转化生长因子β1对老年心房颤动患者内皮细胞向间质成纤维细胞转化的影响

葛卫力 米亚非 朱 敏 陆抑非 李 涛 江建军

(温州医科大学附属台州医院心内科，浙江 台州 317000)

转化生长因子β1对老年心房颤动患者内皮细胞向间质成纤维细胞转化的影响

葛卫力 米亚非 朱 敏1陆抑非 李 涛 江建军

(温州医科大学附属台州医院心内科，浙江 台州 317000)

目的探讨转化生长因子(TGF)β1对老年心房颤动患者内皮细胞向间质成纤维细胞转化的影响。方法选择老年阵发性心房颤动患者100例及持续性心房颤动患者100例，分离循环血内皮细胞，将其分为对照组〔加入等量磷酸盐缓冲液(PBS)培养〕和TGF-β1组(加入TGF-β1 10 ng/ml培养)。采用MTT实验测定细胞增殖，transwell实验测定细胞迁移，免疫荧光染色观察CD31和vimentin表达，Western印迹法测定CD31、vimentin、ve-cadherin和α-平滑肌肌动蛋白(SMA)含量。结果TGF-β1组吸光度A值明显低于对照组(Plt;0.05)，穿膜细胞数高于对照组(Plt;0.05)。免疫荧光染色显示：和对照组比较，TGF-β1组间质细胞特异性蛋白vimentin表达明显升高、内皮细胞特异性蛋白CD31表达明显降低；对照组含极少vimentin和CD31双阳性细胞，TGF-β1组vimentin和CD31双阳性细胞明显增多。Western印迹检测结果显示，TGF-β1组CD31和ve-cadherin明显低于对照组(Plt;0.05)，间质细胞标志性蛋白vimentin和α-SMA明显高于对照组(Plt;0.05)。结论TGF-β1可诱导老年心房颤动患者内皮细胞向间质化细胞转化。

心房颤动；内皮细胞；转化生长因子β1；心肌纤维化

心房颤动是最常见的心律失常类型，在老年人中多见，多数心房颤动患者早期呈阵发性，随着疾病的发展，最后转化为持续性心房颤动，心房颤动增加脑卒中和死亡的危险。和非心房颤动患者比较，心房颤动患者的心房组织纤维化和胶原增生更严重〔1〕，成纤维细胞增殖并分泌胶原蛋白是心肌纤维化和心肌重构的基础。心房颤动患者存在内皮系统功能异常，在间质纤维化过程中，内皮细胞-间质成纤维细胞转化发挥重要作用〔2～4〕。本文观察转化生长因子(TGF)β1对老年心房颤动患者内皮细胞向间质成纤维细胞转化的影响。

1 材料与方法

1.1材料及主要试剂 选择温州医科大学附属台州医院2013年1月至2014年12月70岁以上老年心房颤动患者200例，包括阵发性心房颤动患者100例和持续性心房颤动患者100例，并选择性别、年龄相匹配的健康体检者100例作为对照组。所有入选者签署知情同意书，经我院伦理委员会审批。排除标准：资料不全者、慢性阻塞性肺疾病者、起搏器携带者、曾行心房颤动消融治疗者，合并中重度瓣膜疾病者，原发性甲状腺功能亢进或减退者，3个月内有心肌病、心肌炎、急性冠状动脉综合征、心肌梗死史者，恶性肿瘤者，糖尿病、高血压、高脂血症和动脉粥样硬化，近期服用激素或抗炎药物者，近期有感染史或手术外伤史者。主要试剂：Dylight荧光二抗、Hochest33342、鼠抗人CD31抗体、兔抗人vimentin抗体、兔抗人ve-cadherin抗体、鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(SMA)(武汉博士德生物工程有限公司)等。

