm波长吸光度。

1.4细胞迁移实验 将ILK质粒和空质粒转染的HGC-27和KATOⅢ细胞按2×104个/室均匀铺于Transwell小室中，小室中培养基为100 μl不含血清的RPMI1640；将小室置于24孔板各孔中，各孔中的培养基为600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640；将孔板放入37℃培养箱中培养24 h；用脱脂棉签小心擦掉小室内表面未迁移过的细胞；乙醇结晶紫染色25 min，自来水冲洗、晾干后在光学显微镜下拍照并进行计数。

1.5Western印迹实验 提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度，将50 μg细胞总蛋白加入12%的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶泳道中行垂直电泳；待溴酚蓝泳动至下层胶下1/3处时，将凝胶中蛋白转印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；37℃环境下将膜置于5%脱脂奶中封闭45 min；磷酸缓冲液-吐温(PBS-T)室温洗膜5 min×4次；4℃环境下分别用ILK(1∶500)、PCNA(1∶500)、PKB(1∶500)、p-PKB和β-actin(1∶1 000)一抗对膜孵育过夜；次日用PBS-T室温洗膜5 min×4次；37℃环境下分别用HRP标记的二抗对膜孵育40 min；PBS-T室温洗膜15 min×4次；向膜上滴加增强化学发光(ECL)试剂反应1～2 min；在凝胶成像系统中曝光、拍照及计算蛋白相对表达量。

1.6统计分析 应用的统计软件SPSS19.0进行q检验。

2 结 果

2.1过表达ILK细胞的鉴定 嘌呤霉素筛选7 d后，Wstern印迹结果所示，空质粒转染HGC-27细胞(HGC-27-Control)中ILK基因表达(1.109±0.114)明显低于ILK质粒转染HGC-27细胞(HGC-27-ILK，1.970±0.105)。同样，空质粒转染KATOⅢ细胞(KATOⅢ-Control)中ILK基因表达(0.796±0.108)明显低于ILK质粒转染KATOⅢ细胞(KATOⅢ-ILK，1.763±0.255)(均Plt;0.01)，故表明成功创建了上调ILK基因表达的胃癌细胞株。见图1。

2.2过表达ILK增强胃癌细胞增殖 CCK-8实验所示，HGC-27-Control组细胞生长至48、72、96 h后其吸光度值明显低于HGC-27-ILK组(Plt;0.05)。另外，KATOⅢ-Control组细胞生长至72、96 h后其吸光度值明显低于KATOⅢ-ILK组(Plt;0.05)。这说明，上调ILK基因的表达可显著促进胃癌细胞HGC-27和KATO Ⅲ的增殖活性。见表1。

2.3过表达ILK增强胃癌细胞迁移 Transwell 实验所示，24 h后HGC-27-Control组与HGC-27-ILK组迁移的细胞数〔(51.80±3.70)个和(63.40±10.36)个〕差异显著(Plt;0.05)；KATO Ⅲ-Control组与KATO Ⅲ-ILK组迁移的细胞数〔(73.80±7.39)个和(89.40±11.10)个〕差异显著(Plt;0.05)。

2.4过表达ILK上调p-PKB表达 Western 印迹结果表明，HGC-27-Control中p-PKB基因表达(0.644±0.116)明显低于HGC-27-ILK(0.995±0.076)；KATO Ⅲ-Control组p-PKB基因表达(0.315±0.062)明显低于KATO Ⅲ-ILK组(0.759±0.105)(均Plt;0.01)。见图2。

图1 ILK稳定转染细胞的鉴定

组别24h48h72h96hHGC-27-Control组0.4628±0.03640.6598±0.04851.3458±0.09341.9457±0.0732HGC-27-ILK组0.4714±0.02720.8117±0.05841)1.4969±0.07391)2.1543±0.11321)KATOⅢ-Control组0.6350±0.05251.1431±0.04751.5674±0.04852.1330±0.0517KATOⅢ-ILK组0.6649±0.05091.1918±0.10171.6904±0.07062)2.2254±0.06082)

与HGC-27-Control比较：1)Plt;0.05；与KATO Ⅲ-Control比较：2)Plt;0.05

图2 过表达ILK上调HGC-27和KATOⅢ细胞p-PKB表达

3 讨 论

ILK是1996年Hannigan等在运用酵母双杂交技术进行整合素β1蛋白研究过程中鉴定出的具有丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶活性的细胞内蛋白质，该基因位于人类染色体的11p15.5-p15.4位置上，可编码相对分子量为36 000的功能性蛋白质〔8〕。ILK可被整合素及生长因子等信号分子经磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)依赖形式而活化，激活的ILK可使其下游分子PKB和糖原合成酶激酶(GSK)3磷酸化，从而介导来自生长因子、细胞与细胞外基质(ECM)彼此间协同刺激信号的转导过程，并最终影响细胞的生理、生化功能〔9〕。人类的一些恶性肿瘤如胃癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤等都存在ILK 基因的表达上调，并且其表达水平与肿瘤恶性进程、转移程度等临床病理参数具有明显相关性〔10〕。Oloumi等〔11〕报道，上调或活化ILK基因的肿瘤细胞具有非贴壁生长活性，并且转移、侵袭和成瘤能力显著提高。而当应用RNAi下调ILK基因表达可抑制肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭等恶性表型〔12〕。Liu等〔13〕研究表明，应用RNAi下调卵巢癌细胞ILK后，凋亡相关基因如B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的表达也被下调。由此可见，ILK还可调控细胞凋亡进程。

PKB又称Akt，它是PI3K/PKB通路的重要信号分子，PI3K/PKB通路被人们普遍认为是肿瘤细胞存活的关键信号途径，在肿瘤的恶性发展中发挥不可替代的作用。Yamamoto等〔14〕研究结肠癌发现，活化的PI3K/Akt途径可经膜型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)致使肿瘤细胞侵袭及转移能力显著增强。当应用PI3K/PKB途径靶向小干扰RNA可显著抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭〔15〕。最近的一项研究也报道了PI3K/PKB在胃癌中的重要作用，当将小RNA-196b(miR-196b)转染胃癌细胞后，细胞PI3K/PKB蛋白水平和G0/G1期比值可被上调，同时细胞的增殖、克隆形成及迁移能力也明显增强〔16〕。同样，本实验结果表明，HGC-27及KATOⅢ胃癌细胞株过表达ILK基因可显著促进其增殖和迁移能力，同时过表达细胞株的p-PKB水平也显著提高。由此表明，与上述RNA-196b实验结果一样，ILK可经PI3K/AKT途径参与胃癌发生与发展过程。该研究成果可帮助人们更深入认识胃癌的分子机制，从而可为胃癌的临床诊断和治疗提供全新的分子标记物和靶点。

1Jemal A,Bray F,Center MM,etal.Global cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin,2011;61(2):69-90．

2Chen W,Zheng R,Baade PD,etal.Cancer statistics in China,2015〔J〕.CA Cancer J Clin,2016;66(2):115-32.

3Wang J,Yang S,Cai X,etal.Berberine inhibits EGFR signaling and enhances the antitumor effects of EGFR inhibitors in gastric cancer〔J〕.Oncotarget,2016;7(46):76076-86.

4Fanotto V,Ongaro E,Rihawi K,etal.HER-2 inhibition in gastric and colorectal cancers:tangible achievements,novel acquisitions and future perspectives〔J〕.Oncotarget,2016;7(42):69060-74.

5Yan Z,Yin H,Wang R,etal.Overexpression of integrin-linked kinase (ILK) promotes migration and invasion of colorectal cancer cells by inducing epithelial-mesenchymal transition via NF-κB signaling〔J〕.Acta Histochem,2014;116(3):527-33.

6Persad S,Attwell S,Gray V,etal.Inhibition of integrin-linked kinase (ILK) suppresses activation of protein kinase B/Akt and induces cell cycle arrest and apoptosis of PTEN-mutant prostate cancer cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2000;97(7):3207-12.

7Persad S,Attwell S,Gray V,etal.Inhibition of integrin-linked kinase (ILK) suppresses activation of protein kinase B/Akt and induces cell cycle arrest and apoptosis of PTEN-mutant prostate cancer cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2000;97(7):3207-12.

8Hannigan GE,Leung-Hagesteijn C,Fitz-Gibbon L,etal.Regulation of cell adhesion and anchorage-dependent growth by a new beta1-integrin-linked protein kinase〔J〕.Nature,1996;379(6560):91-6.

9Papanikolaou S,Bravou V,Gyftopoulos K,etal.ILK expression in human basal cell carcinoma correlates with epithelial-mesenchymal transition markers and tumour invasion〔J〕.Histopathology,2010;56(6):799-809．

10Booton R,Ward T,Ashcroft L,etal.ERCC1 mRNA expression is not associated with response and survival after platinum-based chemotherapy regimens in advanced non-small cell lung cancer〔J〕.J Thorac Oncol,2007;2(10):902-6.

11Oloumi A,Mcphee T,Dedhar S.Regulation of E-cadherin expression and beta-catenin/Tcf transcriptional activity by the integrin-linked kinase〔J〕.Biochem Biophys Acta,2004;1691(1):1-15.

12Muranyi AL,Dedhar S,Hogge DE.Targeting integrin linked kinase and FMS-like tyrosine kinase-3 is cytotoxic to acute myeloid leukemia stem cells but spares normal progenitors〔J〕.Leuk Res,2010;34(10):1358-65.

13Liu Q,Xiao L,Yuan D,etal.Silencing of the integrin-linked kinase gene induces the apoptosis in ovarian carcinoma〔J〕.J Recept Signal Transduct Res,2012;32(2):120-7.

14Yamamoto H,Noura S,Okami J,etal.Overexpression of MT1-MMP is insufficient to increase experimental liver metastasis of human colon cancer cells〔J〕.Int J Mol Med,2008;22(6):757-61.

15Huang J,Zhang L,Greshock J,etal.Frequent genetic abnormalities of the PI3K/AKT pathway in primary ovarian cancer predict patient outcome〔J〕.Genes Chromosomes Cancer,2011;50(8):606-18.

16Li NA,Wang W,Xu B,etal.miR-196b regulates gastric cancer cell proliferation and invasion via PI3K/AKT/mTOR signaling pathway〔J〕.Oncol Lett,2016;11(3):1745-9.

〔2016-11-13修回〕

(编辑 王一涵)

R735.2

A

1005-9202(2017)22-5536-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.021

黑龙江省卫生厅科研课题(2013326)

1 介入医学科 2 研究中心

张 巍(1976-)，女，副主任医师，医学博士，主要从事肿瘤早期诊断研究。

刘文宗(1982-)，男，主治医师，医学硕士，主要从事普外科疾病诊治研究。