1.2研究方法 心房颤动组抽取入院第2天空腹外周静脉血。循环血内皮细胞分离和鉴定：将3 ml抗凝循环血用Hanks稀释1倍，经Percon密度梯度离心法分离并收集细胞，移至细胞培养瓶中培养，待细胞达80%左右融合时进行传代培养，取第4代细胞进行实验。鉴定：在24孔板上制细胞爬片，封闭后加入兔抗人血管性血友病因子(vWF)相关抗原过夜孵育，加入Hochest33342核染，加入Dylight荧光二抗孵育，显微镜下观察。细胞分组：将细胞分为对照组和TGF-β1组，TGF-β1组加入TGF-β1 10 ng/ml，对照组加入等量PBS液。细胞增殖实验：将两组细胞接种到96孔板中(每孔1×105个细胞)，每组设7个复孔，培养12 h、饥饿24 h，加入TGF-β1或PBS液继续培养48 h，加入MTT试剂放置2.5 h，酶标仪测量490 nm吸光度A值。细胞迁移实验：将两组细胞接种到24孔板中(每孔5×104个细胞)，每组设7个复孔，培养12 h、饥饿24 h，加入TGF-β1或PBS液继续培养48 h，胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，在transwell小室上室加入细胞悬液100 μl，下室加入含FBS培养基，培育24 h后多聚甲醛固定，结晶紫染色后计数穿膜细胞数。免疫荧光染色：在24孔板上制细胞爬片，每组设7个复孔，培养48 h后固定封闭，加入vWF、CD31、vimentin、ve-cadherin、α-SMA一抗过夜孵育，加入Hochest 33342核染，加入荧光二抗孵育，荧光显微镜下观察单染情况；免疫荧光双染步骤和单染步骤相同，一抗为CD31和vimentin混合一抗。两组细胞CD31、vimentin、ve-cadherin和α-SMA蛋白测定：提取两组细胞蛋白质，采用Western印迹测定CD31、vimentin、ve-cadherin和α-SMA蛋白含量，以β-actin为内参照。Gelpre32分析软件对各蛋白灰度值进行分析，蛋白相对表达量为目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1光镜下细胞形态学变化及鉴定 光镜下内皮细胞边界清楚，呈多边形，为集落式生长(见图1)，TGF-β1诱导48 h后，细胞间隙增大，向边界迁移扩散，部分细胞形态变为梭形。第4代内皮细胞vWF相关抗原阳性率为(0.08±0.02)%。

图1 各组内皮细胞呈集落样生长(DAB，×200)

2.2两组细胞增殖和细胞迁移结果比较 TGF-β1组吸光度A值显著低于对照组(t=24.132，P=0.000)，穿膜细胞数显著高于对照组(t=37.745，P=0.000)。见表1。

表1 两组细胞增殖和细胞迁移结果比较

2.3免疫荧光实验结果 CD31和vimentin单染结果显示：培养48 h后，和对照组比较，TGF-β1组间质细胞特异性蛋白vimentin表达升高、内皮细胞特异性蛋白CD31表达降低；双染结果显示：对照组含极少vimentin和CD31双阳性细胞，而TGF-β1组vimentin和CD31双阳性细胞明显增多。见图2。

图2 细胞免疫荧光标记鉴定CD31、vimentin双阳性的内皮细胞(×400)

2.4两组细胞CD31、vimentin、ve-cadherin和α-SMA蛋白表达比较 TGF-β1组内皮细胞特异性标志蛋白CD31和ve-cadherin明显低于对照组，间质细胞标志性蛋白vimentin和α-SMA明显高于对照组(Plt;0.05)。见表2。

表2 两组CD31、vimentin、ve-cadherin和α-SMA蛋白表达比较

3 讨 论

代谢性疾病患者具有内皮功能不全的特点，内皮功能不全人群心房颤动的发生率增加〔5，6〕，研究发现代谢综合征患者和正常人群相比心房颤动的发生率高，和非糖尿病患者比较，糖尿病患者心房颤动的发生率增加〔7〕。心功能越差内皮功能不全越明显，心房颤动的发生率随着心功能的恶化而逐渐升高，他汀类药物具有改善内皮功能的作用，有心房颤动病史的阵发性心房颤动、心脏外科手术、急性冠脉综合征的患者给予他汀类药物治疗可降低心房颤动的发生风险〔8〕。正常情况下，血液中很少有内皮细胞脱落，当内皮收到损伤时内皮细胞脱落下来，使血液中内皮细胞数量增加，vWF为内皮损伤和功能障碍标志物，在心房颤动患者左心耳中的表达增加〔9～11〕。本研究显示老年心房颤动患者存在内皮细胞损伤，细胞间通过一系列机制互相激活、损伤，使vWF、E-选择素、细胞间黏附分子(ICAM)-1表达增加，使大量血小板和白细胞黏附在血管内皮，形成恶性循环。

炎症反应和心房纤维化在心房颤动的发生发展中发挥重要作用，TGF-β1作为多效性炎性因子，参与心房纤维化过程，TGF-β1在生理性和病理性过度修复过程中产生过量细胞外基质，从而导致纤维化的发生，是胶原蛋白和细胞外基质沉积和合成的始动因子，可诱导肺成纤维细胞、肝成纤维细胞的迁移〔12，13〕。内皮细胞-间质细胞转化和多种间质纤维化有关的疾病有关，传统观点认为纤维化的成纤维细胞来自胚胎期间质细胞，最近研究显示在肾脏纤维化模型中，纤维化除了局部成纤维细胞增殖外，另一部分重要来源为内皮细胞转化来的成纤维细胞，TGF-β1诱导的内皮细胞-间质细胞转化在糖尿病肾脏纤维化的发展中发挥促进作用〔14〕。心内膜的内皮细胞通过内皮细胞-间质细胞转化成为房室间隔、房室垫、瓣膜的间充质细胞，TGF-β1调节这一过程，内皮细胞转化为心肌成纤维细胞称为心肌纤维化的重要环节〔15，16〕。本研究发现TGF-β1诱导内皮细胞向间质细胞转化，促进细胞增殖和迁移。可见，老年心房颤动患者血清TGF-β1水平增加，从而诱导内皮细胞向间质细胞转化，启动心房间质纤维化，从而在心房颤动的发生中发挥重要作用。改善内皮系统功能，阻止TGF-β1诱导的内皮细胞-间质细胞转化可预防老年心房颤动的发生。

1王延梅，陈才旺，曲德军，等.华法林对老年心房颤动患者内皮功能及凝血系统的作用〔J〕.中国临床研究，2013；26(2)：113-5.

2van Brakel TJ，van der Krieken T，Westra SW，etal.Fibrosis and electrophysiological characteristics of the atrial appendage in patients with atrial fibrillation and structural heart disease〔J〕.J Interv Card Electrophysiol，2013；38(2)：85-93.

3Fukui A，Takahashi N，Nakada C，etal.Role of leptin signaling in the pathogenesis of angiotensin Ⅱ-mediated atrial fibrosis and fibrillation〔J〕.Circ Arrhythm Electrophysiol，2013；6(2)：402-9.

4Liu C，Fu H，Li J，etal.Hyperglycemia aggravates atrial interstitial fibrosis，ionic remodeling and vulnerability to atrial fibrillation in diabetic rabbits〔J〕.Anadolu Kardiyol Derg，2012；12(7)：543-50.

5Polovina M，Potpara T，Giga V，etal.Impaired endothelial function in lone atrial fibrillation〔J〕.Vojnosanit Pregl，2013；70(10)：908-14.

6Jesel L，Arentz T，Herrera-Siklody C，etal.Do atrial differences in endothelial damage，leukocyte and platelet activation，or tissue factor activity contribute to chamber-specific thrombogenic status in patients with atrial fibrillation〔J〕?J Cardiovasc Electrophysiol，2014；25(3)：266-70.

7石茂静，董 蕾，刘 浩，等.糖尿病与非糖尿病患者发生心律失常类型和危险因素分析〔J〕.中国心脏起搏与心电生理杂志，2012；26(5)：410-2.

8Fang WT，Li HJ，Zhang H，etal.The role of statin therapy in the prevention of atrial fibrillation：a meta-analysis of randomized controlled trials〔J〕.Br J Clin Pharmacol，2012；74(5)：744-56.

9Freynhofer MK，Gruber SC，Bruno V，etal.Prognostic value of plasma von Willebrand factor and its cleaving protease ADAMTS13 in patients with atrial fibrillation〔J〕.Int J Cardiol，2013；168(1)：317-25.

10毛 山，胡学宁.缬沙坦对中老年高血压伴永久性房颤患者的临床疗效及内皮、炎症因子的影响〔J〕.海南医学院学报，2014；20(10)：1346-8.

11Scridon A，Girerd N，Rugeri L，etal.Progressive endothelial damage revealed by multilevel von Willebrand factor plasma concentrations in atrial fibrillation patients〔J〕.Europace，2013；15(11)：1562-6.

12Krafft E，Lybaert P，Roels E，etal.Transforming growth factor beta 1 activation，storage，and signaling pathways in idiopathic pulmonary fibrosis in dogs〔J〕.J Vet Intern Med，2014；28(6)：1666-75.

13Xu L，Li LC，Zhao P，etal.Total polysaccharide of Yupingfeng protects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis via inhibiting transforming growth factor-β1-mediated type Ⅰ collagen abnormal deposition in rats〔J〕.J Pharm Pharmacol，2014；66(12)：1786-95.

14Ghosh AK，Nagpal V，Covington JW，etal.Molecular basis of cardiac endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT)：differential expression of microRNAs during EndMT〔J〕.Cell Signal，2012；24(5)：1031-6.

15Nagalingam RS，Sundaresan NR，Noor M，etal.Deficiency of cardiomyocyte-specific microRNA-378 contributes to the development of cardiacfibrosis involving a transforming growth factor β (TGFβ1)-dependent paracrine mechanism〔J〕.J Biol Chem，2014；289(39)：27199-214.

16Docherty NG，Murphy M，Martin F，etal.Targeting cellular drivers and counter-regulators of hyperglycaemia-and transforming growth factor-β1-associated profibrotic responses in diabetic kidney disease〔J〕.Exp Physiol，2014；99(9)：1154-62.

〔2016-08-19修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R541.7+5

A

1005-9202(2017)22-5509-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.011

浙江省医药卫生科技计划项目(2017KY164)

1 温州医科大学附属台州医院医学研究中心

江建军(1965-)，男，硕士，主任医师，主要从事冠心病介入治疗研究。

葛卫力(1981-)，男，硕士，主治医师，主要从事心房颤动发病机制研究。